专利名称：高效温控正筛选克隆载体的设计及构建方法
技术领域：
本发明内容属于生物技术领域。
背景技术：
1、 分子克隆载体技术分子克隆技术是基因工程技术的基础。分子克隆技术用f将一段目的DNA片 段(或基因)插入一个质粒载体(一个能在细菌细胞中复制、传代的闭合环状双链DNA分子)中以长期保 存该目的DNA片段供进行后续研究，因此分子克隆技术中的一个重要技术基础是用于克隆目的DNA片段 的质粒载体(或称克隆载体)。 一个克隆载体分子中至少要包含如下3个功能结构质粒复制必须的基因 元件，供筛选阳性克隆用的抗性基因，供插入目的DNA片段用的酶切位点。
2、 分子克隆筛选技术目的DNA片段插入(连接入)克隆载体后，需转化入宿主菌(通常为大肠 杆菌工程菌株)中才能保存，但转化产物中并非所有宿主菌细胞中都含有插入目的DNA片段的载体，因 此需要从所有转化子中筛选含有插入目的DNA片段的重组载体的宿主菌细胞(阳性转化子)，才能获得目 的DNA片段。达到这一目的的筛选技术从原理上分为两类负筛选技术和正筛选技术。
负筛选技术克隆载体上有两个不同的抗性基因A和B，如果目的片段插入A中，则阳性细胞不能在 含抗生素A的培养基上生长但能在含抗生素B的培养基上生长，反之亦然。因此，要筛选阳性克隆(含有 插入目的DNA片段的载体的宿主菌细胞)，就必须从未加抗生素的培养基上复制所有克隆然后分别在含抗 生素A和B的两个培养基上培养，同一克隆如果在在含抗生素A的培养基上不生长而在含抗生素B的培 养基上生长，则为阳性克隆。这种负筛选技术是基因工程时代早期的技术，需要复制菌落才能进行筛选， 因此操作繁琐、费时费力，现在已经基本不用了。
正筛选技术指不需要进行菌落复制就可以一次筛选出阳性克隆的技术。目前使用得最广泛的是利用 a互补原理的蓝白斑筛选技术。利用这种技术的克隆载体上有(3半乳糖苷酶的a片段表达盒，且在a片段 编码序列中有多克隆位点。当目的片段插入多克隆位点时，a片段因插入失活而不能表达，含有重组载体 的阳性转化子在含有诱导剂IPTG和显色底物X-gal的筛选培养基上生长的菌落为白色；反之，含非重组 载体的阴性转化子会由于oc片段的表达在上述的筛选培养基上长成蓝色菌落。因此，利用这一正筛选技术， 只需要将转化产物在筛选培养基上培养一次就可通过菌落颜色筛选出阳性克隆。
3、 Lysis gene E溶菌技术
上世纪80年代已经发现克隆的OX174的溶菌基因E (Lysis gene E)的表达产物足以引起宿主大肠杆 菌溶菌死亡，其机理是E基因的表达产物能够寡聚化并在宿主大肠杆菌的细胞壁上形成跨膜孔道，从而导 致宿主细胞内容物流失(Blasi U., Henrich B.， and Lubitz W. 1985. Lysis of Escherichia coli by cloned gene E depends on its expression. J. Gen. Microbiol. 131:1107-1114.)，后来这一溶菌机制曾被用于研究新型非变性灭 活菌苗
发明内容
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本发明提供设计和构建仅用特定培养温度即可简便、高效筛选阳性克隆的新型分子克隆载体的方法。 本发明可用于设计和构建使用时需酶切的普通克隆载体和不需酶切的T-A克隆载体(又称T载体)。 本发明利用噬菌体0>X174的溶菌基因E的表达产物能够在大肠杆菌的细胞壁上形成跨膜孔道从而导 致宿主细胞内容物流失而死亡的机制设计和构建所述克隆载体。当目的片段插入所述载体上的克隆位点时 将导致E基因表达沉默，因此含重组载体的阳性转化子在诱导温度(42°C)下培养时能正常生长成菌落克 隆，反之，含非重组空载体的阴性转化子在该诱导温度下培养时会因E基因表达而溶菌死亡，不能长成菌 落克隆。
本发明设计、构建的温控正筛选克隆载体具有下述区别于其它已有克隆载体的技术特征，并因此实现 高效温控正筛选阳性克隆的目的
1 、所述克隆载体具有X噬菌体的温度敏感阻遏子基因cI857。
2、 所述克隆载体具有受上述温度敏感阻遏子基因cl857调控的源自人噬菌体的p/ 启动子或p丄启动
子或串联的/7/ 、 /7丄双启动子。
3、 所述克隆载体具有OX174噬菌体的溶菌基因E的编码序列(GenBank序列号j02482)，且该基 因置于上述p/ 、 />丄启动子下游并由它们启动表达。
4、 所述克隆载体上的E基闵编码序列或E基因与其上游SD序列之间的间隔序列经由点突变方法引 入1个或多个酶切位点，而且这些点突变为沉默突变(即突变后的E基因DNA序列编码的氨基 酸序列不变)。这些酶切位点是用于插入外源DNA片段的克隆位点。
5、 所述克隆载体用于克隆外源DNA片段时，外源DNA片段插入上述的酶切位点将导致E基因表达 沉默，并因此使得阳性转化子能够在特定的诱导温度(42'C)下培养时长成克隆而被筛选出来(含 空载体的阴性转化子在诱导条件下将因E基因的表达而死亡)。
目前广泛使用的蓝白斑筛选克隆载体技术利用菌落颜色达到筛选阳性克隆的目的，但没有从技术 机制上解决阴性背景的问题。所述温控正筛选克隆载体从技术机制上抑制阴性克隆的形成，使得筛选 后转化子阳性率达到99.9%以上，因此特别适用于构建高质量的DNA文库。
1、 附图为所述克隆载体的结构示意图，因此各部分并不与其DNA片段大小成比例。
2、 为便于制图即示意结构，附图为质粒的线型结构，而实际构建出的质粒为本图所示线型结构首尾 相连的环形结构。
3、 附图中的直线表示间隔序列。
4、 附图中的矩形表示功能基因或基因元件Ori指质粒复制起点；R指抗生素抗性基因；E指溶菌基 因E。
5、 附图中的右向空心箭头表示启动子/^或/ i或串联的/^, pi。
6、 附图中的MCS所指示的区域为设计克隆位点的区域。
具体实施例方式
实施实例l:普通克隆载体pClonEZ的构建
以在国内各实验室广泛使用的非专利质粒载体pBV220为出发载体，按如下步骤和方法构建
1、 以市售噬菌体OX174的基因组DNA为模板,用PCR技术扩增完整的E基因编码序列(273bp)。 设计扩增E基因的引物时在上游引物引入EcoRI位点，下游引物引入PstI位点，酶切位点外 侧引入4个保护碱基。PCR扩增根据所选用高保真T叫酶产品说明书和引物的Tm值进行。 扩增产物大小约为300bp。
2、 用EcoR I和Pst I分别双酶切质粒pBV220和上述PCR扩增的E基因片段，并割胶回收两个 酶切反应的大片段。嗨切反应和割胶回收按所选用产品的说明书进行。
3、 连接酶切后回收的两个大片段，E基因片段与载体片段的摩尔比为7: 1,连接反应按选用的 DNA连接酶产品的说明书进行。
4、 按常规化学转化方法将连接产物转化入大肠杆菌工程菌株(如DH5a或XL-l blue)的感受 态细胞，但热激后的复苏温度必须为28'C。转化产物涂布在含Amp (50mg/ml)的LB固体培 养基上，28'C过夜培养。
5、 用菌落PCR方法从步骤4培养的转化子中筛选阳性克隆。菌落PCR使用步骤1中扩增E基 因的引物，方法为通用的菌落PCR方法，扩增出300bp目的条带的菌落为阳性克隆。
6、 阳性克隆功能鉴定步骤5中筛选出的阳性克隆在含Amp的LB液体培养基中28'C培养至 OD600吸光度为0.3-0.4,将培养温度提高至42'C诱导E基因表达，每15分钟抽样测定培养 物的OD600吸光度，1小时内培养物的OD600吸光度应降至0.2以下。涂板计数诱导前和诱 导结束时培养物的活菌数，诱导结束时单位体积培养物的活菌数应该下降至诱导前的1/1000 以下。
7、 经上述功能鉴定的阳性克隆所含质粒称为pLys，含pLys的大肠杆菌只能在28'C培养增殖。
8、 用市售QuikChange⑧site-directed mutagenesis kit ( Strategene公司产品)并按照其产品说明 书所述方法对pLys进行点突变，将E基因前的EcoR I位点序列改变为BamH I位点序列， 该位点将作为克隆外源DNA片段的单克隆位点。如此构建的载体即为pClonEZ。含pClonEZ 的大肠杆菌只能在28'C培养增殖。
如上构建的pClonEZ载体含有一个BamH I单克隆位点。使用该载体时，经BamHI或其同尾酶 酶切后的目的DNA片段插入该位点后，由于E基因与上游的SD序列的距离增加，因而其转化子在 诱导温度下(42'C)培养时E基因表达沉默，正常生长成菌落克隆。
由于BamH I和用于构建基因组文库常用的Sau3A I为同尾酶，因此pClonEZ载体特别适用于构 建基因组文库。使用pClonEZ载体构建基因组文库时，即使不对酶切后的pClonEZ载体作去磷酸化处 理，含自连非重组载体的阴性转化子经诱导温度培养时的存活率将低于1/1000，如加上去磷酸化处理 则构建的文库中非重组背景克隆将远低于1/1000。假设构建一个基肉组文库的库容为20000个克隆(一 个细菌基因组文库的库容)，则其中的非重组背景克隆将低于20个。 ' 实例2: T载体pEZ-T的构建
以实例1中构建的pClonEZ为出发载体构建用于T-A克隆的T载体pEZ-T:
1 、用市售QuikChange site-directed mutagenesis kit并按照其产品说明书所述方法对pClonEZ进行 点突变，将E基因前的EcoRI位点序列突变为EcoRV位点序列，所得质粒为pEZ-T前载体。
2、 用EcoRV酶切上述pEZ-T前载体，酶切反应体系和条件按相应内切酶产品说明书进行。
3、 用常规的酚一氯仿抽提、乙醇沉淀的方法纯化回收线性化的pEZ-T前载体。
4、 以上述pEZ-T前载体和dTTP为底物，用Taq DNA聚合酶进行末端加T反应，反应体系和条件按 Taq DNA聚合酶的产品说明书进行。
5、 用常规的酚一氯仿抽提、乙醇沉淀的方法纯化回收加T后的pEZ-T前载体，即得可用于T-A克隆 的pEZ-T载体。
pEZ-T的使用方法与现有的T载体大致相同，不同之处在于筛选转化产物时只需要使用Amp抗 性平板培养基并用42'C培养即可，而且长出的菌落克隆阳性率高达99.9%。
由于非重组阴性背景克隆低于1/1000， pEZ-T特别适用于构建cDNA文库。
权利要求
1、本发明设计的高效温控正筛选克隆载体是用于克隆DNA片段的质粒载体，其与已有其它克隆载体一样具有质粒复制起点、抗生素抗性基因，能够在大肠杆菌细胞内复制、扩增和保存。其特征在于使用所述载体克隆外源DNA片段时，只需要在特定的诱导温度(42℃)下培养即可高效筛选出阳性转化子克隆。
2、 根据权利要求1所述的高效温控正筛选克隆载体包括使用时需要酶切的普通克隆载体和不需酶切的 T-A克隆载体(又称T载体)。
3、 根据权.利要求1或2所述的高效温控正筛选克隆载体，其特征在于具有X噬菌体的温度敏感阻遏子 基因c1857。
4、 根据权牙噪求1或2所述的高效温控正筛选克隆载体，其特征在于具有受权利要求3所述温度敏感 阻遏子基因cI857调控的、源自l噬菌体的/^启动子或/^启动子或串联的pi 、 /^双启动子。
5、 根据权利要求1或2所述的高效温控正筛选克隆载体，其特征在于具有OX174噬菌体的溶菌基因E 的编码序列，且该基因置于上述;^、 p丄启动子下游并由它们启动表达。
6、 根据权利要求5所述的溶菌基因E，其特征在于E基因编码序列或E基因与其上游SD序列之间的间 隔序列经由点突变方法人为引入1个或多个酶切位点，而且这些点突变为沉默突变(即点突变后的E 基因DNA序列编码的氨基酸序列不变)。
7、 根据权利要求6所述的酶切位点，其特征在于这些酶切位点是用于插入外源DNA片段的克隆位点， 而且外源DNA片段插入这些酶切位点后将导致权力要求6所述的溶菌基因E的表达沉默
全文摘要
本发明提供设计和构建用于克隆DNA片段的新型分子克隆载体的方法。本发明利用噬菌体ΦX174的溶菌基因E的表达产物能够导致宿主大肠杆菌细胞死亡的机制设计和构建所述克隆载体。当目的片段插入所述载体上的克隆位点时将导致E基因表达沉默，因此含重组载体的阳性转化子在诱导温度(42℃)下培养时正常生长成菌落克隆，而绝大部分(99.9％)阴性转化子在该温度下培养时将因E基因表达而死亡，不能长成菌落克隆。本发明可用于设计、构建普通克隆载体和T载体。本发明所述克隆载体具有抑制阴性克隆生成的技术特征，因此除用于单基因克隆外，特别适用于构建基因组文库和cDNA文库。
文档编号C12N15/63GK101182533SQ20071009298
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月15日 优先权日2007年11月15日
发明者跃 马 申请人:跃 马