专利名称：一种含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株及其用于制备菊粉外切酶的方法
技术领域：
本发明属于遗传工程和发酵工程领域，具体涉及含有菊粉酶基因的鹰嘴豆克鲁维酵母基因工程菌株，以及用该基因工程菌株制备菊粉外切酶的方法。
背景技术：
菊粉(Inulinase)(Edelman，J.and T.G.Jefford.1964.The metabolismof fructose polymers in plants.4.Beta-fructofuranosidases of tubers ofHelianthus tuberosus L.Biochem.J 93148-161)，又称菊糖，分布在菊科、龙胆科、桔梗科等植物中，特别是菊芋的块茎中含量丰富。菊粉是由6-60个呋喃构形的D-果糖经β-2，1-糖苷键脱水聚合，两端再各连接一个分子葡萄糖而形成的多聚物。菊粉外切酶(2，1-β-D-fructan fructanohydrolase EC3.2.1.7)能水解β-2，1-D-果聚糖果糖糖苷键，将菊粉水解成单糖。
菊粉酶在以下方面有重要的应用前景。第一方面，是高果糖浆的制备。高果糖浆是理想的天然甜味剂，果糖的甜度比蔗糖高出80％；它在肝脏中磷酸化后能直接进入三羧酸循环，不像葡萄糖那样受到胰岛素的控制，也能适合糖尿病人食用，有望成为替代蔗糖的新一代甜味剂。同时还具有营养保健功能，能调节肠胃、提高免疫力、排毒养颜、降解血糖和抗癌等等，被称为第三代功能食品。传统的高果糖浆的制备是以淀粉为原料，在淀粉酶的作用下水解成葡萄糖，再在异构酶的作用下将葡萄糖异构成果糖，这种方式生产的高果糖浆中果糖的含量不足50％，并且果糖和葡萄糖分离难，成本高；新型的生物酶法生产高果糖浆，是以菊粉为原料，一步生物酶反应，即可获得果糖含量高于90％的高果糖浆，工艺简单，产量高。但高活性的菊粉酶是制备高果糖浆的关键。第二方面，是生物能源领域的应用。目前，生物乙醇的生产主要是以玉米淀粉为原料，原料的种植面临与人用粮食争夺土地的尴尬。菊芋的主要成分菊粉，它的生长条件粗狂，种植可不占用耕地，不仅能生长盐碱地，还能生长在荒漠地区，能防止土地沙化，以菊粉为原料生产生物乙醇可以成为目前淀粉乙醇的补充和后备方法。菊粉在菊粉酶的作用下，水解成单糖，能直接被酵母利用，产生乙醇。因此，菊粉酶的生产成本直接影响了菊粉乙醇的成本，是用菊粉做原料制备乙醇的关键。
菊粉酶来源非常广泛，据不完全统计，产菊粉酶的有丝状真菌17个属50余种，酵母菌10个属20余种，细菌12个属10余种(Pandey，A.，C.R.Soccol，P.Selvakumar，V.T.Soccol，N.Krieger，and J.D.Fontana.1999.Recentdevelopments in microbial inulinases.Its production，properties，andindustrial applications.Appl.Biochem.Biotechnol.8135-52)。但具有生产价值的菊粉酶的生产，一般选用驯化过的菊粉酶产生菌，如曲霉、克鲁维酵母等；也可以通过基因工程菌的方法。后者因经过基因工程改造，使菊粉酶的产量更高，因此更具竞争性。但目前已经报道的基因工程菌生产的菊粉酶，主要是用嗜甲醇的毕赤酵母表达系统生产(王建华，王明华等，2004，一种外切菊粉酶的生产方法，中国发明专利CN1495252A)，这种制备菊粉酶的方法，需要甲醇诱导表达，生产出的菊粉酶在制备食品级高果糖浆的应用中受到限制；另一方面，这种制备方法，发酵原料成分复杂，发酵时间长，发酵产生的酶产量依然低下，使得生产菊粉酶的成本较高。
发明内容
本发明的目的之一是获得一种组成型表达的菊粉外切酶鹰嘴豆克鲁维酵母基因工程菌株，从而避免在发酵过程中在培养基中添加甲醇，并降低生产成本。
本发明的另一个目的就是获得一种由所述基因工程菌发酵生产菊粉酶的方法。
本发明提供了一种含有菊粉外切酶(即菊粉酶，NCBI登陆号为AF178979)基因序列的基因工程菌株，即采用基因工程方法将菊粉外切酶基因克隆到真核表达载体pUKDS上，并转化鹰嘴豆克鲁维酵母Y179U(CCTCC NoM202031)，从而构建获得组成型表达的菊粉外切酶克鲁维酵母基因工程菌株。
本发明所采用的表达载体pUKDS中，PINU菊粉酶启动子；SINU菊粉酶分泌信号肽；TINU菊粉酶终止子，KD1克鲁维酵母自主复制序列；pUK19大肠杆菌自主复制序列，KcURA3鹰嘴豆克鲁维酵母URA3序列。
本发明的含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株在制备过程中，首先，设计引物克隆得到菊粉外切酶基因序列；然后，将该菊粉外切酶基因序列克隆到pUKDS上，获得pUKDS-INU；最后，转化鹰嘴豆克鲁维酵母Y179U即得。其中，例如大肠杆菌培养、感受态细胞的制备以及转化等基因工程操作均为常规方法，可以参照《分子克隆实验指南》(J.Sambrook，et al.，第二版，1996)。
另一方面，本发明提供了一种制备菊粉外切酶的方法，即取上述含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株在常温常压下发酵即得。具体而言，可以取上述含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株在28-32℃发酵2-8天，然后去除菌体，即得；发酵液初始菌浓度为OD600＝0.2-1.6；发酵液pH值为5.5-8.0；发酵液中含有0.5-2％(质量体积百分比)的酵母粉和浓度不低于2％(质量体积百分比)的碳源。
OD600表示菌体浓度，是用分光光度计(UNIC7200，上海仪器有限公司)600nm处测定获得的光密度(Optical Density)来表示。
发酵可以采用常规发酵方式和设备，例如发酵罐发酵，摇瓶发酵，等等。发酵的时间、温度等条件可以随发酵方式和设备的改变而改变。例如，本发明可以采用摇瓶发酵方式，摇床转速180-250rpm，发酵时间为3-4天。
本发明的制备菊粉外切酶的方法中，发酵液pH值可以为6.0-6.5。测pH值可以采用pH试纸、pH计等常规方法。
本发明的制备菊粉外切酶的方法中，发酵压强可以为常压。
本发明的制备菊粉外切酶的方法中，发酵液初始菌浓度较好为OD600＝0.6-0.8。
本发明的制备菊粉外切酶的方法中，碳源可以是菊粉或者葡萄糖等。如果采用菊粉作为碳源，菊粉浓度较好为4％-6％，质量体积比。如果采用葡萄糖作为碳源，葡萄糖浓度较好为2％-4％，质量体积比。
具体而言，本发明的制备菊粉外切酶的方法可以包括以下步骤(1)克鲁维酵母的培养及转化生长在固体YEPD(1％酵母浸出物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂粉)培养基上的鹰嘴豆克鲁维酵母Y179U，接种到液体YEPD中，30℃培养24小时，参照《酵母遗传学方法实验指南》(A.Adams，et al.，2000)制备感受态细胞，用LiAc的方法转化表达质粒pUKDS-INU，并涂布在SD固体培养基(0.67％YNB，2％葡萄糖，2％琼脂)上，30℃培养2-3天，挑选转化子，用摇瓶发酵方法筛选、分析具有高水平表达菊粉酶基因的转化子。
(2)摇瓶发酵筛选方法转化子接种在液体SD培养基中，30℃，220rpm摇床培养24小时，转接液体YEPD培养基，30℃，220rpm摇床培养3天，用SDS-Page分析，并菊粉酶活性检测。
(3)摇瓶发酵基本条件是使用发酵基础培养基，葡萄糖4％，酵母粉1％，在250ml的发酵摇瓶中装25ml发酵基础培养基，220rpm，培养3天。发酵液中的菌体密度直接在600nm测定OD值(OD600)；发酵液用5000rpm离心10分钟，上清液用于测定菊粉酶活性。
(4)菊粉酶活性的检测菊粉酶活性单位(u)定义为每分钟水解产生1微摩尔果糖所需要的酶量。本发明测定菊粉酶活性的方法为经过适当稀释的发酵上清液，加入到含有5％菊粉(亿利公司生物技术有限公司)的HAc-NaAc缓冲液pH4.6中，60℃反应10分钟，沸水灭活5分钟，用DNS方法在分光光度仪520nm测定还原糖的量，根据果糖标准曲线计算出酶解反应体系中还原糖的含量及酶活。
用本发明的方法生产的菊粉外切酶，活性可达2500u/ml以上，发酵产量高，发酵周期短，发酵成本低，适用于推广至大规模工业化生产。
图1为用于转化鹰嘴豆克鲁维酵母、含有菊粉酶基因的表达载体pUKDS-INU结构示意图。其中，PINU菊粉酶启动子；SINU菊粉酶分泌信号肽；INU菊粉外切酶编码基因；TINU菊粉酶终止子，KD1克鲁维酵母自主复制序列；pUK19大肠杆菌自主复制序列，KcURA3鹰嘴豆克鲁维酵母URA3序列。
图2为发酵时间对基因工程菌生长及产菊粉酶的影响图。
图3为接种量对基因工程菌生长及产菊粉酶的影响图。
图4为发酵液PH对基因工程菌生长及产酶的影响图。
图5为菊粉浓度对基因工程菌生长及产酶的影响图。
图6为葡萄糖浓度(5％菊粉存在时)对基因工程菌生长及产酶的影响图。
图7为酵母粉浓度对基因工程菌生长及产酶的影响图。
图8为蛋白胨浓度(1％酵母粉存在时)对基因工程菌生长及产酶的影响图。
图9为鹰嘴豆克鲁维酵母基因工程菌制备的菊粉酶酶解反应温度影响图。
图10为鹰嘴豆克鲁维酵母基因工程菌制备的菊粉酶酶解反应PH影响图。
具体实施例方式
实施例1菊粉酶鹰嘴豆克鲁维酵母基因工程菌的构建根据NCBI数据库中报道的菊粉酶基因(AF178979)，设计以下引物INU-Bcl-For5’-TCAGTGATCAATTACAAGAGAGACGGTGAC-3’(引入酶切位点BclI)；INU-Hind-Rev5’-GAGAAGCTTTCAAAGGTTAAATTGGGTAAC-3’(引入酶切位点HindIII)。PCR反应条件为94℃，5min，一个循环；94℃60s，60℃60s，72℃90s，三十个循环；最后72℃再延长10min。PCR产物胶回收，克隆到pMD18T载体上，获得pMD18T-INU，测序分析获得与NCBI报道一致的菊粉酶基因。用标准分子克隆的方法，将菊粉酶基因克隆到表达载体pUKDS上，获得pUKDS-INU，转化鹰嘴豆克鲁维酵母Y179U(CCTCC NoM202031)，获得菊粉酶克鲁维酵母基因工程菌Y179U/pUKDS-INU。附图1是含有菊粉酶基因的表达质粒pUKDS-INU，菊粉酶基因的表达是在鹰嘴豆克鲁维酵母中菊粉酶的启动子、分泌信号肽和终止子的控制下组成型分泌表达。
实施例2制备菊粉外切酶制备过程如下(1)克鲁维酵母的培养及转化生长在固体YEPD(1％酵母浸出物，2％蛋白胨，2％葡萄糖，2％琼脂粉)培养基上的鹰嘴豆克鲁维酵母Y179U，接种到液体YEPD中，30℃培养24小时，参照《酵母遗传学方法实验指南》(A.Adams，et al.，2000)制备感受态细胞，用LiAc的方法转化表达质粒pUKDS-INU，并涂布在SD固体培养基(0.67％YNB，2％葡萄糖，2％琼脂)上，30℃培养2-3天，挑选转化子，用摇瓶发酵方法筛选、分析具有高水平表达菊粉酶基因的转化子。
(2)摇瓶发酵筛选方法转化子接种在液体SD培养基中，30℃，220rpm摇床培养24小时，转接液体YEPD培养基，30℃，220rpm摇床培养3天，用SDS-Page分析，并菊粉酶活性检测。
(3)摇瓶发酵基本条件是使用发酵基础培养基，葡萄糖4％，酵母粉1％，在250ml的发酵摇瓶中装25ml发酵基础培养基，220rpm，培养3天。发酵液中的菌体密度直接在600nm测定OD值(OD600)；发酵液用5000rpm离心(HimacCR22E，HITACHI)10分钟，上清液用于测定菊粉酶活性。
实施例3接种量对基因工程菌生长及产酶的影响在基本发酵条件下，优选发酵初始的菌体密度对基因工程菌生长及产酶的影响。在25ml的发酵液中，接种种子液的菌体量OD600分别为5，10，15，20，30，40，相当于初始发酵液菌体密度是0.2，0.4，0.6，0.8，1.2，1.6。附图3表明，25ml发酵液的初始菌浓为OD6000.6-0.8时，可获得较高的酶活和较快的生长。
实施例4发酵液PH对基因工程菌生长及产酶的影响在基本发酵条件下，用50mM浓度的Na2HPO4-KH2PO4配制不同pH(5.5，6.0，7.0，7.5，8.0)的发酵培养基，优选发酵液pH对基因工程菌生长及产酶的影响。见附图4，pH6.0-6.5为菌体生长和产酶理想条件。
实施例5不同碳源及含量对基因工程菌生长及产酶的影响考虑到所用克鲁维酵母表达系统选用了菊粉酶的启动子和分泌信号肽，本发明检测了菊粉酶作为唯一碳源时不同浓度对基因工程菌生长和产酶的影响。发酵培养基中的氮源选用1％酵母粉，菊粉的浓度分别是3，4，5，6％。见附图5，在菊粉浓度为5％时，菌的生长和产酶最佳，菌密度可达440D600，菊粉酶活力2594u/ml。
在此基础上，本发明分析了添加不同浓度的葡萄糖是否对基因工程菌的生长和产酶有利。见附图6，在以1％酵母粉为氮源，以5％菊粉为碳源的发酵培养基中，分别添加2，3，4，5，6％的葡萄糖，尽管添加葡萄糖有助于菌体密度的提高(OD600可达57)，但是并没有提高产酶量。因此，菊粉可以作为唯一的碳源，不需要添加葡萄糖，降低了生产成本。
实施例6不同氮源及含量对基因工程菌生长及产酶的影响在5％菊粉为碳源时，本发明分析了不同浓度的酵母粉(0，0.5，1，1.5，2％)对菌生长和产酶的影响。见附图7，1％的酵母粉较好。在此基础上，本发明进一步分析了添加不同浓度的蛋白胨(1，2，3，4％)对菌生长和产酶的影响。见附图8，少量蛋白胨的添加(1％)有助于菌体的生长，但是不利于产酶；同时，SDS-Page分析也发现，蛋白胨的存在增加了发酵上清液中杂蛋白的含量，不利于下游目的蛋白的纯化。因此，在1％酵母粉为氮源时，不需要再添加蛋白胨。
实施例7发酵时间对基因工程菌生长及产酶的影响在基本发酵条件下，优选不同发酵时间24，36，48，60，72，84，96小时，对基因工程菌生长及产酶的影响。见附图2，发酵3天(72小时)菊粉酶的活性达到最高，基因工程菌在48小时基本完成生长，进入稳定期。
实施例8取上述含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株在常温常压下发酵3-4天，然后去除菌体，离心收集发酵上清液。发酵液初始菌浓度为OD600＝0.6-0.8；发酵液pH值为6.0-6.5；发酵液中含有0.5-2％(质量体积百分比)的酵母粉和浓度46％(质量体积百分比)的菊粉。
在上述条件下，多次重复，发酵上清液酶活分别为3404u/ml，2893u/ml，2594u/ml，2516u/ml，3843u/ml等，发酵上清液酶活在2500u/ml以上，最高为3843u/ml。用氟林酚方法测定蛋白浓度后，计算获得发酵上清液的菊粉酶比活为1141u/mg，纯化后的菊粉酶的纯度高于90％，比活达到4439u/mg。进一步，直接用发酵上清液(菊粉酶含量超过80％)分析鹰嘴豆克鲁维酵母基因工程菌制备菊粉酶的特性。见附图9和附图10，菊粉酶水解菊粉的最适温度是60℃，反应的最适pH低于4.2。
权利要求
1.一种含有菊粉外切酶基因序列的基因工程菌株，其特征是，采用分子生物学方法将菊粉外切酶基因克隆到真核表达载体pUKDS上，并转化鹰嘴豆克鲁维酵母Y179U，即得。
2.一种制备菊粉外切酶的方法，其特征是，取权利要求1所述的基因工程菌株在28-32℃条件下发酵2-8天，然后去除菌体，即得；发酵液初始菌浓度为OD600＝0.2-1.6；发酵液pH值为5.5-8.0；发酵液中含有质量体积比为0.5-2％的酵母粉和质量体积比不低于2％的碳源。
3.如权利要求2所述的方法，其特征是，采用摇瓶发酵方式，发酵时间为3-4天。
4.如权利要求2所述的方法，其特征是，发酵液pH值为6.0-6.5。
5.如权利要求2所述的方法，其特征是，发酵压强为常压。
6.如权利要求2所述的方法，其特征是，发酵液初始菌浓度为OD600＝0.6-0.8。
7.如权利要求2所述的方法，其特征是，碳源为菊粉或者葡萄糖。
8.如权利要求7所述的方法，其特征是，菊粉的浓度为4％-6％的质量体积比。
9.如权利要求7所述的方法，其特征是，葡萄糖的浓度为2％-4％的质量体积比。
全文摘要
本发明属于遗传工程和发酵工程领域。本发明将菊粉外切酶基因克隆到真核表达载体pUKDS上，并转化鹰嘴豆克鲁维酵母Y179U，形成表达菊粉外切酶的克鲁维酵母基因工程菌株。发酵时，取上述基因工程菌株在常温常压下发酵2－8天，然后去除菌体，即得；发酵液初始菌浓度为OD
文档编号C12N9/24GK101063089SQ20071004039
公开日2007年10月31日 申请日期2007年4月30日 优先权日2007年4月30日
发明者吕红, 李育阳, 袁汉英 申请人:复旦大学