专利名称：一种诱导烟草烟碱提前转化方法及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及烟草种植和育种领域，特别是一种诱导烟草烟碱提前转化方法及其应用，主要是通过诱导烟草烟碱提前向降烟碱转化，来进行烟草良种繁育过程中烟碱转化株的鉴定。
背景技术：
烟草生物碱的组成和含量是烟叶品质的核心，对卷烟的生理强度、香味和有害物质的含量，特别是烟草特有的亚硝胺(TSNAs)有直接的影响。TSNAs存在于烟草和烟气中，主要包括N-亚硝基去甲基烟碱(NNN)，4-(N-甲基亚硝胺基)-1-(3-吡啶基)-1-丁酮(NNK)，N-亚硝基假木贼碱(NAB)和N-亚硝基新烟碱(NAT)。正常情况下烟草生物碱以烟碱为主，烟碱占总生物碱的92％以上，降烟碱(去甲基烟碱，Nornicotine)含量低于总生物碱含量的3.5％。但在烟草群体中一些烟株由于基因突变会形成烟碱去甲基能力，烟碱脱去甲基转化为降烟碱，致使烟叶降烟碱含量异常增高，这些植株被称为烟碱转化株(现在国际上通用的转化株的定义是降烟碱占烟碱和降烟碱含量百分比大于5％的烟株)。降烟碱具有较大的不稳定性，一是极易发生亚硝化反应形成烟草特有的亚硝胺N-亚硝基降烟碱(NNN)。二是易发生氧化和酰化形成麦斯明和酰化降烟碱等挥发性成分，严重影响烟叶的香味。
由于烟碱转化是由显性基因控制，有加和性(Mann T J，Webrew J A.Inheritance of alkaloids in hybrids between flue-cured tobacco andrelated amphidiploids.Tob.Sci.1958，229～34；Wernsman E A，DavisD L，Beeson D.et al.Genetic instability at a nicotine to nornicotinelocus in burley tobacco and its consequences on secondary amine alkaloidsand TSNA′s.2000 CORESTA，Lisbon，Portugal)，烟草群体可积累一定比例的具有较高降烟碱含量的转化株，所以栽培品种的原始种必须定期进行转化株清除。美国规定降烟碱(区域实验和小区实验)不超过被测样品总生物碱的13％(王晓云，邓云龙，李红莺.国外烤烟育种概况.云南农业科技.1999，416～19)。我国存在烟碱转化问题。史宏志(史宏志，Bush L P，Wang J等.我国不同类型烟叶烟碱向降烟碱转化研究.中国烟草科学，2001(4)6～8)对我国不同类型烟叶生物碱含量和烟碱向降烟碱转化的株间变异研究表明，白肋烟和沙姆逊香料烟降烟碱占总生物碱比例高，不同样品间变化幅度和变异性大，烟碱向降烟碱转化问题比较突出。
群体中的转化株必须在烟叶生长的早期阶段被鉴别和清除，以保证新品种选育和良种繁育中留取纯的非转化株进行繁衍。由于在外观形态上非转化株与转化株没有显著差异，所以目前还必须依靠化学分析测定每一植株的烟碱转化能力。转化株的烟碱转化主要是在烟叶调制过程中发生的，所以转化株的早期鉴别首先需要对转化株的烟碱转化进行刺激，以便早期表达转化性状。目前报道的有两种方法可刺激转化株的烟碱转化性状在绿叶中早期表达(1)2-氯乙基膦酸。(2)碳酸氢钠处理。
2-氯乙基膦酸(ethephon)为植物生长调节剂，可在自然条件下释放乙烯。Shi等(Shi H Z，Fannin F F，Burton H R and Bush L P.Identification ofnicotine to nornicotine converters in burley tobacco.55th TobaccoScience Research Conference，2001，Greensboro，NC，USA)的研究表明，用其水溶液对绿叶进行处理可使转化株烟碱转化到其基因所规定的最大限度，高转化株的烟碱转化百分率可达95％以上。在适当的温度下，2-氯乙基膦酸所诱导的烟碱转化主要在处理后的3-5天之间，并可在第九天达到最大值，而此时未经诱导的烟叶，烟碱转化率仅为10％。此种方法已在育种和良种繁育过程中应用(Miller R D，Bush L P，Burton H R and Shi H Z.Screening for nornicotineconversion in burley tobacco.55th Tobacco Science Research Conference.2001，Greensboro，NC，USA)。但是2-氯乙基膦酸存在对处理条件要求过于严格的缺点。2-氯乙基膦酸是通过释放出的乙烯发挥作用的，处理时环境温度对乙烯气体的释放影响很大，当环境温度低于20℃时，2-氯乙基膦酸处理起不到诱导作用。并且由于2-氯乙基膦酸具有腐蚀和作用剧烈的特点，诱导处理浓度控制不当会出现烟叶组织破坏而影响鉴定结果的现象。
碳酸氢钠诱导处理是近年针对2-氯乙基膦酸方法的缺点研究出来的方法。shi等(Shi H Z，Hempfling W P，Kalengamaliro N E.Stimulation of nicotineto nornicotine conversion by treatment of tobacco with sodium bicarbonate.CORESTA，2002，New Orleans，LA，USA；Shi H Z，Kalengamaliro N E，KraussM R.et al.Stimulation of nicotine demethylation by NaHCO3treatmentusing greenhouse-grown burley tobacco.Journal of Agricultural and FoodChemistry，2003，51(26)7679-7683)研究表明，在最适条件下，碳酸氢钠可使转化株的烟碱转化碳酸氢钠达到特定基因型所决定的最大转化程度。在37℃温度条件下进行处理，高转化株的成熟烟叶达到95％以上烟碱转化所需的时间为2～3天，绿叶为4～6天。碳酸氢钠的浓度对诱导转化的效果有很大影响，试验表明对烟草早期幼叶以0.8％最为适宜，对烟株生长中期烟叶以1％最为适宜。由于碳酸氢钠对处理条件温和，对处理环境要求没有2-氯乙基膦酸严格，因此提供了在烟株生长时期更简便有效的鉴别转化株的方法。但是该方法诱导后转化率偏低，使得低转化株诱导后烟碱不能充分转化表现出转化特征，影响鉴定结果准确性。
由于这两种方法都有各自的缺点，限制了这两种方法的应用，新的可适于大田应用的方便有效的转化株鉴别方法和技术有待进一步研究。
发明内容
本发明的目的正是针对上述现有诱导烟碱转化的方法的缺陷，提供的一种方便高效的诱导烟草烟碱提前转化方法及其应用。该方法处理条件温和，没有出现有2-氯乙基膦酸由于浓度不当影响鉴定的情况，同时比碳酸氢钠诱导处理效果更好，诱导后烟碱转化率更高。本发明在烟草的新品种选育和良种繁育中应用，可以在留种前鉴定出烟碱转化株，提前剔出，达到纯化种子的效果，可以有效地降低后代的烟碱转化率，对于提高烟叶香味和安全性有着重要的意义。本发明的目的可通过下述技术措施来实现本发明的诱导烟草烟碱提前转化方法包括以下步骤取烟株下部8-12叶位的烟叶一片，喷施浓度为0.1％-10％的3，5-二硝基水杨酸，在环境温度15℃-43℃条件下进行调制处理，时间大于4天，以诱导转化株的烟碱转化性状在绿叶种早期表达。
在本发明中，调制处理在可以控制温、湿度的晾房、烤房或恒温恒湿箱进行；所述3，5-二硝基水杨酸的浓度最好为0.5-3％。
上述诱导烟草烟碱提前转化方法在烟草良种繁育中烟碱转化株鉴定中的应用，包括以下步骤将调制处理好的烟叶放入105℃下杀青3-10分钟，然后在60℃下烘干，测定烟碱与降烟碱含量，根据转化率判断是否为转化株。
测定烟碱与降烟碱的含量用气相色谱法。
本发明的方法及其应用依次包括以下步骤a.在烟苗从塑料大棚移栽到大田1个月时，取烟株下部叶一片，取叶部位为8-12叶位；b.向叶面喷施浓度为0.1％-10％的3，5-二硝基水杨酸进行调制，调制可以在晾房、烤房和恒温恒湿箱等可以控制温湿度的地方，环境温度为15℃-43℃，处理时间应大于4天；c.取调制好的烟叶，先105℃杀青5min，然后60℃烘干；d.用气相色谱测定烟碱和降烟碱的含量，参考Severson等人的测定方法(Severson R F，Mcduffie K L，Arrendale R F.Rapid method for the analysis of tobacco nicotime alkaloids.J.Chromatogr.，1981，211111～121)，根据单株转化率确定烟株是否为转化株。
所述步骤b中，3，5-二硝基水杨酸分子式为C7H4N2O7。分子量为228.12，CAS登录号为609-99-4，EINECS登录号为201-204-3，熔点为168-174℃，可溶。
选用100株鄂烟3号母本进行3，5-二硝基水杨酸与碳酸氢钠的诱导效果对比实验(表1)。研究发现相同群体经过0.5％3，5-二硝基水杨酸诱导后总转化株的平均转化率62.26％比1％碳酸氢钠的32.49％高，高转化株的平均转化率也是0.5％3，5-二硝基水杨酸诱导更高，说明3，5-二硝基水杨酸诱导烟碱转化的更加完全，效果更好。对比从100株鄂烟3号母本中鉴定出的转化株数目发现3，5-二硝基水杨酸处理后鉴定出的23株也比碳酸氢钠的20株多，进一步调查发现3株差异株都是低转化株，说明3，5-二硝基水杨酸比碳酸氢钠的诱导鉴定出更多的低转化株。因此，相比碳酸氢钠的诱导处理，3，5-二硝基水杨酸诱导后烟碱转化的更完全，鉴定出的转化株更多。
表一3，5-二硝基水杨酸与碳酸氢钠的诱导效果对比
PNC(Percent of Nicotine Conversion) 代表烟碱转化率，为降烟碱占烟碱和降烟碱的比例本发明与现有方法相比，其优点为大幅提高诱导后烟碱的转化率，增加早期鉴定出的转化株的数目，降低亲本转化性状的遗传几率。本发明在烟草的新品种选育和良种繁育中应用，可以在留种前鉴定出烟碱转化株，提前剔出，达到纯化种子的效果，可以有效地降低后代的烟碱转化率，对于提高烟叶香味和安全性有着重要的意义。
具体实施方案本发明以下将结合实施例做进一步描述，但并不限制本发明。
实施例1选B21高转化株和非转化株各20株，取下部烟叶一片，喷施0.5％的3，5-二硝基水杨酸，在温度为16～23℃晾房中晾制6天，放入烘箱先105℃杀青5min，然后60℃烘干，测定烟碱与降烟碱，根据转化率判断是否为转化株。
实施例2选用实施例1中的烟株，取下部烟叶一片，喷施0.5％的3，5-二硝基水杨酸，套塑料袋后放入烘箱，38℃±1℃条件下保湿处理6天，然后烘箱中105℃杀青5min，60℃烘干，测定烟碱与降烟碱，根据转化率判断是否为转化株。
实施例3选用实施例1中的烟株，取待测烟株下部烟叶一片，向烟叶表面喷施0.5％的3，5-二硝基水杨酸，在恒温恒湿箱中，保持80％±1％湿度38℃±0.1℃6天，放入烘箱先105℃杀青5min，然后60℃烘干，测定烟碱与降烟碱，根据转化率判断是否为转化株。
对比三种处理的效果(表2)，发现对于高转化株，实施例3效果最好，诱导处理相同群体得到的平均转化率最高为75.23％，由于非转化株没有烟碱去甲基能力，3种处理后非转化株的转化率没有差异。但是实施例3要求恒温恒湿箱设备，处理烟叶样品能力有限，只适用于小面积的诱导处理。实例1和2则仅需要烘箱处理，要求简单，更适合大面积的育种或良种繁育检测。
表二3个实施例处理效果对比
注括号内为标准差。
另外，3，5-二硝基水杨酸的浓度范围可在0.1～10％中选择，最好浓度范围在0.5～3％。经试验，3，5-二硝基水杨酸浓度对烟草转化株鉴定结果的准确性影响不大。
权利要求
1.一种诱导烟草烟碱提前转化方法，其特征在于该方法包括以下步骤取烟株下部8-12叶位的烟叶一片，喷施浓度为0.1％-10％的3，5-二硝基水杨酸，在环境温度15℃-43℃条件下进行调制处理，时间大于4天，以诱导转化株的烟碱转化性状在绿叶中早期表达。
2.根据权利要求1所述的诱导烟草烟碱提前转化方法，其特征在于调制处理在可以控制温、湿度的晾房、烤房或恒温恒湿箱进行。
3.根据权利要求1所述的诱导烟草烟碱提前转化方法，其特征在于3，5-二硝基水杨酸的浓度最好为0.5-3％。
4.一种利用权利要求1所述的诱导烟草烟碱提前转化方法在烟草良种繁育中烟碱转化株鉴定中的应用。
5.根据权利要求4所述的诱导烟草烟碱提前转化方法在烟草良种繁育中烟碱转化株鉴定中的应用，其特征在于它包括以下步骤将调制处理好的烟叶放入105℃下杀青3-10分钟，然后在60℃下烘干，测定烟碱与降烟碱含量，根据转化率判断是否为转化株。
6.根据权利要求5所述的诱导烟草烟碱提前转化方法在烟草良种繁育中烟碱转化株鉴定中的应用，其特征在于用气相色谱法测定烟碱与降烟碱的含量。
全文摘要
一种诱导烟草烟碱提前转化方法及其应用，其特征在于本发明的诱导方法包括以下步骤取烟株下部8－12叶位的烟叶一片，喷施浓度为0.1％－10％的3，5－二硝基水杨酸，在环境温度15℃－43℃条件下进行调制处理，时间大于4天，以诱导转化株的烟碱转化性状在绿叶中早期表达。本诱导方法在烟草育种和良种繁育中烟碱转化株鉴定中的应用，可通过测定烟碱与降烟碱含量，根据转化率判断是否为转化株。本发明的优点在于可以在留种前鉴定出烟碱转化株，提前剔出，达到纯化种子的效果，可以有效地降低后代的烟碱转化率，对于提高烟叶香味和安全性有着重要的意义。
文档编号C12N15/09GK101070535SQ20071005408
公开日2007年11月14日 申请日期2007年3月20日 优先权日2007年3月20日
发明者蔡斌, 杨军, 尹启生, 宋纪真, 薛超群 申请人:中国烟草总公司郑州烟草研究院