突变的植物乳杆菌d-乳酸脱氢酶及其基因、重组酶和应用的制作方法

专利名称：：突变的植物乳杆菌d-乳酸脱氢酶及其基因、重组酶和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物工程领域，涉及一种突变的植物乳杆菌(Z^^&"7/M/7/朋加"附)D-乳酸脱氢酶(PLDHMut)及其基因和重组酶，包括该PLDHMut基因的表达载体及制备其重组酶的方法及其基因工程菌株，以及该PLDHMut及其重组酶在立体选择性催化手性化合物(R型)合成中的应用。
背景技术：
：使用D-乳酸脱氢酶(EC1丄1.28)催化羰基化合物加氢的功能，在NADH作为电子供体的条件下，可用于制备手性羟基酸。美国专利(US5098841)筛cerev&z'ae、X7oecA:erasp.2201、Sacc/7aram少cescerevfs/ae禾口//ara^ww/a/x^mo^/za，利用微生物的细胞粗提物催化2-氧代-4-苯基丁酸(OPBA)合成R-2-羟基4-苯基丁酸(R-HPBA)，但是反应时间长，转化率和光学纯度都不能让人满意。美国专利(US5098841)报道，使用几种来源于lacto/wc"/附/e/c/zmaww//、丄ewcomtoc附esewfera/ifes禾口iStojo/^/ococcwsej!zV/e/7mVfe商品"f七的乳酸脱氢酶合成R-HPBA，但是专利中酶催化时间过长(3-7天)，所用商业酶来源有限、成本高，不利于工业化生产。美国专利(US6033882)报道，德氏乳杆菌(丄actoZacz7/ws6fe你n^cA7'f)ssp.Bulgaricus来源的D-乳酸脱氢酶用于手性催化OPBA生成R-HPBA,反应时间24小时，转化率为92%，e.e.值>98%。但上述专利中报道的现有酶反应时间过长，难以工业化应用。HayaoTaguchi等报道通过构建基因文库的方法获得植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶(PLDH)基因，并连接到pKUM载体上，转化构建D-乳酸脱氢酶表达工程菌。得到的工程菌经IPTG诱导表达，可溶性蛋白中大约4%为D-乳酸脱氢酶。诱导表达后的工程菌经DEAE-celluloseDE32(Whatman)、AMP-Sepharose、MonoQHR5/5纯化后得到纯化的重组D-乳酸脱氢酶(HayaoTaguchiandTakahisaOhta.D-LactateDehydrogenaseIsaMemberoftheD-Isomer-specific2-HydroxyacidDehydrogenaseFamily.TheJournalofBiologicalChemistry,Vol.266，No.l9，IssueofMy5，pp.12588-12594,1991)。这种方法构建的工程菌蛋白表达量低，纯化方法繁琐，不利于工业化生产。而且乳酸脱氢酶普遍存在底物范围狭窄的缺点，如果底物侧链长度比丁酸酯长，酶的活性会大大降低(立体选择性生物催化，化学工业出版社，p737，2004)。因此需要筛选新的D-乳酸脱氢酶缩短反应时间，提高产物转化率和光学纯。同时应用基因工程方法将D-乳酸脱氢酶基因克隆到大肠杆菌中，过量表达，可以得到大量高纯度的重组D-乳酸脱氢酶，满足工业化需要。
发明内容本发明要解决的技术问题即是提供一种适用于工业化催化手性化合物(R型)合成的D-乳酸脱氢酶——突变的植物乳杆菌(Z^"o^"7/"s;/^^"m)D-乳酸脱氢酶(PLDHMut)及其基因和重组酶，包括该PLDHMut基因的表达载体及制备其重组酶的方法及其基因工程菌株，以及该PLDHMut及其重组酶在立体选择性催化手性化合物(R型)合成中的应用。本发明人即为了解决上述课题，通过筛选大量的乳杆菌，同时考虑到乳酸脱氢酶底物范围狭窄的缺点，选择植物乳杆菌(丄actok^7/wp/awton/w)的D-乳酸脱氢酶(PLDH)，并借鉴ChizukaTokuda等报道(CWzukaTokuda，YoshiroIshikura,MayuShigematsu.JournalofBacteriology:Aug.2003，5023-5026)在戊糖乳杆菌aa"okc!7/船pewtos船)D-乳酸脱氢酶的Tyr(酪氨酸)52突变成Leu(亮氨酸)后，D-乳酸脱氢酶的活性和底物范围显著提高的经验，对PLDH基因采用现有基因工程技术进行类似定点突变。进一步为了实现重组酶的高表达以及达到简化重组酶纯化过程的目的，本发明应用基因工程方法进行改造，选择合适的质粒和大肠杆菌宿主构建了高密度表达该PLDH突变体的大肠杆菌工程菌。令人惊奇地是，该PLDH点突变体及其重组酶用于催化OPBA合成R-HPBA，反应时间短，转化率可达100%、光学纯度e.e.值〉99X，适于工业化生产。因此，本发明突变的植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶(PLDHMut)，其氨基酸序列由现有植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶氨基酸序列中第52位的酪氨酸残基替换成亮氨酸残基，可如序列表中SEQIDNo.2所示。相应地，PLDH自的基因可具有任何编码由该氨基酸序列组成的蛋白质的核苷酸序列。所述PLDHMut基因的核苷酸序列可商业合成，也可以将PCR扩增得到的PLDH基因进行定点突变制得。本发明根据植物乳杆菌(丄""o^c///^p/^ton^)D型乳酸脱氢酶的基因序列，设计PCR引物，从植物乳杆菌中克隆得到D-乳酸脱氢酶基因。植物乳杆菌购自中国普通微生物菌种保藏中心(菌种号1.0003)。根据《分子克隆实验指南》第三版所述方法制备植物乳杆菌染色体DNA。植物乳杆菌乳酸脱氢酶基因序列来源于GeneBank，原始编号D90339。将PCR扩增得到的PLDH基因连接到pMD18-T载体。转化感受态DH5a细胞。将转化后的细胞涂布含有X-gal、IPTG和Amp的常规琼脂平板，培养过夜。从平板上挑取阳性菌落培养。抽提质粒，用限制性内切酶iVcoI和^zoI酶切鉴定，得到质粒PLDHpMD18-T。为提高植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶的活性并拓宽底物范围，根据现有技术(ChizukaTokuda,YoshiroIshikura,MayuShigematsu.JournalofBacteriology:Aug.2003,5023-5026)在克隆得到的基因Tyr52引入Leu突变。突变引入是通过质粒PLDHpMD18-T使用TaKaRaMutanBESTKit，并设计合成变异导入引物和对应PCR引物，获得点突变的PLDHMutpMD18-T质粒。PLDHMut基因测序结果见序列表中SEQIDNo.l所示，PLDH基因序列上154-156位碱基由TAC突变为CTG。通过对比分析，与干酪乳杆菌(丄acatoZac/〃M;scase/)乳酸脱氢酶基因禾B德氏乳杆菌(丄acato6ac/〃w^/6n^c^)乳酸脱氢酶基因同源性分别为55.9%和53.9%。将PLDHMutpMD18-T质粒用限制性内切酶脸oI和屈oI酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收lkb片段。pET28b(+)质粒用限制性内切酶7VcoI和屈oI酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收5kb片段。用LigationMix连接PLDH自酶切片段和pET28b(+)酶切片段，转化DH5a感受态细胞。筛选阳性菌落，抽提质粒，用限制性内切酶脸oI和WoI酶切鉴定，获得PLDHMutpET28b(+)质粒。将PLDHMutpET28b(+)质粒转化大肠埃希氏菌(Esc/^n'c/n'aco/z')BL21(DE3)感受态细胞。挑取阳性菌落，获得PLDHMut表达基因工程菌PLDHMutpET28b(+)BL21(DE3)。接种培养上述基因工程菌PLDHMutpET28b(+)BL21(DE3)以获得重组的PLDHMut。其中使用HisTrapFF亲和层析柱进行纯化，即可得到纯化的PLDHMut，产量高。本发明使用的植物乳杆菌来源的D-乳酸脱氢酶基因通过基因工程的方法引入突变，酶活力和底物范围得到提高和拓宽，在工业化的手性化合物制备中具有明显的优势；通过将基因克隆到大肠杆菌构建高密度表达工程菌过量表达目的蛋白，可以大量制备乳酸脱氢酶，使得酶源的大规模生产和纯化成本大幅降低；由于重组酶经过基因改造后，可以方便地利用一步亲和层析分离纯化，得到高纯度酶，纯化方法简便。另一方面，现有技术中乳酸脱氢酶在催化羰基化合物加氢过程中需要NADH提供电子，为使NADH能够再生，促使反应正常进行，在酶催化反应体系中添加甲酸脱氢酶、甲酸盐和NADH，甲酸脱氢酶可以催化甲酸盐生成二氧化碳，同时将电子传递给NAD+，生成NADH，促使辅酶再生。FormateDehydrogenase本发明PLDHMut用于立体选择性催化手性化合物(R型)合成，特别是催化OPBA合成R-HPBA:按常规将含有OPBA、NADH、FDH、甲酸钠的底物进行催化，反应时间短，只需4小时，转化率100%;取反应液用HC1调pH至2，用乙酸乙酯萃取，用手性柱KromasilKR100-5CHI-TBB250x4.6mmE1154检测，结果表明产物为R构型HPBA，e.e.值〉99M。说明纯化酶表现出更高的立体选择性。图1为本发明表达载体PLDHMutpET28b(+)构建图。图2为本发明重组质粒PLDHpMD18-T7VcoI禾卩ioI双酶切鉴定电泳图。图3为本发明重组质粒PLDHMutpMD18-TA^0I和^7zoI双酶切鉴定电泳图。图4为本发明表达载体PLDHMutpET28b(+)iVcoI和屈oI双酶切鉴定电泳图。图5为本发明基因工程重组菌PLDHMutpET28b(+)BL21(DE3)蛋白质表达电泳图。具体实施例方式下面用实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。其中，实施例中使用的主要试剂和试剂盒ExTaq、Wcol、屈ol、MutanBESTKit、pMD18-TVector均购自TaKaRa公司，PCR引物和UNIQ-10柱式DNA胶回收试剂盒购自上海生工生物工程公司，高感受态大肠埃希氏菌(Esc/2eWcWflco")DH5a细菌细胞和高感受态大肠埃希氏菌(五sc/zeWc/n'aco/Z)BL21(DE3)细菌细胞购自北京博大泰克生物基因技术有限责任公司，DNA测序由上海鼎安生物科技有限公司完成。使用的主要仪器EppendorfMastercyclerfradientAG22331;复日科技FR-200紫外与可见光分析装置；WatersMillennium32System。使用的其它试剂均为分析纯。实施例1植物乳杆菌乳酸脱氢酶(PLDH)基因获得和PLDHpMD18-T质粒构建植物乳杆菌(丄actotec///1^//a"tarww)购自中国普通微生物菌种保藏中心(菌种号1.0003)。根据《分子克隆实验指南》第三版所述方法制备植物乳杆菌染色体DNA。植物乳杆菌乳酸脱氢酶基因序列来源于GeneBank,原始编号D90339。根据基因序列设计正向PCR引物(Fp):CCATGGGCAAAATTATTGCATATG(如序列表中SEQIDNo.3所示，下划线所示为WcolK切位点)和反向PCR引物(Bp):eiC^ASGTCAAACTTAACTTGCGT(如序列表中SEQIDNo.4所示，下划线所示为ATzoI酶切位点)。PCR反应按如下体系进行ExTaq(5U/pl)10xbuffer(Mg2+)dNTPMix(5mM)染色体DNAFp(20pM)Bp(20阔ddH2037^1PCR反应按如下程序进行97°C5min暂停程序，加入ExTaq1^194°。变性30sec52。C退火30sec72t:延伸lmin重复循环30次72°。保温10minPCR产物乙醇沉淀后经琼脂糖凝胶电泳纯化，回收目的条带，得到PCR产物。使用TaKaRapMDl8-TVector试剂盒将PCR产物连接到pMDl8-T载体。反应体系如下pMD18-TVectorPCR产物4^1LigationMix5(ol16。C反应30min。将连接产物转化感受态DH5ct细胞，转化后的细胞涂布含有X-gal、IPTG和Amp的常规琼脂平板，培养过夜。从平板上挑取白色菌落接种于5mlLB培养基培养过夜。抽提质粒，用限制性内切酶iVcoI和WoI酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定电泳图如图2所示。得到质粒PLDHpMD18-T。实施例2PLDH点突变和PLDHMutpMDl8-T质粒构建为进一步提高乳酸脱氢酶对OPBA的催化活性，在克隆得到的PLDH氨基酸序列Tyr52引入Leu突变(ChizukaTokuda,YoshiroIshikura，MayuShigematsu.JournalofBacteriology:Aug.2003，5023-5026)。突变引入使用TaKaRaMutanBESTKit试剂盒。设计合成变异导入引物(Primer1):^!^CAGCAAAAGGACTATACTGCTG(如序列表中SEQIDNo.5所示，下划线所示为突变位点)和对应PCR引物(Primer2)，如序列表中SEQIDNo.6所示TACATCGGCACCGTCGAAA。PCR反应按如下体系进行配制以下组成的PCR反应液(Total50pl)。10xPyrobestBuffer5juldNTPMixture(各2.5mM)4^1Primer1(20)l|alPrimer2(20)PLDHpMD18-TO.O卜lngPyrobestDNAPolymerase(5U/(il)0.25pidH20upto50(J按下列反应条件进行PCR反应。94°C30sec55°C30sec72°C5min重复循环30次对PCR反应液进行1%Agarose凝胶电泳。切胶回收目的DNA片段。BluntingKination反应按如下方法进行在微量离心管内配制下列反应液。DNAFragment约lpmol1OxBluntingKinationBuffer2|_ilBluntingKinationEnzymeMix1jj!dH20upto20|_il37t:反应10分钟。反应液用灭菌蒸馏水定量至100pl。加入lOOpl(等量)的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，充分混匀。离心，取上层(水相)移至另一微量离心管中。加入100pl(等量)的氯仿/异戊斷24:1)，充分混匀。离心，取上层(水相)移至另一微量离心管中。加入1(^1(1/10)的3MCH3COONa(pH5.2)。加入250W(2.5倍量)的冷无水乙醇，-20。C放置3060分钟。离心回收沉淀，用70%的冷乙醇清洗沉淀，真空干燥。用20pl的TEbuffer溶解沉淀。Ligation反应方法如下取约0.25pmol(5pl)上述TE溶液于新的微量离心管中。加入5pl的LigationSolutionI，均匀混合。16。C反应1小时。反应液全量转化至10(^1的DH5a感受态细胞中。将转化后的DH5a细胞涂布含Amp的琼脂平板，培养过夜。挑选阳性菌落接种于5mlLB培养基培养过夜。抽提质粒，用限制性内切酶脸0I和屈oI酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定，鉴定电泳图如图3所示。得到PLDHMutpMD18-T质粒。本发明D-乳酸脱氢酶DNA片段经过测序，其核苷酸序列如序列表中SEQIDNo.l所示，其编码的相应的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2所示。通过对比分析，与干酪乳杆菌(/^^0^"7/^0^)乳酸脱氢酶基因和德氏乳杆菌(Z^cato6fl"7/wA/6n^db7)乳酸脱氢酶基因同源性分别为55.9%和53.9%。实施例3PLDHMutpET28b(+)质粒构建将实施例2中的PLDHMutpMD18-T质粒用限制性内切酶ioI和I酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收lkb片段。pET28b(+)质粒用限制性内切酶A^I和屈oI酶切后，琼脂糖凝胶电泳回收5kb片段。用LigationMix连接PLDHMut酶切片段和pET28b(+)酶切片段，反应体系同实施例1。转化DH5a感受态细胞。将转化后的DH5a感受态细胞涂布于含卡那霉素(Kn)的琼脂平板，培养过夜。挑选阳性菌落接种于5mlLB培养基培养过夜。抽提质粒，用限制性内切酶iV"I和^0i酶切鉴定，鉴定电泳图如图4所示。得到PLDHMutpET28b(+)质粒。显然，也可商业合成序列表中SEQIDNo.l所示的PLDHM"t核苷酸序歹iJ，再直接连接入pET28b(+)中构建上述表达质粒。其构建过程如图1所示。实施例4PLDHMutpET28b(+)大肠杆菌工程菌的构建将实施例3制得的PLDHMutpET28b(+)质粒转化大肠埃希氏菌(￡"/^/^'^0//)81^21(0￡3)感受态细胞。将转化后的BL21(DE3)感受态细胞涂布于含Kn的琼脂平板，培养过夜。挑取阳性菌落，接种于5mlLB培养基培养过夜。获得表达PLDHMut的基因工程菌PLDHMutpET28b(+)BL21(DE3)。实施例5PLDHMut表达和纯化将实施例4中的基因工程菌PLDHMutpET28b(+)BL21(DE3)接种于含250mlLB培养基的摇瓶，37°C培养至OD值为1，加入终浓度50mM的IPTG，28'C诱导培养过夜。收获菌体，4000rpm冷冻离心30min收集菌体。称取5g湿菌体，用30ml含有0.5MNaCl的20mmo1磷酸盐缓冲液(pH7.4)重悬。加入适量溶菌酶，37'C保温30min，用超声波细胞粉碎机超声破壁。将破壁液12000rpm冷冻离心30min，收集上清液，用25pm超滤膜过滤。用5个柱体积的蒸馏水冲洗HisTrapFF亲和层析柱(Amersham)，流速lml/min。然后用5个柱体积的Bindingbuffer(20mmo1磷酸盐缓冲液，0.5MNaCl，30mM咪唑，pH7.4)平衡亲和层析柱，流速lml/min。将上述过滤后的细胞上清液缓慢过柱，流速0.4ml/min。再用Bindingbuffer冲洗亲和层析柱至监测器基线平稳。用5个柱体积Elutionbuffer(20mmo1磷酸盐缓冲液，0.5MNaCl，500mM咪唑，pH7.4)洗脱，收集蛋白峰。得到纯化后的PLDHMut。构建的基因工程菌PLDHMutpET28b(+)BL21(DE3)蛋白质表达电泳图如图5所示。电泳图显示，目的蛋白的表达量可占菌体蛋白总表达量的30%以上。实施例6PLDHMut催化OPBA手性合成HPBA将实施例5制得的PLDH自催化OPBA生成HPBA反应体系如下OPBA(50mM)400^1NADH(100mM)lOOplFDH(6U/mg)20|il甲酸钠(162mM)100^1PLDHMut(8.8U/ml)200^1ddH20uptol000pl其中，1单位PLDHMut的活力定义为在如下条件下每分钟氧化lmmolNADH所需的酶量67mM磷酸钾缓冲液，0.49mM丙酮酸，0.098mMNADH，pH7.4。将上述反应液37。C水浴震荡4h。取反应液用乙腈10倍稀释，磷酸调pH至2，12000rpm离心取上清。WatersHPLCC18柱检测(流动相乙腈水体积比=3:7，0.2%磷酸调pH3.6)，检测结果显示底物转化率为100%。取反应液用HC1调pH至2，用乙酸乙酯萃取，用手性柱KromasilKR100-5Cffl-TBB250x4.6mmE1154检测，结果表明产物为R构型HPBA，e.e.值〉99%。直接用含重组乳酸脱氢酶的大肠杆菌进行相同的反应，R-HPBA的e.e.为96%，说明纯化酶表现出更高的立体选择性。序列表<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>AspAsnLeuAspValProThrValLysAlaArgGlyLeuAsnlieSer859095aacgtacctgcatacteaccaaatgcgattgetgetattateagtaacg336AsnValProAlaTyrSerProAsnAlalieAlaGluLeuSerValThr100105110caattgatgcaattattacgtcaaaccccattgttcaacaagaagtta384GinLeuMetGinLeuLeuArgGinThrProLeuPheAsnLysLysLeu115120125getaagcaagacttccgttgggcaccagatattgccaaggaattaaac432AlaLysGinAspPheArgTrpAlaProAsplieAlaLysGluLeuAsn130135140accatgactgttggtgttateggtactggteggattggccgtgetgcc480ThrMetThrValGlyVallieGlyThrGlyArglieGlyArgAlaAla145150155160ategatattttcaaaggcttcggcgetaaggttateggttacgatgtt528lieAspliePheLysGlyPheGlyAlaLysVallieGlyTyrAspVal165170175taceggaatgetgaacttgaaaaggaaggcatgtacgttgacaccttg576TyrArgAsnAlaGluLeuGluLysGluGlyMetTyrValAspThrLeu180185190gacgaattatacgcccaagetgatgttateacgttacacgttcctgca624AspGluLeuTyrAlaGinAlaAspVallieThrLeuHisValProAla195200205ttgaaggataactaccacatgttgaatgcggatgccttcageaagatg672LeuLysAspAsnTyrHisMetLeuAsnAlaAspAlaPheSerLysMet210215220aaagatggcgcctacatettgaactttgetcgtgggacaetcategat720LysAspGlyAlaTyrlieLeuAsnPheAlaArgGlyThrLeulieAsp225230235240teaggagacttgateaaagccttagacagtggcaaagttgccggtgcc768SerGlyAspLeulieLysAlaLeuAspSerGlyLysValAlaGlyAla245250255getcttgatacgtatgaatacgaaactaagatettcaacaaagacctt816AlaLeuAspThrTyrGluTyrGluThrLysliePheAsnLysAspLeu260265270gaaggtcaaacgattgatgacaaggtcttcatgaacttgttcaaccgc864GluGlyGinThrlieAspAspLysValPheMetAsnLeuPheAsnArg275280285gacaatgttttgattacaccacatacggetttctacactgaaactgcc912AspAsnValLeulieThrProHisThrAlaPheTyrThrGluThrAla290295300gttcacaacatggtgcacgttteaatgaacagtaacaaacaattcate%0ValHisAsnMetValHisValSerMetAsnSerAsnLysGinPhelie305gaaactggtGluThrGly310315aaagetgacacgcaagttaagtttLysAlaAspThrGinValLysPhegacAsp<210>2<211>332<212>PRT<213>植物孚L杆菌(Zac/o6flc/〃ws//"wtora附)<400>2MetLyslielieAlaTyrAlaValArgAspAspGluArgProPhePhe151015AspThrTrpMetLysGluAsnProAspValGluValLysLeuValPro202530GluLeuLeuThrGluAspAsnValAspLeuAlaLysGlyPheAspGly354045AlaAspVaJLeuGinGinLysAspTyrThrAlaGluValLeuAsnLys505560LeuAlaAspGluGlyValLysAsnlieSerLeuArgAsnValGlyVal65707580AspAsnLeuAspValProThrValLysAlaArgGlyLeuAsnlieSer859095AsnValProAlaTyrSerProAsnAlalieAlaGluLeuSerValThr100105110GinLeuMetGinLeuLeuArgGinThrProLeuPheAsnLysLysLeu115120125AlaLysGinAspPheArgTrpAlaProAsplieAlaLysGluLeuAsn130135140ThrMetThrValGlyVallieGlyThrGlyArglieGlyArgAlaAla145150155160lieAspliePheLysGlyPheGlyAlaLysVallieGlyTyrA印Val165170175TyrArgAsnAlaGluLeuGluLysGluGlyMetTyrValAspThrLeu180185190AspGluUuTyrAlaGinAlaAspVallieThrLeuHisValProAla195200205LeuLysAspAsnTyrHisMetLeuAsnAlaAspAlaPheSerLysMet210215220LysAspGlyAlaTyrlieLeuAsnPheAlaArgGlyThrLeulieAsp225230235240SerGlyAspLeulieLysAlaLeuAspSerGlyLysValAlaGlyAlaAlaLeuAspGluGlyGin275AspAsnVal290ValHisA.sn305GluThrGly245ThrTyr260ThrlieLeulieMetValLysAla325GluAspThrHis310Asp250TyrGluThrLys265AspLysValPhe280ProHisThrAla295ValSerMetAsnThrGinValLys330255liePheAsnLysAspLeu270MetAsnLeuPheAsnArg285PheTyrThrGluThrAla300SerAsnLysGinPhelie315320PheAsp<210>3<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220><223〉引物<400>3ccatgggcaaaattattgcatatg24<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220><223>引物<400>4ctcgaggtcaaacttaacttgcgt24<210>5<211>25<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220><223>引物<400>5ctgcagcaaaaggactatactgctg<210>6<211>19<212>DNA<213>人工序列(Artificial)<220><223>引物<400>6tacatcggcaccgtcgaaa权利要求1、一种突变的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)D-乳酸脱氢酶，其氨基酸序列由现有植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶氨基酸序列中第52位的酪氨酸残基替换成亮氨酸残基，如序列表中SEQIDNo.2所示。2、一种突变的植物乳杆菌(Z^cto6a"7/w//awton/w)D-乳酸脱氢酶基因，是下列核苷酸序列之一1)其具有序列表中SEQIDNo.l所示的碱基序列；2)编码由序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质。3、包括权利要求2所述的突变的D-乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列的表达载体。4、根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于其由下列方法制得将植物乳杆菌D-乳酸脱氢酶基因的核苷酸序列扩增，与质粒pMD18-T连接，得到载体PLDHpMD18-T，再对PLDHpMD18-T中的D-乳酸脱氢酶基因进行定点突变，使所述D-乳酸脱氢酶第52位的酪氨酸突变为亮氨酸，形成含有如权利要求2所述的突变的D-乳酸脱氢酶基因的载体PLDHMutpMD18-T，将PLDHMutpMD18-T和质粒pET28b(+)分别经7Vco/和屈o/双酶切后连接得到表达质粒PLDHMutpET28b(+)。5、一种用于表达权利要求1所述的突变的D-乳酸脱氢酶的基因工程菌株，其是将权利要求3或4所述的表达载体转化到大肠埃希氏菌Ew//B丄"(DE3)中得到的基因工程菌株PLDHMutpET28b(+)BL21(DE3)。6、一种制备重组的突变的植物乳杆菌(丄"cto6"c/〃M//朋toram)D-乳酸脱氢酶的方法，其包括用权利要求3或4所述的表达载体转化宿主细胞，培养转化体，获得重组的突变的D-乳酸脱氢酶。7、如权利要求6所述的方法，其特征在于该转化体为如权利要求5所述的基因工程菌株。8、根据权利要求6所述的方法制得的重组的突变的植物乳杆菌(Z^cto6ac〃/wsp/awfa阳m)D-乳酸脱氢酶。9、如权利要求1所述的突变的植物乳杆菌(丄a"o6acz7/^//a"torwm)D-乳酸脱氢酶在立体选择性催化R型手性化合物合成中的应用。10、如权利要求9所述的应用，其特征在于所述的立体选择性催化R型手性化合物合成是指催化2-氧代-4-苯基丁酸合成R-2-羟基-4-苯基丁酸。全文摘要本发明公开了一种突变的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)D-乳酸脱氢酶(PLDH^Mut)，其氨基酸序列由现有D-乳酸脱氢酶(PLDH)的Tyr52点突变为Leu而成；提供了该PLDH^Mut的基因，以及含有该基因的表达载体和基因工程菌株。本发明还提供了制备该重组的PLDH^Mut的方法，该重组酶产量高。本发明PLDH^Mut及其重组酶可用于催化2-氧代-4-苯基丁酸合成R-2-羟基-4-苯基丁酸，反应时间短，转化率可达100％、光学纯度＞99％，适于工业化生产。文档编号C12N9/04GK101302503SQ20071004041公开日2008年11月12日申请日期2007年5月8日优先权日2007年5月8日发明者栋奕,陈少欣申请人:上海医药工业研究院