专利名称：：高拷贝表达重组乙肝表面抗原的毕赤酵母及其制法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明涉及生物工程和免疫领域，具体而言涉及一种表达乙肝表面抗原的酵母细胞、用于转化酵母细胞的构建物以及它们的构建方法。
背景技术：
：乙型肝炎是由3型肝炎病毒(HBV)引起的一种严重的世界范围内危害人类健康的疾病。据统计，世界上大约有3.5亿HBV慢性携带者。每年大约有100万人死于HBV引起的疾病。在我国每10人中就有一人携带乙肝表面抗原(HBsAg)，目前全国约有1.2亿人是乙肝病毒携带者，现患乙肝2800万，现患率为2770/10万，累计现行和既往的，中国有一半以上的人口经受HBV感染，占全世界肝炎的80%。而且三分之一的人会演变成慢性肝炎、肝硬化或肝癌，世界卫生组织(WHO)已把乙型肝炎列为世界第九死因。HBsAg阳性是HBV感染的主要特征，可以作为乙肝诊断的依据。HBsAg本身可以自行装配成22nm类病毒颗粒，具有与天然病毒相近的抗原表位，可以刺激机体产生保护性中和抗体，可以预防HBV感染，HBsAg已作为疫苗在国内外上市。接种HBsAg疫苗的费用已成为当前乙肝免疫预防中的最大障碍。只有大幅度降低疫苗的生产成本，并能提供充足的疫苗，才能实现全民免疫接种，有效地减少乙肝的留下，最终消灭乙肝。目前HBsAg生产主要有两种方式。一种是采用血源乙肝疫苗原料制备疫苗，但由于血源价格昂贵、供应量有限、采集困难等制约因素，此类疫苗的产量和成本极大地受到限制。另一种是利用基因重组微生物细胞表达HBsAg，这种方法原料易得、价廉，其适宜大规模生产，并能降低成本。例如利用来自美国默克公司的DNA重组技术构建的HBsAg酵母菌种来制备HBsAg疫苗，其酵母表达量约为20mg/L发酵液。在重组蛋白表达领域，要获得高表达量的表达载体取决于众多因素。例如所表达蛋白质的性质、所采用的表达方式有关、所釆用的表达盒中的各元件、表达盒中各元件的组合方式、高拷贝克隆中各拷贝的排列方式等。因此，目前，本领域仍然迫切需要开发出成本更低廉、步骤更简便、表达量更高的HBsAg生产方法。目前，本领域仍然迫切需要开发出成本更低廉、步骤更简便、表达量更高的HBsAg生产方法。
发明内容本发明的目的正是提供一种稳定高表达乙肝表面抗原的酵母细胞及其制备方法，以提高作为乙肝预防疫苗的酵母重组乙肝表面抗原的表达量及产量。在本发明的第一方面，提供了一种表达乙肝表面抗原的酵母细胞。所述酵母细胞的染色体中整合有表达乙肝表面抗原的构建物，所述构建物含有2-15个串联排列的乙肝表面抗原表达盒，每个所述乙肝表面抗原表达盒包括以下元件(a)起始信号元件AOX;(b)乙肝表面抗原基因；和(c)终止信号元件AOX(TT);并且所述酵母细胞在甲醇诱导下表达乙肝表面抗原，表达量至少为30rag/L，如30500mg/L发酵液，并且所述的乙肝表面抗原在所述酵母中自行装配成类病毒颗粒。在本发明优选实施方式中，所述酵母细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母或汉逊酵母。在本发明的一个优选例中，所述酵母细胞为毕赤酵母。在本发明的一个优选例中，优选GS115菌株、SMD1163菌株，更优选为GS115菌株。在本发明另一优选实施方式中，所述构建物是以pPIC3.5K质粒为基础构建的，且乙肝表面抗原基因包含SEQIDNO:l所示的序列。在本发明的一个优选例中，所述构建物中含有3-12个，更优选4-10个，最优选5-8个串联排列的乙肝表面抗原表达盒。在本发明另一优选实施方式中，在所述乙肝表面抗原类病毒颗粒具有与天然病毒相近的抗原表位，且能剌激哺乳动物免疫系统产生保护性中和抗体。在本发明的一个优选例中，所表达的乙肝表面抗原的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。在本发明的另一个优选例中，所述乙肝表面抗原的表达量为40450mg/L发酵液，较优选为50400mg/L发酵液，更优选为60350mg/L发酵液。在本发明的第二方面中，提供了一种制备乙肝表面抗原类病毒颗粒的方法，所述方法包括步骤(i)在适合表达的条件下，培养本发明的表达乙肝表面抗原的酵母细胞，从而表达乙肝表面抗原；和(ii)从培养物中分离出乙肝表面抗原类病毒颗粒。在本发明的一个优选例中，所述乙肝表面抗原类病毒颗粒是由本发明的酵母细胞所表达的乙肝表面抗原自行装配形成，且具有与天然病毒接近的抗原表位。在本发明的第三方面中，提供了一种乙肝表面抗原类病毒颗粒，所述类病毒颗粒是通过前述方法制备的。在本发明的第四方面中，提供了前述类病毒颗粒的用途，其可用于制备预防或治疗乙肝的疫苗组合物。在本发明的第五方面中，提供了一种构建物，所述构建物含有2-15个串联排列的乙肝表面抗原表达盒，每个所述乙肝表面抗原表达盒包括以下元件(a)起始信号元件AOX;(b)乙肝表面抗原基因；(c)终止信号元件AOX(TT)。在本发明的一个优选例中，所述构建物中含有3-12个，更优选4-10个，最优选5-8个串联排列的乙肝表面抗原表达盒。在本发明的另一优选例中，所述构建物中的(b)乙肝表面抗原基因包含SEQIDNO:1所示的序列。在本发明的第六方面中，提供了一种构建前述构建物的方法，所述方法包括(1)将乙肝表面抗原基因定点插入包含起始信号元件AOX和终止信号元件AOX(TT)的质粒中，以获得单拷贝表达质粒；(2)对所述单拷贝表达质粒进行改造以获得完整的乙肝表面抗原表达盒，其中，所述表达盒包含.-(a)起始信号元件AOX;(b)乙肝表面抗原基因；(c)终止信号元件AOX(TT);(3)将所述乙肝表面抗原表达盒重复插入所述质粒中，从而获得含有2-15个串联排列的乙肝表面抗原表达盒的构建物。在本发明的一个优选例中，在所述构建物中含有3-12个，更优选4-10个，最优选5-8个串联排列的乙肝表面抗原表达盒。在本发明的另一优选例中，所述包含起始信号元件AOX和终止信号元件AOX(TT)的质粒选自:pPIC3.5(K)质粒、pA0815或pHIL-D2。在本发明的另一优选例中，所述乙肝表面抗原基因包含SEQIDNO:1所示的核苷酸序列。在本发明的另一优选例中，步骤(2)中对所述单拷贝表达质粒进行改造是通过PCR进行的。在另一优选例中，步骤(3)中将所述乙肝表面抗原表达盒重复插入所述质粒中是通过同尾酶定点插入进行的。在本发明的另一优选例中，所述方法还包括用大肠杆菌扩增所得的构建物。在本发明的第七方面，提供了制备前述表达乙肝表面抗原的酵母细胞的方法，所述方法包括步骤用本发明的构建物转化酵母细胞，使所述的构建物整合入酵母染色体中，从而获得本发明的表达乙肝表面抗原的酵母细胞。在本发明的二个优选例中，所述转化是通过电转化、原生质体转化进行的。在另一优选例中，所述方法还包括用甲醇诱导所述酵母细胞表达乙肝表面抗原的步骤。图l所示为单拷贝表达质粒图示。图2所示为经改造后的单拷贝表达质粒图示。图3所示为多拷贝数质粒经双酶切或单酶切鉴定的琼脂糖电泳图。图4所示为酵母破碎液的SDS-PAGE电泳及蛋白质印迹图。图5所示为酵母破碎液的电镜图。具体实施例方式本发明的发明人经过长期而深入的研究发现，筛选了大量由不同元件构成的表达盒，获得了可高效表达乙肝表面抗原的表达盒。该乙肝表面抗原表达盒(尤其是串联排列的表达盒)，可使得该酵母细胞高表达具有免疫活性的乙肝表面抗原。此外，本发明还用分子生物学遗传重组的方法获得整合有表达乙肝表面抗原的构建物的酵母细胞，且所述构建物含有2-15个串联排列的乙肝表面抗原表达盒。本发明人在此基础上，完成了本发明。具体而言，在本发明中通过如下方法构建了多个具有确定拷贝数的酵母重组乙肝表面抗原表达克隆利用常规分子生物学方法或市售获得乙肝表面抗原HBsAg基因，将该HBsAg基因插入酵母胞内表达质粒pPIC3.5K，通过PCR突变改造质粒的酶切位点，酶切获得完整表达元件。利用同尾酶将表达元件重复插入质粒，获得高拷贝数表达质粒，并使其在酵母表达系统中表达。表达产物经电镜证实存HBsAg颗粒。SDS-PAGE、蛋白质印迹法和ELISA分析鉴定了HBsAg颗粒的表达量与特异性，并通过ELISA证实表达量随拷贝数的增高而提高。发明人还用本发明的HBsAg类病毒颗粒对小鼠进行了免疫，证实了本发明的可在动物体内有效诱导免疫应答。酵母重组乙肝表面抗原疫苗在国内外均已上市销售，例如利用来自美国默克公司的DNA重组技术构建的HBsAg酵母菌种来制备HBsAg疫苗，其酵母表达量约为20mg/L发酵液，而本发明所构建的高拷贝数表达克隆的表达量至少为30rag/L发酵液，例如30500mg/L发酵液，因此可用于提高产量、降低成本。乙肝表面抗原(冊sAg)如本文所用，术语"乙肝表面抗原"、"HBsAg"可互换使用，均指包含本发明SEQIDN0:2所示的氨基酸序列，且可诱导机体产生保护性中和抗体，以预防HBV感染的抗原。在本发明的一个实施方式中，所述的乙肝表面抗原是天然存在于乙肝患者体内的抗原，是乙肝病毒HBV感染的主要特征之一。如本文所用，术语"乙肝表面抗原基因"、"HBsAg基因"可互换使用，均指包含本发明SEQIDN0:1所示的序列，且可表达产生本发明的乙肝表面抗原的核苷酸序列。在本发明的一个实施方式中，可通过常规分子生物学方法获得所述的乙肝表面抗原基因，所述方法可按照常规条件如Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress，1989)中所述的条件进行。乙肝表面抗原表达盒及其制备如本文所用，术语"乙肝表面抗原表达盒"是指通过本发明方法获得的具有以下元件的表达盒(a)起始信号元件AOX;(b)乙肝表面抗原基因；(c)终止信号元件AOX(TT)。其中所述的乙肝表面抗原基因包含SEQIDNO:1所示的序列。本发明表达盒的制备方法包括如下步骤(1)将乙肝表面抗原基因定点插入包含起始信号元件AOX和终止信号元件AOX(TT)的质粒中，以获得单拷贝表达质粒；(2)对所述单拷贝表达质粒进行改造以获得完整的乙肝表面抗原表达盒。在本发明的优选实施方式中，所采用的质粒可为pPIC3.5(K)、pA0815或pHIL-D2等，只要其含有起始信号元件AOX和终止信号元件A0X(TT);优选pPIC3.5(K)质粒。可将乙肝表面抗原基因定点插入质粒的5'A0X1和3，AOX(TT)之间，优选插入BamHI酶切位点与EcoRl酶切位点之间。可采用PCR方法等常规方法从已构建的单拷贝表达质粒中扩增带有终止信号元件3，AOX(TT)的HBsAg基因，并改变两端的酶切位点。在本发明的优选实施方式中，优选片段5，端为BglII位点，3，端为BamHI位点，将该片段插入BamHI位点，获得在3，A0X(TT)的3，端带有BamHI位点的单拷贝表达质粒。如需使用EcoRI/Munl等其它同尾酶，则需对质粒及片段进行进一步改造。表达乙肝表面抗原的构建物及其构建如本文所用，术语"构建物，，、"本发明的构建物"和"表达乙肝表面抗原的构建物"可互换使用，均指通过分子生物学方法构建的含有2-15个串联排列的本发明的乙肝表面抗原表达盒的构建物。在本发明的一个优选例中，所述构建物中优选含有3-12个，更优选4-10个，最优选5-8个串联排列的乙肝表面抗原表达盒。可通过将上文所述的乙肝表面抗原表达盒重复插入质粒中来本发明的乙肝表面抗原表达盒的构建物。在本发明的优选实施方式中，采用同尾酶、平末端连接等方法将所述乙肝表面抗原表达盒重复插入所述质粒中，优选采用同尾酶。在本发明的另一优选实施方式中，所述方法还包括用大肠杆菌扩增所得的构建物。髙表达乙肝表面抗原的酵母细胞及其制备如本文所用，术语"乙肝表面抗原高表达酵母细胞"、"本发明的酵母细胞"、"乙肝表面抗原高拷贝表达酵母细胞"可互换使用，均指具有如下特征的表达乙肝表面抗原的酵母细胞所述酵母细胞中整合有表达乙肝表面抗原的本发明的构建物，并且所述酵母细胞在甲醇诱导下表达乙肝表面抗原，并形成乙肝表面抗原类病毒颗粒，且其表达量至少为30mg/L发酵液，例如为30500mg/L发酵液。本发明表达乙肝表面抗原的酵母细胞的制备方法包括步骤用本发明的构建物转化酵母细胞，以获得表达乙肝表面抗原的酵母细胞。所述转化可采用电转化、原生质体转化等本发明常规的转化方法进行。由本发明酵母细胞产生的乙肝表面抗原类病毒颗粒具有与天然病毒相近的抗原表位，且能刺激哺乳动物免疫系统产生保护性中和抗体。在本发明的优选实施方式中，可采用选自下组的酵母细胞毕赤酵母、酿酒酵母或汉逊酵母，优选采用毕赤酵母，例如GS115菌株、SMD1163菌株(优选GS115菌株)。本发明酵母细胞的乙肝表面抗原表达量为30500mg/L发酵液，优选40450mg/L发酵液，较优选为50400mg/L发酵液，更优选为60350mg/L发酵液。本发明的优点本发明的优点在于1.通过重组技术插入高拷贝数本发明的HBsAg基因表达盒而获得的酵母细胞，出乎意料地获得了高表达量且表达产物具有高活性；2.利用本发明的酵母细胞生产HBsAg抗体表达量高、成本低廉、生产步骤简便稳定，适于工业化生产。实施例下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(例如可参考通常按照常规条件如Sambrook等人，《分子克隆实验室指南》(NewYork:ColdSpringHarborLaboratoryPress,1989)中所述的条件)、或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。实施例1.单拷贝乙肝表面抗原表达质粒的构建用PCR方法扩增从乙肝病毒基因组中获得的HBsAg基因，插入毕赤酵母胞内表达穿梭质粒pPIC3.5(K)，构建为单拷贝表达质粒(见图1)，并对HBsAg基因进行测序。实施例2.对单拷贝表达质粒进行改造用PCR方法从已构建的单拷贝表达质粒中扩增带有pPIC3.5(K)终止信号元件3'AOX(TT)的HBsAg基因，并改变两端的酶切位点，片段5'端为BglII位点，3，端为BamHI位点。将该片段插入pPIC3.5(K)的BamHI位点，获得在3，A0X(TT)的3，端带有BamHI位点的单拷贝表达质粒(见图2)，并对HBsAg基因及与其相连的3'AOX(TT)进行测序。实施例3.构建高拷贝数表达质粒酶切获得HBsAg完整表达元件5，A0X-HBsAg基因-3，A0X(TT)，片段3，端为BglII位点，5，端为BamHI位点。将其插入改造后的单拷贝表达质粒的BamHI位点，用同尾酶进行末端连接。两个表达元件连接位点由于同尾酶末端相连，无法被这两种酶识别切开，有利于酶切鉴定及进一步插入新的表达元件。经过转化、酶切鉴定，获得具有2个拷贝表达元件的重组质粒。在此基础上，进一步插入单个或多联表达元件，可获得带有所需拷贝数的高拷贝数表达质粒(见图3)。实施例4.构建表达克隆翻微練吝将带有不同拷贝数质粒的大肠杆菌克隆分别扩增后，取部分保存，其余进行质粒抽提后，Sail酶切线性化处理，酚/氯仿抽提，无水乙醇沉淀，离心去上清，复溶。减免吝潘層劍姿1.将毕赤酵母GS115菌株接种于3mlYPD培养基中，28°C250rpm培养过夜；2.取15(^l菌液接种于150mlYPD培养基中，28°C250rpm培养过夜；3.测定OD咖，达到1.2-1.6时，4°C2500rpm，离心5分钟;4.弃上清，用150ml冰水重悬，4°C2500rpm，离心5分钟；5.弃上清，用75ml冰水重悬，4°C2500rpm，离心5分钟；6.弃上清，用6rallmol/L山梨醇重悬，4°C2500rpm，离心5分钟；7.弃上清，用50(^1lmol/L山梨醇重悬，即为感受态细胞。冶斧众将l(Hd线性化质粒与80^1l感受态细胞混合，加入预冷的电击杯中，1500mV5ms，进行电击(eppendor"Multiporato,多功能细胞电穿孔仪)。电击后立即加入lmllmol/L山梨醇，涂布于His—筛选培养基RD平板上，置于28"培养箱内生长。蛋颜游表这1.从不同拷贝数质粒的转化平板上各挑取6-IO个克隆，接种于5mlBMGY培养基，28°C250rpra培养过夜。2.测定0D6。。，达到2-6时，按照比例取样离心，使其转入10mlB丽Y诱导培养基时，OD,均调整为1。3.28°C250rpm培养3-4天，每天定时补加甲醇。4.样品3500rpm离心3分钟，弃上清，各加10ml破菌缓冲液，重悬。高压破碎，离心取上清作为样品。表这歪力週iW鉴定1.特异性检测将各样品稀释100倍，用乙型肝炎病毒表面抗原诊断试剂盒(ELISA法)检测，酶标仪读数，对比不同拷贝数克隆间的0D45。值，确认表达量与拷贝数的关系。(见表1)表l.表达量与拷贝数的关系<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>结果表明通过本发明方法可制得多个高表达乙肝表面抗原的克隆，其中如表1所示的示例性克隆中，拷贝数与表达量呈线形正相关。2.分子量检测将各样品稀释10倍，取12iil与12pl2XSDS上样缓冲液混合，98°C5分钟，取20nl上样，用于12%的SDS-PAGE电泳。SDS-PAGE电泳后，将蛋白质转移到PVDF膜上，用HBsAg单克隆抗体进行蛋白质印迹检测。用辣根过氧化酶标记的二抗孵育后，加入显色反应液显色，结合SDS-PAGE电泳结果分析表达情况及分子量。(见图4)结果表明构建的重组酵母能够正确的表达HBsAg，其分子量大小及抗原性均得到证实。3.电镜检测HBsAg颗粒的形成将样品15000rpm离心30分钟，弃上清，少量溶剂重悬，滴于铜网上，干燥后，透射电镜20000倍检测。观察HBsAg颗粒在毕赤酵母表达系统中的形成情况°由图5可见约22nm大小颗粒，表明了构建的重组酵母能够正确的表达HBsAg，并能形成22nm类病毒颗粒。实施例5.15L规模中试发酵实邀方兹以4拷贝、6拷贝克隆分别进行15L规模发酵。1.取50)il菌液接种于50mlBMGY培养基，28°C250rpm培养过夜。2.将培养液离心后，菌体转接于500ml(250ml/瓶)BMGY培养基，28°C250rpm培养4hr。3.将4.5L低盐基础培养基加入发酵罐中，在位灭菌后，调整温度、pH、溶氧，接入培养液。4.培养23hr后，开始补加甘油补料。5.6hr后停加甘油补料，待甘油耗尽后，加甲醇补料诱导表达。6.诱导60-70hr后，终止发酵。7.发酵液离心后，菌体破碎。8.菌体破碎后，离心除去细胞碎片，上清酵母破碎液进行表达量分析。表这着分桥标准品按不同比例稀释制作ELISA标准曲线，将样品的OD柳代入标准曲线中，根据稀释度得到酵母破碎液中HBsAg含量。表达量计算公式如下表达量=//^4g^量/m膀母破碎液x液重《&破碎菌量/ml酵母破碎液双^M^，实验錄菜扩大规模后表达量与拷贝数的关系如表2所示表2.扩大规模后表达量与拷贝数的关系<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>实施例6.本发明HBsAg颗粒对小鼠的免疫刺激作用实邀诚取10吗/ml样品按1:4、1:16、1:64、1:256稀释，选取5周龄的NIH雌性小鼠(上海生物制品研究所)，对应样品稀释度分为四组，每组20只，各注射lml样品，5周后采血进行放射免疫检测和ELISA抗体检测(本实验的阴性和/或阳性对照样品均在试剂盒内提供)。采用里德-明奇法(Reed-Muench)，以如下公式计算和检验本发明HBsAg颗粒样品的免疫效果距离比例=(高于50%阳转率-50%)/(高于50%阳转率-低于50%阳转率)50%阳转终点对数=高于50%阳转率稀释对数+距离比例*稀释对数的因素50%阳转终点稀释度=10,阳转终点对数实藩菜放射免疫检测和ELISA抗体检测结果如表3所示:表3.本发明朋sAg颗粒对小鼠的免疫刺激作用<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>该实验结果表明，本发明的HBsAg颗粒对小鼠具有类似于市售酵母重组乙型肝炎疫苗免疫刺激作用。里德-明奇法的结果如表4所示:表4:采用里德-明奇法获得的结果<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>结论本实验中样品的免疫效果与市售疫苗相当。在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表<110〉上海生物制品研究所<120〉高拷贝表达重组乙肝表面抗原的毕赤酵母及其制法和应用<130>071838<160>2<170>Patentlnversion3.3<210〉1<211〉681<212>DNA<213〉乙肝病毒(H印atitisBvirus)<220〉<221〉CDS<222〉(l)..柳)<400>1atggagaacateacateaggattcetaggacccctgetcgtgttacag48MetGluAsnlieThrSerGlyPheLeuGlyProLeuLeuValLeuGin151015gcggggtttttcttgttgacaagaateetcacaataccgcagagteta96AlaGlyPhePheLeuLeuThrArglieLeuThrlieProGinSerLeu202530gactcgtggtggacttctetcaattttetagggggatctcccgtgtgt144AspSerTrp丁rpThrSerUuAsnPheLeuGlyGlySerProValCys354045cttggccaaaattcgcagtecccaacctecaatcacteaccaacctec192LeuGlyGinAsnSerGinSerProThrSerAsnHisSerProThrSer505560tgtcctccaatttgtcctggttatcgctggatgtgtctgeggcgtttt240CysProProlieCysProGlyTyrArgTrpMetCysLeuArgArgPhe65707580ateatattcetcttcatectgctgetatgcetcatettcttattggtt288lieliePheLeuPhelieLeuLeuLeuCysLeuliePheLeuLeuVal859095cttctggattatcaaggtatgttgcccgtttgtcctetaattccagga336LeuLeuAspTyrGinGlyMetLeuProValCysProLeulieProGly100105110teaacaacaaccagtacgggaccatgcaaaacctgcacgactcctget384SerThrThrThrSerThrGlyProCysLysThrCysThrThrProAla115120125c肌GinggcGly130AsntctatgSerMettttPhecccPro135teaSertgttgcCysCystgtacaCysThr140LyscctProacggatThrAsp432ggaGly145aatAsntgcCysacctgtThrCysattlie150cccProatelieccategProSertectggSerTrp155getAlattcPhegceia肌AlaLys160480tac丁yrctaLeutggTrpgagtggGluTrp165gccAlateaSergtcValcgtttcArgPhe170tcttggSerTrpetcLeuagtSerttactaLeuLeu175528gtgValCC3ProtttPhegttcagValGin180tggTrpttcPhegtaValgggcttGlyLeu185teccccSerProactThrgttVal190tggcttTrpLeu576teaSergetAla3tslie195tgg3tgTrpMetatgMettggTrptatTyr200tgggggTrpGlyccaagtProSerctgLeu205tacTyrageateSerlie624gtgValagtSer210cccProtttataPhelieccgProctgLeu215tt3LeuccaattProliettctttPhePhe220tgtCysetcLeutgggtaTrpVal672tacTyr225a_ttlie681<210〉2〈211〉226〈212〉PRT<213〉乙肝病毒(H印atitisBvirus)<400〉2MetGluAsnlieThrSerGlyPheGlyProLeuUuValLeuGin151015AlaGlyPhePheLeuLeuThrArglieLeuThrlieProGinSerLeu202530AspSerTrpTrpThrSerLeuAsnPheUuGlyGlySerProValCys354045LeuGlyGinAsnSerGinSerProThrSerAsnHisSerProThrSer505560CysProProlieCysProGlyTyrArgTrpMetCysArgArgPhe65707580lieliePheLeuPhelieLeuLeuLeuCysLeuliePheLeuLeuVal859095LeuLeuAspTyrGinGlyMetLeuProValCysProLeulieProGly100105110SerThrThrThrSerThrGlyProCysLysThrCysThrThrProAla115120125GinGlyAsnSerMetPheProSerCysCysCysThrLysProThrAsp130135140GlyAsnCysThrCyslieProlieProSerSerTrpAlaPheAlaLys145150155160TyrUuTrpGluTrpAlaSerValArgPheSerTrpLeuSerLeul>eu165170175ValProPheValGinTrpPheValGlyLeuSerProThrValTrpI>eu180185190SerAlalieTrpMetMetTrpTyrTrpGlyProSerLeuTyrSerlie195200205ValSerProPhelieProLeuLeuProliePhePheCysLeuTrpVal210215220Tyrlie22权利要求1.一种表达乙肝表面抗原的酵母细胞，其特征在于，所述酵母细胞的染色体中整合有表达乙肝表面抗原的构建物，所述构建物含有2-15个串联排列的乙肝表面抗原表达盒，每个所述乙肝表面抗原表达盒包括以下元件(a)起始信号元件AOX；(b)乙肝表面抗原基因；和(c)终止信号元件AOX(TT)；并且所述酵母细胞在甲醇诱导下表达乙肝表面抗原，表达量至少为30mg/L，并且所述的乙肝表面抗原在所述酵母中自行装配成类病毒颗粒。2.如权利要求1所述的表达乙肝表面抗原的酵母细胞，其特征在于，所述酵母细胞选自毕赤酵母、酿酒酵母或汉逊酵母。3.如权利要求1所述的表达乙肝表面抗原的酵母细胞，其特征在于，所述构建物是以pPIC3.5K质粒为基础构建的，且乙肝表面抗原基因包含SEQIDNO:l所示的序列。4.如权利要求1所述的表达乙肝表面抗原的酵母细胞，其特征在于，在所述乙肝表面抗原类病毒颗粒具有与天然病毒相近的抗原表位，且能刺激哺乳动物免疫系统产生保护性中和抗体。5.—种制备乙肝表面抗原类病毒颗粒的方法，其特征在于，所述方法包括步骤(i)在适合表达的条件下，培养权利要求1所述的表达乙肝表面抗原的酵母细胞，从而表达乙肝表面抗原；和(ii)从培养物中分离出乙肝表面抗原类病毒颗粒。6.—种乙肝表面抗原类病毒颗粒，其特征在于，所述类病毒颗粒是通过权利要求5所述的方法制备的。7.如权利要求6所述的类病毒颗粒的用途，其特征在于，用于制备预防或治疗乙肝的疫苗组合物。8.—种构建物，其特征在于，所述构建物含有2-15个串联排列的乙肝表面抗原表达盒，每个所述乙肝表面抗原表达盒包括以下元件(a)起始信号元件AOX;(b)乙肝表面抗原基因；(c)终止信号元件AOX(TT)。9.构建权利要求8所述的构建物的方法，其特征在于，所述方法包括(1)将乙肝表面抗原基因定点插入包含起始信号元件A0X和终止信号元件AOX(TT)的质粒中，以获得单拷贝表达质粒；(2)对所述单拷贝表达质粒进行改造以获得完整的乙肝表面抗原表达盒，其中，所述表达盒包含(a)起始信号元件AOX;(b)乙肝表面抗原基因；(c)终止信号元件AOX(TT);(3)将所述乙肝表面抗原表达盒重复插入所述质粒中，从而获得含有2-15个串联排列的乙肝表面抗原表达盒的构建物。10.权利要求l所述的表达乙肝表面抗原的酵母细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤用权利要求5所述的构建物转化酵母细胞，使所述的构建物整合入酵母染色体中，从而获得权利要求1所述的表达乙肝表面抗原的酵母细胞。全文摘要本发明提供了一种表达乙肝表面抗原的酵母细胞，所述酵母细胞中整合有表达乙肝表面抗原的构建物，所述构建物含有2-15个串联排列的乙肝表面抗原表达盒，各表达盒包括以下元件(a)起始信号元件AOX；(b)乙肝表面抗原基因；(c)终止信号元件AOX(TT)；并且所述酵母细胞在甲醇诱导下表达乙肝表面抗原，并形成乙肝表面抗原类病毒颗粒，且其表达量至少为30mg/L发酵液。本发明还提供了所述构建物及其制法、酵母细胞的制备方法及其表达的乙肝表面抗原类病毒颗粒。本发明所构建的高拷贝数高表达酵母细胞可用于提高产量、降低成本，适于乙肝表面抗原疫苗的大规模生产。文档编号C12N15/12GK101314761SQ20071004149公开日2008年12月3日申请日期2007年5月31日优先权日2007年5月31日发明者成何,楼觉人申请人:上海生物制品研究所