益生菌高密度培养过程中的化学去胁迫技术的制作方法

专利名称：益生菌高密度培养过程中的化学去胁迫技术的制作方法
技术领域：
本发明所描述的技术方法，可以应用于两株益生菌——嗜酸乳杆菌(Z_.ac/'cfop/jZ//us)或两歧双歧杆菌(8. b折dum)的髙密度生产，提高活菌的整体水平。而这两株益生菌，是生产功能性乳制品、保健食品的重要 原料之一。背衆技术一些细菌(例如乳杆菌属和双歧杆菌属)具有优良的功能特性，可以为人类提供特殊的、有用的作用(例 如保健作用)，因而被人们称之为益生菌。但是，被人类摄入的益生菌，只有在达到一定的数量水平时， 才能产生相应的保健作用。所以，以益生菌为功能成分的功能性乳制品或者保健食品，需要将益生菌的活 菌体保持在一定水平。故此，益生菌的高密度培养、生产技术，可以增加益生菌活菌体的总量或者是在单 位体积中的数量水平，是当前食品技术开发中的关键技术问题。本发明为两株益生菌的高密度培养提供一 个新的技术方法，即利用化学物质所产生的化学反应，部分消除两株益生菌在高密度培养过程中所要承受 的胁迫作用，简单但有效的达到提高发益生菌酵液中活菌整体水平的目的，这个技术可以简称为化学去胁 迫技术。发明内容在嗜酸乳杆菌的高密度生产过程中，由于嗜酸乳杆菌繁殖而产生乳酸，导致了发酵液的pH下降，对嗜酸乳 杆菌产生相应的胁迫作用。pH的变化程度与嗜酸乳杆菌的水平相关，并最终影响到嗜酸乳杆菌的进一步增 殖。利用碱性盐(碳酸钙或者是柠檬酸钠)的作用，对乳酸进行中和反应(反应发生的方式如下)，可以 部分消除乳酸对嗜酸乳杆的胁迫作用，有利于嗜酸乳杆菌的进一步增殖。反应1:碳酸钙+乳酸4乳酸钙+ 二氧化碳+水反应2:柠檬酸钠+ 乳酸4乳酸钠+柠檬酸^嗜酸乳杆菌 被嗜酸乳杆菌部分代谢双歧杆菌是严格厌氧，在好气条件下不能增殖。在两歧双歧杆菌的高密度生产过程中，由于氧气对两歧双 歧杆菌具有毒性作用，因此发酵液中氧气的残留，就对两歧双歧杆菌产生胁迫作用，直接影响到两歧双歧 杆菌的增殖。利用抗氧化作用较强的抗氧化剂(抗坏血酸或者是异抗坏血酸)，与残留的溶氧发生反应(反 应方式如下)，可以降低溶氧的水平，从而有利于两歧双歧杆菌的高密度增殖。反应1:抗坏血酸+氧4脱氢抗坏血酸+水 反应2:异抗坏血酸+氧~>脱氢异抗坏血酸+水本发明所涉及到的技术路线是 (1)嗜酸乳杆菌的高密度培养方法11) 配制1.61_的12%脱脂乳培养基。2) 在培养基中添加20%的柠樣酸钠溶液或者是碳酸钙固体。如果是加入柠樣酸钠溶液，则柠樣酸钠 溶液添加至培养基的pH达到6.9;如果是加入碳酸钙固体，则碳酸钙加入量为5g七—1。3) 按照115'C x 15 min的灭菌条件灭菌处理培养基。4) 灭菌后冷却，按2%的量在培养基中接种嗜酸乳杆菌，然后在5.0L的发酵罐中进行发酵培养。5) 培养条件为37'C、搅拌速度为100r，mirV1，培养时间为19h。6) 培养完成后，采用平板计数法分析发酵液中的嗜酸乳杆菌活菌数，并且与对照样比较。(2) 嗜酸乳杆菌的髙密度培养方法21) 配制1.61_的12%脱脂乳培养基，并且按照115'CX15min的灭菌条件进行灭菌处理。2) 灭菌后冷却，按2%的量接种嗜酸乳杆菌，在5.0L发酵罐中进行发酵培养。3) 培养条件为37'C、搅拌速度为100r'min"，总培养时间为19h。4) 培养8h时，向培养基中添加灭菌的20%柠檬酸钠溶液，柠橡酸钠溶液添加至培养基pH为5.9。5) 继续培养11 h，完成后采用平板计数法分析发酵液中的嗜酸乳杆菌活菌数，并且与对照样比较。(3) 两歧双歧杆菌高密度培养方法1) 配制1.6 L的12。/o脱脂乳培养基。2) 向培养基中添加异抗坏血酸钠或是抗坏血酸钠，加入量分别达到3.2 g七"或者是1.6 g丄—1，按照 115'CX15min的灭菌条件进行灭菌处理。3) 灭菌后冷却，按5%的接种量接种两歧双歧杆菌，在37'C、 100 r min—1条件下培养24 h。4) 培养完成后，釆用平板计数法分析发酵液中的两歧双歧杆菌活菌数，并且与对照样比较。本发明应用于发酵罐培养益生菌时的结果如下化学去胁迫技术培养两株益生菌的发酵罐培养结果益生菌嗜酸乳杆菌两歧双歧杆菌化学去胁迫方法20%柠檬酸钠 液先期调pH 至6.9先添加碳酸 钙5 g七-120%柠檬酸钠 液中期调pH至 5.9先期加异抗坏血 酸钠3.2 g.L.1先期加抗坏血 酸钠1.6 9丄-1接种量2%5%培养条件37°C, 19 h， 100r'mirV137°C， 24 h、 100r' miif1活菌数 (CFU ml_-1)5.75" 089.65x1085.80" 081.01x1081.54x108增加倍数 (与对照样比)24222.5发酵液中益生菌活菌体水平的评价方法活菌数的测定，主要采用传统的平板计数法(1) 用1 mL无菌吸管，吸取发酵液0.5mL,沿试管壁徐徐注入含有4.5 mL无菌生理盐水的小试管 中。振摇试管混合均匀，作成1 : 100的稀释液。(2) 另取1 mL无菌吸管，按上述操作顺序，作10倍递增稀释液，如此每递增稀释一次，即换用1 支1 mL无菌吸管。(3) 选择两个适宜稀释度，分别在作10倍递增稀释的同时，吸取0.1 mL稀释液于相应培养基中(嗜 酸乳杆菌涂于MRS固体培养基中；双歧杆菌涂于TPY固体培养基中)，每个稀释度用三个平皿，用无菌 涂布棒均匀涂布。(4) 涂布完毕，待菌液渗入固体培养基后，翻转平板，置于培养箱内培养。涂有嗜酸乳杆菌的平板 置于37。C恒温培养24 h~48 h;涂有双歧杆菌的平板置于371C厌氧培养24 h~48 h。取出后，算出同一稀 释度二个平板内菌落数的平均数，乘以稀释倍数，即得每毫升发酵液中所含活菌数(CFU'mL—1)。
权利要求
1. 本发明专利名称为益生菌高密度培养过程中的化学去胁迫技术，是对益生菌高密度培养的一种简便、实用增菌技术进行保护。
2. 根据权利要求1所述的益生菌，是嗜酸乳杆菌(L. acWoph///us)或两歧双歧杆菌(8. b/'ffdum)。
3. 根据权利要求1所述的化学去胁迫技术，是利用碱性盐——柠檬酸钠或者碳酸钙来消除发酵过程所产 生的乳酸对嗜酸乳杆菌所具有的胁迫作用，或者是利用抗氧化剂——异抗坏血酸和抗坏血酸来消除溶 氧对两歧双歧杆菌所具有的胁迫作用。它们的添加方法主要是采用发酵前加入，也可以根据它们的性 质特征，在发酵中期加入。
4. 根据权利要求3所述的各类化合物的添加水平各有不同。对于嗜酸乳杆菌，各种化合物的添加方式分 别是发酵前加入碳酸钙5g七—1,或加柠檬酸钠液至pH6.9;发酵中期加入柠檬酸钠液至pH 5.9。对 于歧双歧杆菌，发酵前加入异抗坏血酸和抗坏血酸3.2 g丄"或者1.6 g丄人添加这些化学物质后，益 生菌活菌体增加倍数相比于对照样可以达到2~4倍。
5. 根据权利要求1所述，在进行益生菌的高密度培养时，其大致技术方法与条件为(1) 嗜酸乳杆菌的高密度培养方法11) 配制1.6 1_的12%脱脂乳培养基。2) 在培养基中添加20%的柠檬酸钠溶液或者是碳酸钙固体。如果是加入柠槺酸钠溶液，则至培养基 pH至6.9;如果是加入碳酸钙固体，则加入量选择为5g七—1。3) 脱脂乳培养基按照115'C X 15 min的灭菌条件进行灭菌处理。4) 按2%的量接种嗜酸乳杆菌，在发酵罐中进行发酵培养。5) 培养条件为37'C、搅拌速度为100r'min—1，培养时间为19h。(2) 嗜酸乳杆菌的高密度培养方法21) 配制1.61_的12%脱脂乳培养基，按照115'CXl5min的灭菌条件进行灭菌处理。2) 按2%的量接种嗜酸乳杆菌，在发酵罐中进行发酵培养。3) 培养条件为37'C、搅拌速度为100。 min—1，总培养时间为19h。4) 培养8h时，向培养基中添加灭菌的20%柠檬酸钠溶液，至培养基的pH为5.9。(3) 两歧双歧杆菌高密度培养方法1) 配制1.61_的12%脱脂乳培养基。2) 向培养基中添加异抗坏血酸钠或是抗坏血酸钠，加入量分别达到3.2 g丄"或者是1.6 g七"，按照 115°C x 15 min的灭菌条件进行灭菌处理。3) 按5%的接种量接种两歧双歧杆菌，在37'C、 100 r min"条件下培养24 h。
全文摘要
本发明益生菌高密度培养过程中的化学去胁迫技术，是可应用于嗜酸乳杆菌(L.acidophillus)或两歧双歧杆菌(B.bifidum)高密度发酵生产的简便、有效增菌技术。本发明针对这两株益生菌发酵时所承受的胁迫作用——酸或氧，以两类化学物质消除相应的胁迫作用，两类物质分别为碱性盐(碳酸钙或柠檬酸钠)和脱氧剂(抗坏血酸或异抗坏血酸)，实现活菌总数增加2～4倍。具体方法是(1)在培养嗜酸乳杆菌时，发酵液中添加碳酸钙5g·L^-1，或使用柠檬酸钠调节pH为6.9，或者在嗜酸乳杆菌半发酵期用柠檬酸钠调节pH为5.9，最终活菌数可增加2～4倍。(2)在培养两歧双歧杆菌时，发酵液中添加3.2g·L^-1的异抗坏血酸钠，或者添加1.6g·L^-1的抗坏血酸盐，最终活菌数可增加2倍。
文档编号C12N1/20GK101230323SQ200710071690
公开日2008年7月30日 申请日期2007年1月26日 优先权日2007年1月26日
发明者丹 李, 赵新淮 申请人:东北农业大学