专利名称：：Nipah病毒的引物和探针及一步法实时RT-PCR检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明专利属于生物
技术领域：
，涉及科研、临斜口病毒^^亍病学监测等工作中使用RT-PCR方法对Nipah病毒RNA的检测和定量分析。具体是针对Nipah病毒的I物和探针及一步法实时RT-PCR检测试剂盒。
背景技术：
：Nipah病毒与人类疾病Nipah病毒(NipahVirus,NiV)是近年来新出现的一种副粘病毒，可引起人和动物急性中枢神经系统病变。Nipah病毒感染于1998~1999年在马来西亚和新加坡首;W暴发，最a孟加拉国、泰国和印度"tkitt现。在人类，Nipah病毒引起热性脑炎并伴发呼吸系统症状，死亡率高。Nipah病毒的储存宿主被认为是果蝠，人类可通过与蝙蝠直4勤姿触或与猪等中间宿主接触而被感染。然而Nipah病毒的病毒学特征和其在A^中传播的iM亍病学特点等相关问题仍不清楚。Nipah病毒的斗企测Nipah病毒的检测方法主要有以下几种病毒分离与鉴定、血清中和试验(Serumneutralizationtest,SNT)、酵耳关免疫吸附检测(Enzyme-linkedimmunosorbentassays,ELISA)、PCR检测等。病毒分离是病44生脑炎tt^出、最重要的诊断手段。对于新发疾病病例，病毒分离是最有价值的工作，但Nipah病4^离需在生物安全4级(P4)^^牛下进行。血清中和i&睑(Serumneutralizationtest,SNT)和酶联免疫吸附检测(Enzyme—linkedimmunosorbentassays,EUSA)均为免疫学才企测方法，每文感寸生高，但特异性较差，并存在一定的交叉反应。制备单克隆抗体可以增加特异性，但成本较高。PCR检测具有快速、准确的特点，也被广泛用于对Nipah病毒的检测。目前已经建立的PCR检测方法有1)Guillaume等6W"犯肥gZe/"e〃w.e/l，Ge"/.5^ec//7cfl^e"/cwz/ms1^//^7nW(Ta《她"人/^ra/胞Mo&，iY^/，""0,"夕-J7针对Nipah病毒N基因的Realtime—PCR(Taqman荧光探针)检测方法，检测灵壽能达1PFU的病毒量，该方法适合对自然感染样品或^亍病学样4^根全观'J。2)Wacharapluesadee等股由，A/ei"油e《〃e鹏c力u必a,r，""p7ex加Wet/7r-ZO/brctefe"/o/oTyV/;a力72'ms1MJ/Ycwwr/ze5"/eciiWe/5"of/.P7ro/.#"力<9叙2〃斷由六MMM力:jV/r湖eA"傲"〃"建立了针对Nipah病毒N基因的D叩lcxnestRT-PCR检测方法，用卡那霉素RNA质粒作为内参，同时扩增内参和Nipah病毒N基因，有效的避免了假阴性结果，检测限为0.37pg/ul,PCR检测的灵敏度进一步提高。实时PCR(Real-timePCR)技术实时PCR技术是近年来^^来的一种新型的PCR技术，它是在传统PCR反应体系的勤出上添加了荧光染料或具有荧光标记的探针，将荧光信号强弱与PCR扩增情况结合在l,通过监测PCR反应管内荧光信号的变化来实时观测PCR反应进行的情况。实时PCR技术，解决了传统PCR难以对扩增起始模板的量进行测定的难题，避免了传统检测技术样本消耗量大，实验操作繁瑣，检测灵敏度低等缺点，并具有快速、避免交叉污染等特点，可以在基因检测、基因表达、SNP分析等领域广泛应用。而TaqMan探针的采用，更增加了检测的特异性和结果的可靠性，是一种方便、快捷、经济的检测方法，尤其适用于科研、临斜口病毒流行病学监测等工作。但是，由于实时PCR技术具有很好的敏感性和特异性，因此容易出现假阳性和假阴性结果，所以实际应用时需要设置参照(Control)。通常的做法是检测目的基因的同时检测样;^fe种基因组中表达稳定的看家基因，如GAPDH、(3-actin、16或18SrRNA等。这样^t4在几个问题1、由于不同物种的看家基因序列存在差异，所以检测不同物种目的基因时，需要对每一种物种设计看家基因的引物和探针，缺乏通用性，且增加实验操作的繁瑣性和成本；2、对目的基因和看家基因分两管并行检测时，增加了试剂和人力的成本，也增加了交叉污染机会。如^同一管检测则会因为两套引物和探针之间的相互作用而降低PCR反应效率，并增加了弓1物和探针的设计难度。本发明设计一组引物及探针及相应的试剂盒，其中包括一对可以同时检测Nipah病毒和参照基因的引物和两条针对Nipah病毒和参照基因的TaqMan探针，使PCR反应体系中的引物和探针数量由通常的6条减少到4条，从而可以实现Nipah病毒和参照基因在同一管进行高效率的扩增，减少了实—g&式剂成本和操作步骤，并减少了PCR实—3她常需要避免的污染机会，很好的避免了上述问题。
发明内容本发明的目的提僻十对Nipah病毒的51物和探针及一步法实时RT-PCR检测试剂盒。采用所述试剂盒，运用一步法实时RT-PCR并结合TaqMan探针技术，适用于检测多种不同制备方法得到的、不同物种的RNA样本(如总RNA、mRNA、病毒粒等)，对Nipah病毒RNA进行特异性检测和定量分析。本发明提供的用于检测Nipah病毒RNA的一步法实时RT-PCR检测试剂盒。其原理为由固LV来源的反转录酶腦LVRTase将Nipah病毒RNA反转录为cDNA,然后^^]热启动TaqDNA聚合酶扩增cDNA。衫p反应在同一反应体系中一步完成，反应过程无需开盖4喿作。热启动TaqDNA聚合酶有效避免了非特异扩增，同时结合TaqMan探针法，对Nipah病毒进行简单快速的高灵敏度、高特异性实时检测。本发明中含有Nipah病毒检测用的FAM标记探针，同时还含有Nipah内参RNA和内参RNA检测用HEX标记探针，可以进行两色荧光双通道同时实时检测，反应过程无须开盖，反应结束无须电泳，检测快速，并极大减少了PCR产物污染所产生的假阳性结果。Nipah内参RNA的加入与检测可以排除因样品纯度等问题造成的假阴性结果。使用Nipah标准品RNA制作标准曲线，可以对Nipah病毒进行定量分析。为实现上述目的而采用的技术方案之一是提供一组针对Nipah病毒的引物和探针，包括以下序列(1)Nipah病毒的上游引物，其序列为SEQIDN01;(2)Nipah病毒的下游引物，其序列为SEQIDN02;(3)Nipah病毒的TaqMan探针，其序列为SEQIDN03;(4)内参RNA的TaqMan探针，其序列为SEQIDN04;或者包含上述序列SEQIDN01~SEQIDN04的向5，端或/和3'端延长的序列；或者与上*列SEQIDN01-SEQIDN04同源性大于85%的序列；或者上述序列SEQIDN01~SEQIDN04的磁基互补序列。本发明的技术方案之二是提供一种含有上述31物和探针序列的Nipah病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒，其组成包括OneSt印RT-PCRMasterMix、标准品RNA、内参RNA、Primer&ProbeMix、逆转录酶和水；其中所述的Primer&ProbeMix包括序列为SEQIDN01~SEQIDN04的〉^勿。试剂盒中所述OneStepRT-PCRMasterMix为含RT-PCR緩冲液、Mgcl,，dNTPs、DNA聚合酶和无RNA酶水的混合液。其中DNA聚合酶为热启动TaqDNA聚合酶。所述标准品RNA序列为SEQIDN05。所述内参RNA序列为SEQIDN06。所述水为无RNA酶水。试剂盒中各组分试剂应保存于-20°C;尽量减少反复冻融。本发明应用实时RT-PCR技术对样本中的Nipah病毒RNA进行检测，解决了传统检测技术样本消耗量大，实验操作繁瑣，检测灵敏度低等缺点；TaqMan探针的采用，更增加了检测的特异性和结果的可靠性，是一种方便、快捷、经济的检测方法，尤其适用于科研、临床和病毒流行病学监测等工作。本发明设计一组引物及探针及相应的试剂盒，其中包括一对可以同时检测Nipah病毒和参照基因的31物和两条针对Nipah病毒和参照基因的TaqMan探针，使PCR反应体系中的引物和探针数量由通常的6条减少到4条，从而可以实现Nipah病毒和参照基因在同一管进行高效率的扩增，减少了实验试剂成本和操作步骤，并减少了PCR实—^if常需要避免的污染机会。图1是;^发明采用的TaqMan探针图例。图2是RiboGreen方法的RNA定量标准曲线。图3是Nipah病毒RNAOneSt印RT-PCR扩增曲线。图4是Nipah病毒RNAOneSt印RT-PCR标准曲线。图5是内参RNAOneSt印RT-PCR扩增曲线。M实施方式下面结合M实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明讲述的内容以后，本领域的技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样属于本申请所附k利要求书所限定的范围。下列实例中未注明M^^牛的实验方法，通常按照常规^^牛，如分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。所用无才;i^学试剂和有才力容剂均符合分子生物学实验的要求。引物和探针由上海生工公司合成，pBS-T载体购自北京TIANGEN公司，謹LV逆转录酶购自美国Stratagene公司、TaqDNA聚合酶购自美国ABI公司，DNaseI、RNaseH和T7RNA多聚酶购自大连宝生物/^司，T3RNA多聚酶购自美国Promega/>司，RiboGreen和RNA定量试剂盒购自美国Invitrogen乂^司。荧光PCR仪MX3000P为美国Stratagene公司产品，荧光PCR仪Rotorgene3000为澳大利亚CorbettResearch/>司产品。1.引物和探针的设计根据GeneBank公布的Nipahvirus序列(AccessionNumber:AF212302)设计引物和探针。01igo6.O软件在Nipah病毒基因序列第113nt-1711nt(N基因)中设计和优选引物与探针，并进行质量分析。所设计的引物和探针经BlasU全索能检测出所有现有已知的Nipah病毒抹，不与Hendra病毒4朱产生阳性结果。(1)Nipah病毒的上游引物，其序列为SEQIDN01:5'-AAACATCAGCAGGAAGGC-3,(2)Nipah病毒的下游引物，其序列为SEQIDN02:5'-CCACTCTGTTCTATAGGTTCTT-3，(3)Nipah病毒的TaqMan探针，其序列为SEQIDN035，-FAM-AAATTTGCTGCAGGAGGTGTGCTCAT-DABCYL-3，(4)内参RNA的TaqMan探针，其序列为SEQIDN04:5,-HEX-CTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTC-BHQ1-3，探针设计原理如图l,其中FAM、HEX为荧iti艮告基团，DABCYL、BHQ1为焚光淬M团。2.Nipah病毒标准品RNA及内参RNA的制备和标定应用PCR方法从出^;粒(含Nipah病毒N基因)扩增一l饼列，其中含有前述弓1物和探针结合序列；将PCR产物纯化后连接pBS-T载体，测序正确后线性化载体，使用T7或T3RNA聚合酶进行体外转录，所得到产物用DNaseI和RNaseH消化后使用RNA纯化试剂盒纯化，加入适量无RNA酶水，即为标准品RNA,放-80°C冰箱备用。使用RiboGreen方法和RNA定量试剂盒(Invitrogen)制作标准曲线，将得到的标准品RNA定量，并换算成拷贝数/ul。内参RNA的制备和标定同Nipah病毒标准品RNA。用RiboGreen方法和RNA定量试剂盒制作的标准曲线如图2。标准品RNA序列为SEQIDN05:5'-GCGAAUUGGGUACCGGGCCCCCCCUCGAGGUCGACGGUAUCGAUAAGCUUGAUUACCAUGCUGGAGGAAUUGAUCAGAACAUGGCAAAUAGACUGGGACUAAGUUCAGAUCAAGUUGCAGAACUCGCUGCUGCAGUUCAGGAAACAUCAGCAGGAAGGCAAGAGAGUAAUGUUCAGGCUAGAGAGGCAAAAUUUGCUGCAGGAGGUGUGCUCAUUGGAGGCAGUGAUCAAG皿UCGAUGAAGGGGAAGAACCUAUAGAACAGAGUGGCAGACAGUCAGUUACCUUCAAAAGGGAGAUGAGUAUUUCAUCCCUUGCUAACAGUGUGCCGAGCAGUUCUGUGAGCACAUCCGGUGGGACCAGAUUGACUAAUUCAUUACUAAACCUCAGAUCAAGACUGGCUGCAAAAGCAGCAAAAGAAGCCGCCUCAUCCAAUGCAACAGAUGAUCCAGCAAUCAGCAACAGAACUCAAAUCGAAUUCCUGCAGCCCGGGGGAUCCACUAGUUCUAGAGCGGCCGCCACCGCGGUGGAGCUCCAGC而UUGUUCCCUUUAGUGAGGGUUAAUUUCGAGCUUGGCGUAAUCAUGGUCAUAGCUGUUUC-3，内参RNA序列为SEQIDN06:5，-GGAACAAAAGCUGGAGCUCCACCGCGGUGGCGGCCGCUCUAGAACUAGUGGAUCCCCCGGGCUGCAGGAAUUCGAUUAGAAAACAUCAGCAGGAAGGCAAGCCGGUCUUGUCGAUCAGGAUGAUCUGGACGAAGAGCAUCAGGGGCUCGCGCCAGCCGAACUGUUCGCCAGGCUCAAGGCGAGCAUGCCCGACGGCGAGGAUCUCGUCGUGACCCAUGGCGAUGCCUGCUUGCCGAAUAUCAUGGUAAGAACCUAUAGAACAGAGUGGUCUAAUCAAGCUCGCCGUCGACCUCGAGGGGGGGCCCGGUACCCAAUUCGCCCUAUAGUGAGUCGUAUUACAAUUCACUGGCCGUCGUUUUACAA-:3,3.OneSt印RT-PCR反应将装有2x0neSt印RT—PCRMasterMix、5xprimers&probesMix、RNA样品或标准品RNA、内参RNA、MMLV和无RNA酶水的离心管从-20。C冰箱中取出，置于冰盒上待其緩慢融化后，jl^l短暂离心，用移液器按下表中的说明在冰盒上配制OneSt印RT-PCR反应体系(参錄l)。表lOneSt印RT-PCR反应体系的配制<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>^g^应^^牛42°C30minutes,1个循环;95°C15minutes,1个循环；95°C12seconds,55。C20秒，72。C20秒，40个循环。4.敏感性和特异性连续10倍稀释Nipah标准品RNA进行敏感性分析。在2Ou1RT-PCR反应体系中按3中的^S^^牛进行OneSt印RT-PCR反应，由软件自动产生Nipah病毒OneSt印RT-PCR扩增曲线、标准曲线，见图3、4。标准曲线的线性范围为1.7xl07~1.7xl02copies/ul。内参RNA扩增曲线见图5。阴性对照(用无RNA酶水代替RNA样品)无F雄荧光信号扩增，有HEX荧光信号扩增，见图3、5。5.操作中防止假阴性和假阳性现象的措施。(1)无论是进行阴性对照、阳'1^于照实验，还是实际样品4佥测时，反应体系中都务必添加内参RNA，防止出现假阴性。(2)同时进行阴'l^t照实验，防止出现假阳性。(3)同时进行阳'1^十照实验，防止出现假阴性。6.结果判定①阴'^^j"照实验在配制实时RT-PCR反应液时，用无RNA酶水替代检测样品。对各种实验结果的判定情况说明见表2。表2阴4&于照实验结果判定<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>制作标准曲线时，用Nipah标准品RNA的各浓度梯度稀释液替4^全测样品。对各种实验结果的判定情况说明见表3。表3阳性对照实验结果判定<table>complextableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>对各种实验结果的判定情况说明见表4。表4实验样品的检测结果判定<table>complextableseeoriginaldocumentpage9</table>7.注意事项A、RNA实—3封喿作注意事项本试剂盒是利用RT-PCR反应对病毒或内参RNA样品进行扩增。RNA的纯度和完整性会影响实验结果，而制备RNA的关4^^要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等。通过以上办法可以防止实验者的汗液、唾液中的RNA酶污染。尽量使用一次性塑料器亚，若用玻璃器皿，应在使用前按下列方法进行处理用0.1%DEPC(焦碳S吏二乙酯)水溶液在37。C下浸泡12小时；然后在12(TC下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实-验。用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌(18(TC，60min.)或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可以4賴RNA实验用的一次性塑料容器)，使用的无菌7K须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌7jc都应专用，避免混用后交叉污染。使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR^^应的RNA(只需少量的RNA便可进行RT-PCR反应)。但为了保证实验的成功率，建议^^]GTC法(异硫氰酸胍法)制备高纯度RNA。为了防止RNA分解，RNA样品应尽量避免反复冻融，并尽可能4錄于-80。C环境。B、生物样本实验操作注意事项生物样;^"潜在危险，样品的采集、处理、保存、运输、检测实验均应遵循国家相应的管理规定和生物安全条例。必须做好相关的保护措施，以确保实验人员安全。本试剂盒所使用的NipahPositiveControlRNA是通过人工合成DNA后，再经体外转录得到的。使用安全，无感染性。C、PCR实验注意事项本试剂盒检测灵每嫂高，为了防止污染，实验^区操作①第一区反应液配制区。②第二区样品制备区。③第三区样品添加区^^应检测区。三个区间必须进行物理性隔离，避免人为因素造成污染。PCR实验用荧^示i^罙4十应避光^^4。当同时需要ii^亍婆t次RealTimeOneSt印RT-PCR^^应时，应先配制各种试剂的';ft^液(其中包括MasterMix、无RNA酶水、Buffer、各种酶等)，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。反应液的配制、分装应一定使用新的(无污染的)枪头、Microtube等，尽量8.试剂盒^i^实例试剂准备(1)Nipah病毒的一步法实时RT-PCR4全测试剂盒；(2)待检测RNA样品操作步骤(1)根据检测样^l史量(N)计算所需^管数(R)，以每个样本做3个重复为例，总反应管数为设需要的管数为11=(N+6+l)x3+l，其中用来估议量标准曲线的标准品RNA6管，阴性对照1管。为i^免分液过程中损失，—管备用。(2)选择20ul或50ul反应体系，根据表1所建i义体积乘以总反应管l仏，在1.5mlEP管中水上配制除标准品RNA或样品RNA外的其它组分，混匀后分装18ul或45ul反应'/c^液至PCR管，分别加入标准品RNA或样品RNA或无RNA酶水，盖好盖子，放入实时PCR仪。(3)运行PCR仪，根据表1建议的反应^^牛进行PCR反应。实时荧光PCR仪设置为同时采集F細和HEX荧光信号。(4)反应结束后利用PCR仪随机附带分析软件分析结果。(5)参照表2~表4对反应结果进行判定。本发明中涉及的核酸序列SEQIDN01，Hendra病毒的上游引物:5，-TATCAAAGAGAGTACTGCACAG-3，SEQIDN02,Hendra病毒的下游引物:5，-TCCTGAGTCTGCCTGAGGG-3，SEQIDN03,Hendra病毒的TaqMan检测探针5'-FAM-CTCATCGGAAAGAAACCCACCTAATA-DABCYL-3'SEQIDN04，内参RNA的检测探针5，-HEX-CTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTC-BHQl-3，SEQIDN05，标准品RNA:5，-GGAACAAAAGCUGGAGCUCCACCGCGGUGGCGGCCGCUCUAGAACUAGUGGAUCCCCCGGGCUGCAGGAAUUCGAUUUCUCUCGCAGACAGUGUCCCAAGCAGUUCAGUGAGUACAUCCGGAGGAACGAGAUUGACAAAUUCUCUAUUGAAUCUCAGAUCCAGAUUAGCUGCAAAGGCUAUCAAAGAGAGUACUGCACAGAGCUCAUCGGAAAGAAACCCACCUAAUAACCGCCCUCAGGCAGACUCAGGAAGGAAAGAUGACCAGGAACCCAAACCUGCCCAAAAUGAUUUGGACUUUGUUAGAGCAGACGUGUGACGC■AUCAGAAACUCAUAUAAGCUCCAAAUCAUUCUCUAUGACACACUCUUAUAAAUGAAUUCGAAGCAAUCAAGCUUAUCGAUACCGUCGACCUCGACGGGGGGGCCCGGUACCCAAUUCGCCCUAUAGUGAGUCGUAUUACAAUUCACUGGCCG酬UUUACAA-3，SEQIDN06:,内参RNA:5'-GCGAAUUGGGUACCGGGCCCCCCCUCGAGGUCGACGGUAUCGAUAAGCUUGAUUAGAUAUCAAAGAGAGUACUGCACAGAAGCCGGUCUUGUCGAUCAGGAUGAUCUGGACGAAGAGCAUCAGGGGCUCGCGCCAGCCGAACUGUUCGCCAGGCUCAAGGCGAGCAUGCCCGACGGCGAGGAUCUCGUCGUGACCCAUGGCGAUGCCUGCUUGCCGAAUAUCAUGGUCCCUCAGGCAGACUCAGGAUCUAAUCGAAUUCCUGCAGCCCGGGGGAUCCACUAGUUCUAGAGCGGCCGCCACCGCGGUGGAGCUCCAGCUUUUGUUCCCUUUAGUGAGGGUUAAUUUCGAGCUUGGCGUAAUCAUGGUCAUAGCUGUUUCC-3'权利要求1.一组针对Nipah病毒的引物和探针，包括以下序列(1)Nipah病毒的上游引物，其序列为SEQIDNO1；(2)Nipah病毒的下游引物，其序列为SEQIDNO2；(3)Nipah病毒的TaqMan探针，其序列为SEQIDNO3；(4)内参RNA的TaqMan探针，其序列为SEQIDNO4；或者包含上述序列SEQIDNO1～SEQIDNO4的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列SEQIDNO1～SEQIDNO4同源性大于85％的序列；或者上述序列SEQIDNO1～SEQIDNO4的碱基互补序列。2.—种Nipah病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒，其组成包括OneSt印RT-PCRMasterMix、标准品RNA、内参RNA、Primer&ProbeMix、逆转录酶和水；其中所述的Primer&ProbeMix序列为SEQIDN01~SEQIDN04的混合物。3.根据权利要求2所述的一种Nipah病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒，其特;[正在于，所述OneSt印RT-PCRMasterMix为含RT-PCR緩沖液、Mgch，dNTPs、DNA聚合酶和无RNA酶水的混合液。其中DNA聚合酶为热启动TaqDNA聚合酶。4.根据权利要求2所述的一种Nipah病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，所述标准品RNA序列为SEQIDN05。5.根据权利要求2所述的一种Nipah病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒，其特4正在于，所述内参RNA序列为SEQIDN06。6.根据权利要求2所述的一种Nipah病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒，其特^E在于，所述水为无RNA酶水。7.根据权利要求2所述的一种Nipah病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中各组分的量为2xOneSt印RT-PCRMasterMix1.25ml/管、标准品RNA冻干管(浓度梯度)共6管、内参RNA冻干管l管、5xPdmer&ProbeMix1.Oml/管、逆转录酶薩LV80ul/管和无RNA酶水1Qml/瓶。全文摘要本发明涉及一组引物及探针及相应的试剂盒，其中包括一对可以同时检测Nipah病毒和参照基因的引物和两条针对Nipah病毒和参照基因的TaqMan探针，使PCR反应体系中的引物和探针数量由通常的6条减少到4条，从而可以实现Nipah病毒和参照基因在同一管进行高效率的扩增，能够实现对不同物种目的基因的检测，通用性强，减少了引物和探针的数量及实验试剂成本和操作步骤，并减少了PCR实验通常需要避免的污染机会。本发明试剂盒适用于科研或临床中Nipah病毒的检测，尤其适用病毒性疾病预防控制工作中对Nipah病毒的监测。文档编号C12N15/11GK101195846SQ20071009278公开日2008年6月11日申请日期2007年9月29日优先权日2007年9月29日发明者徐鸣明,曾志磊,鹏谢申请人:谢鹏;曾志磊