专利名称：：Hendra病毒的引物和探针及一步法实时RT-PCR检测试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明专利属于生物
技术领域：
，涉及科研、临床和病毒^e病学监测等工作中使用RT-PCR方法对Hendra病毒RNA的检测和定量分析。具体是针对Hendra病毒的弓1物和探针及一步法实时RT-PCR检测试剂盒。
背景技术：
：Hendra病毒与人类疾病Hendra病毒(HendraVirus,HeV)是近年来新出现的一种副粘病毒，可引起人和动物急性中枢神经系统和呼吸系统病变。Hendra病毒原称马麻渗病毒(equinemobil—livirus，EMV),是1994年在澳大利亚昆士兰州布里斯班附近首次发现的，1995年又在麦凯(Mackay)发生。两次共造成15匹赛马和2人死亡。主要表现为呼吸道症状，^^麦0L^生的先是出现神经症状。两次爆发后，当地再也没有出现新的病例，对各种动物的血清学调查均为阴性。研究认为Hendra病毒是一种水果蝙蝠病毒，其传染性比较低。它的传播方式目前尚不清楚，可能是通过被感染动物的组织液包括尿液的直4勤妄触传播的。Hendra病毒的才企测Hendra病毒的检测方法主要有以下AJf:病#离与鉴定、血清中和il险(Serumneutralizationtest,SNT)、酶l关免疫吸附4全测(Enzyme-1inkedimmunosorbentassays,ELISA)、PCR检观停。病4^离是病毒性脑炎^5出、最重要的诊断手段。对于新发疾病病例，病毒分离是最有价值的工作，但Hendra病4^离需在生物安全4级(P4)^^牛下进行。血清中和i&验(Serumneutralizationtest,SNT)和酶联免疫吸附4企测(Enzyme-1inkedimmunosorbentassays,ELISA)均为免疫学检测方法，敏感性高，但特异性较差，并存在一定的交叉反应。制^^单克隆抗体可以增加特异性，但成本较高。PCR检测具有快速、准确的特点，且不需在P4实验室进行，可广泛用于对Hendra病毒的检测。目前已经建立的PCR检测方法有Smith等^/〃7Z，泡/戸-"〃ecfe&"/o/o尸w'i7^./力Wi^W，夕《,"一W的针对llendraM基因的RealtimePCR(Taqman^笨4十)枱，测方法，抬r测灵壽嫂比常^见RT-PCR高1000倍，该方法适合对自然感染样品或《L^于病学样本i^fr^测。实时PCR(Real—timePCR)4支术实时PCR技术是近年来j^^来的一种新型的PCR技术，它是在传统PCR反应体系的^出上添加了荧光染料或具有荧光标记的探针，将焚光信号强弱与PCR扩增的情况。实时PCR技术，解决了传统PCR难以对扩增起始模板的量进行测定的难题，避免了传统检测技术样本消耗量大，实验操作繁瑣，检测灵每tl低等缺点，并具有快速、避免交叉污染等特点，可以在基因检测、基因表达、SNP分析等领域广泛应用。而TaqMan探针的采用，更增加了检测的特异性和结果的可靠性，是一种方便、快捷、经济的检测方法，尤其适用于科研、临床和病毒;;;^于病学监测等工作。但是，由于实时PCR技术具有很好的敏感性和特异性，因此容易出现假阳性和假阴性结果，所以实际应用时需要设置参照(Control)。通常的做法是检测目的基因的同时检测样本物种基因组中表达稳定的看家基因，如GAPDH、(3-actin、16或18SrRNA等。这样就存在几个问题1、由于不同物种的看家基因序列存在差异，所以检测不同物种目的基因时，需要对每一种物种设计看家基因的引物和探针，缺^it用性，且增加实验操作的繁瑣性和成本；2、对目的基因和看家基因分两管并行检测时，增加了试剂和人力的成本，也增加了交叉污染机会。如果在同一管检测则会因为两套引物和探针之间的相互作用而降低PCR反应效率，并增加了引物和探针的设计难度。本发明设计一组引物及探针及相应的试剂盒，其中包括一对可以同时检测Hendra病毒和参照基因的引物和两条针对Hendra病毒和参照基因的TaqMan探针，使PCR反应体系中的引物和探针数量由通常的6条减少到4条，从而可以实现Hendra病毒和参照基因在同一管进行高效率的扩增，减少了实马&式剂成本和操作步骤，并减少了PCR实马組常需要避免的污染机会，很好的避免了上述问题。
发明内容本发明的目的提^4十对Hendra病毒的引物和探针及一步法实时RT-PCR检测试剂盒。采用所述试剂盒，运用一步法实时RT-PCR并结合TaqMan探针技术，适用于检测多种不同制备方法得到的、不同物种的RNA样本(如总RNA、mRNA、病毒粒等)，对Hendra病毒RNA进行特异性检测和定量分析。本发明提供的用于检测Hendra病毒RNA的一步法实时RT-PCR检测试剂盒。其原理为由謹LV来源的反转录酶謹LVRTase将Hendra病毒RNA反转录为cDNA，然后^i^热启动TaqDNA聚合酶扩增cDNA。^4p反应在同一^MZ体系中一步完成，反应过程无需开盖^喿作。热启动TaqDNA聚合酶有效i^免了非特异扩增，同时结合TaqMan探针法，对Hendra病毒进行简单快速的高灵敏度、高特异性实时检测。本发明中含有Hendra病毒检测用的FAM标记探针，同时还含有Hendra内参RNA和内参RNA检测用HEX标记探针，可以进行两色荧光双通道同时实日于检测，反应过程无须开盖，反应结束无须电泳，检测快速，并极大减少了PCR产物污染所产生的假阳性结果。Hendra内参RNA的加入与检测可以排除因样品纯度等问题造成的假阴性结果。<賴Hendra标准品RNA制作标准曲线，可以对Hendra病毒进行定量分为实现上述目的而采用的技术方案之一是提供一组针对Hendra病毒的可1物和探针，包括以下序列(1)Hendra病毒的上游引物,其序列为SEQIDN01;(2)Hendra病毒的下游引物，其序列为SEQIDN02;(3)Hendra病毒的TaqMan兮笨4十，其序列为SEQIDN03;(4)内参RNA的TaqMan探针,其序列为SEQIDN04;或者包含上述序列SEQIDN01-SEQIDN04的向5，端或/和3，端延长的序列；或者与上*列SEQIDN01~SEQIDN04同源性大于85%的序列；或者上*列SEQIDN01~SEQIDN04的磁基互补序列。本发明的技术方案之二是提供一种含有上述引物和探针序列的Hendra病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒，其组成包括OneSt印RT-PCRMasterMix、标准品RNA、内参RNA、Primer&ProbeMix、逆转录酶和水；其中所述的Primer&ProbcMix包4舌序列为SEQIDN01~SEQIDN04的混合物。试剂盒中所述OneSt印RT-PCRMasterMix为含RT-PCR緩冲液、Mgcl2,dNTPs、DNA聚合酶和无RNA酶水的混合液。其中DNA聚合酶为热启动TaqDNA聚合所述标准品RNA序列为SEQIDN05。所述内参RNA序列为SEQIDN06。所述水为无RNA酶水。试剂盒中各组分汰剂应保存于-20°C;尽量减少反复冻融。本发明应用实时RT-PCR技;^于样本中的Hendra病毒RNA进行检测，解决了传统检测技术样本消耗量大，实验操作繁瑣，检测灵敏度低等缺点；TaqMan探针的采用，更增加了检测的特异性和结果的可靠性，是一种方便、快捷、经济的检测方法，尤其适用于科研、临床和病毒流行病学监测,等工作。本发明设计一组引物及探针及相应的试剂盒，其中包括一对可以同时检测Hendra病毒和参照基因的引物和两条针对Hendra病毒和参照基因的TaqMan探针，使PCR反应体系中的引物和探针数量由通常的6条减少到4条,从而可以实现Hendra病毒和参照基因在同一管进行高效率的扩增，减少了实验试剂成本和操作步骤，并减少了PCR实^it常需要避免的污染机会。图1是本发明采用的TaqMan探针图例。图2是RiboGreen方法的RNA定量标准曲线。图3是Hendra病毒RNAOneSt印RT-PCR扩增曲线。图4是Hendra病毒RNAOneSt印RT-PCR标准曲线。图5是内参RNAOneSt印RT-PCR扩增曲线。具体实施方式下面结合M实例，进一步阐述本发明。应理解，这些实例仅用于说明本发明而不用于限定本发明的范围。此外，应理解，在阅读了本发明讲述的内容以后，本领域的技术人员可以对本发明作各种文动或修改，这些等价形式同样属于本申请所附权利要求书所限定的范围。下列实例中未注明具体条泮的实验方法，通常按照常规务f牛，如分子克隆操作手册，或按照制造厂商所建议的条件。所用无才/U匕学试剂和有扭溶剂均符合分子生物学实验的要求。引物和探针由上海生工公司合成，pBS-T载体购自北京TIANGEN公司，醒LV逆转录酶购自美国Stratagene公司、TaqDNA聚合酶购自美国ABI公司，DNaseI、RNaseH和T7RNA多聚酶购自大连宝生物/>司，T3RNA多聚酶购自美国Promega/>司，RiboGreen和RNA定量试剂盒购自美国Invitrogen/>司。荧光PCR仪MX3000P为美国Stratagene公司产品,荧光PCR仪Rotorgene3000为澳大利亚CorbettResearch/>司产品。1.引物和探针的设计才艮据GeneBank乂〉布的Hendra病毒序列(AccessionNumber:AF017149)设计引物和探针。使用01igo6.O软件在Hendra病毒基因序列第113nt-1711nt(N基因)中设计和优选引物与探针，并进行质量分析。所设计的引物和探针经Blast检索能检测出所有现有已知的Hendra病毒林，不与Nipah病毒抹产生阳性结果。(1)Hendra病毒的上游引物，其序列为SEQIDN01:5,-TATCAAAGAGAGTACTGCACAG-3，(2)Hendra病毒的下游引物,其序列为SEQIDN02:5，-TCCTGAGTCTGCCTGAGGG-3'(3)Hendra病毒的TaqMan探针,其序列为SEQIDNO35，-F細-CTCATCGGAAAGAAACCCACCTAATA-DABCYL-3，(4)内参RNA的TaqMan探针，其序列为SEQIDN04:5，-HEX-CTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTC-BHQl-3，探针设计原理如图l,其中F扁、HEX为荧iti艮告基团，DABCYL、BHQ1为焚光淬i基团。2.Hendra病毒标准品RNA及内参RNA的制备和标定应用PCR方法从出^t粒(含Hendra病毒N基因)扩增一,饼列，其中含有前述？1物和探针结合序列；将PCR产物纯化后连接pBS-T载体，测序正确后线性化载体，使用T7或T3RNA聚合酶进行体外转录，所得到产物用DNaseI和RNaseH消化后使用RNA纯化试剂盒纯化，加入适量无RNA酶水，即为标准品RNA，放-80。C冰箱备用。使用RiboGreen方法和RNA定量试剂盒(Invitrogen)制作标准曲线，将得到的标准品RNA定量，并换算成拷贝数/ul。内参RNA的制备和标定同Hendra病毒标准品RNA。用RiboGreen方法和RNA定量试剂盒制作的标准曲线如图2。标准品RNA序列为SEQIDN05:5,-GGAACAAAAGCUGGAGCUCCACCGCGGUGGCGGCCGCUCUAGAACUAGUGGAUCCCCCGGGCUGCAGGAAUUCGAUUUCUCUCGCAGACAGUGUCCCAAGCAGUUCAGUGAGUACAUCCGGAGGAACGAGAUUGACAAAUUCUCUAUUGAAUCUCAGAUCCAGAUUAGCUGCAAAGGCUAUCAAAGAGAGUACUGCACAGAGCUCAUCGGAAAGAAACCCACCUAAUAACCGCCCUCAGGCAGACUCAGGAAGGAAAGAUGACCAGGAACCCAAACCUGCCCAAAAUGAUUUGGACUUUGUUAGAGCAGACGUGUGACGCUUAAUCAGAAACUCAUAUAAGCUCCAAAUCAUUCUCUAUGACACACUCUUAUAAAUGAAUUCGAAGCAAUCAAGCUUAUCGAUACCGUCGACCUCGACGGGGGGGCCCGGUACCCAAUUCGCCCUAUAGUGAGUCGUAUUACAAUUCACUGGCCGUCGUUUUACAA-3'内参RNA序列为SEQIDN06:5，-GCGAAUUGGGUACCGGGCCCCCCCUCGAGGUCGACGGUAUCGAUAAGCUUGAUUAGAUAUCAAAGAGAGUACUGCACAGAAGCCGGUCUUGUCGAUCAGGAUGAUCUGGACGAAGAGCAUCAGGGGCUCGCGCCAGCCGAACUGUUCGCCAGGCUCAAGGCGAGCAUGCCCGACGGCGAGGMJCUCGUCGUGACCCAUGGCGAUGCCUGCUUGCCGAAUAUCAUGGUCCCUCAGGCAGACUCAGGAUCUAAUCGAAUUCCUGCAGCCCGGGGGAUCCACUAGUUCUAGAGCGGCCGCCACCGCGGUGGAGCUCCAGCUUUUGUUCCCUUUAGUGAGGGUUAAUUUCGAGCUUGGCGUAAUCAUGGUCAUAGCUGUUUCC-3，3.OneStepRT-PCR^Jl将装有2x0neSt印RT—PCRMasterMix、5xPrimers&ProbesMix、RNA样品或标准品RNA、内参RNA、画LV和无RNA酶水的离心管从-20。C冰箱中取出，置于冰盒上待其緩慢融化后，^ii短暂离心，用移液器按下表中的说明在冰盒上配制OneSt印RT-PCR反应体系(参JL41)。表lOneSt印RT-PCR反应体系的配制<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>^_应^^牛42°C30minutes,1个循环;95°C15minutes,1个循环；95°C12seconds,55。C20秒，72。C20秒，40个循环。4.敏感性和特异性连续10倍稀释Hendra标准品RNA进行壽文感性分析。在20ulRT-PCR反应体系中按3中的反应^^牛进行OneSt印RT-PCR反应，由软件自动产生Hendra病毒OneSt印RT-PCR扩增曲线、标准曲线，见图3、4。标准曲线的线性范围为2.6xl07~2.6x102copies/ul。内参RNA扩增曲线见图5。阴'^十照(用无RNA酶水代替RNA样品)无FAM荧光信号扩增，有HEX荧光信号扩增，见图3、5。5.操作中防止假阴性和假阳性现象的措施。(1)无论是进行阴'1^十照、阳'l^十照实验，还是实际样品检测时，反应体系中都务必添加内参RNA，防止出现假阴性。(2)同时进行阴'l^于照实验，防止出现假阳性。(3)同时进行阳'I^t照实验，防止出现假阴性。6.结果判定①阴性对照实—验在配制实时RT-PCR反应液时，用无RNA酶水替^i企测样品。对各种实验结果的判定情况说明JL42。表2阴'^^"照实验结果判定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>②阳'1~&于照实验制作标准曲线时，用Hendra标准品RNA的各浓度梯度稀释液替^i全测样对各种实验结果的判定情况说明见表3。表3阳'^^十照实验结果判定<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table>③实-睑才羊品的枱，测对各种实验结果的判定情况说明见表4。表4实验样品的检测结果判定<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>7.注意事项A、RNA实验操作注意事项本试剂盒是利用RT-PCR反应对病毒或内参RNA样品进行扩增。RNA的纯度和完整性会影响实验结果，而制备RNA的关^t^要抑制细胞中的RNA分解酶和防止所用器具及试剂中的RNA分解酶的污染。因此，在实验中必须采取以下措施戴一次性干净手套；使用RNA操作专用实验台；在操作过程中避免讲话等。通过以上办法可以防止实-验者的汗液、唾液中的RNA酶污染。尽量^JI]一次性塑料器皿，若用玻璃器皿，应在4顿前按下列方法进行处理用0.1%DEPC(焦碳S吏二乙酯)水溶液在3rC下浸泡l2小时；然后在12(TC下高压灭菌30分钟以除去残留的DEPC。RNA实验用的器具建议专门使用，不要用于其它实验。用于RNA实验的试剂，须使用干热灭菌(18(TC，60min.)或使用上述方法进行DEPC水处理灭菌后的玻璃容器盛装(也可以使用RNA实验用的一次性塑料容器)，使用的无菌7^须用0.1%的DEPC处理后再进行高温高压灭菌。RNA实验用的试剂和无菌水都应专用，避免混用后交叉污染。使用简单的RNA纯化方法即可获得满足于RT-PCR反应的RNA(只需少量的RNA便可进行RT-PCR反应)。但为了保证实验的成功率，建议^i]GTC法(异硫氰酸胍法)制备高纯度RNA。为了防止RNA分解，RNA样品应尽量避免反复冻融，并尽可能保存于-8(TC环境。B、生物样本实验操作注意事项生物样M潜在危险，样品的采集、处理、保存、运输、检测实验均应遵循国家相应的管理规定和生物安全条例。必须做好相关的保护措施，以确保实验人员安全。本试剂盒所使用的Nipah阳'1^于照RNA是通itA工合成DNA后，再经体外转录得到的。卩M安全，无感染性。C、PCR实验注意事项本试剂盒检测灵^^复高，为了防止污染，实-验^区才喿作①第一区反应液配制区。②第二区样品制备区。③第三区样品添加区A^应检测区。三个区间必须进行物理性隔离，避免人为因素造成污染。PCR实验用荧光标i己4笨4十应避光j^4。、当同时需要进行数次RealTimeOneSt印RT-PCR^jS时，应先配制各种试剂的混合液(其中包括MasterMix、无RNA酶水、Buffer、各种,)，然后再分装到每个反应管中。这样，可使所取的试剂体积更准确，减少试剂损失，避免重复分取同一试剂。同时也可以减少实验操作或实验样品之间产生的误差。反应液的配制、分装应一定^i]新的(无污染的)枪头、Microtube等，尽量避免污染。8.试剂盒使用实例试剂准备(1)Hendra病毒的一步法实时RT-PCR^r测试剂盒；(2)待检测RNA样品操作步骤(1)根据检测样;^l欠量(N)计算所需A^管数(R)，以每个样本做3个重复为例，总反应管数为设需要的管数为R=(N+6+l)x3+l，其中用来做定量标准曲线的标准品RNA6管，阴性对照1管。为避免分液过程中损失，一管备用。(2)选择20ul或50ul反应体系，根据表l所建议体积乘以总反应管凄仏，在1.5mlEP管中冰上配制除标准品RNA或样品RNA外的其它组分，混匀后分装18ul或45ul反应混合液至PCR管，分别加入标准品RNA或样品RNA或无RNA酶水，盖好盖子，放入实时PCR仪。(3)运行PCR仪，根据表1建议的反应^^牛进行PCR反应。实时荧光PCR仪设置为同时采集FAM和HEX焚光信号。(4)反应结束后利用PCR仪随机附带分析软件分析结果。(5)参照表2~表4对反应结果进行判定。本发明中涉及的核,列SEQIDN01,Hendra病毒的上游引物:5，-TATCAAAGAGAGTACTGCACAG-3，SEQIDN02,Hendra病毒的下游引物5，-TCCTGAGTCTGCCTGAGGG-3，SEQIDN03，Hendra病毒的TaqMan;f企测一果4十5，-FAM-CTCATCGGAAAGAAACCCACCTAATA-DABCYL-3，SEQIDN04,内参RNA的检测探针5'-HEX-CTGGACGAAGAGCATCAGGGGCTC-BHQ1-3，SEQIDN05,标准品RNA:5，-GGAACAAAAGCUGGAGCUCCACCGCGGUGGCGGCCGCUCUAGAACUAGUGGAUCCCCCGGGCUGCAGGAAUUCGAUUUCUCUCGCAGACAGUGUCCCAAGCAGUUCAGUGAGUACAUCCGGAGGAACGAGAUUGACAAAUUCUCUAUUGAAUCUCAGAUCCAGAUUAGCUGCAAAGGCUAUCAAAGAGAGUACUGCACAGAGCUCAUCGGAAAGAAACCCACCUAAUAACCGCCCUCAGGCAGACUCAGGAAGGAAAGAUGACCAGGAACCCAAACCUGCCCAAAAUGAUUUGGACUUUGUUAGAGCAGACGUGUGACGCUUAAUCAGAAACUCAUAUAAGCUCCAAAUCAUUCUCUAUGACACACUCUUAUAAAUGAAUUCGAAGCAAUCAAGCUUAUCGAUACCGUCGACCUCGACGGGGGGGCCCGGUACCCAAUUCGCCCUAUAGUGAGUCGUAUUACAAUUCACUGGCCGUCGUUUUACAA-3，SEQID,内参RNA:5，-GCGAAUUGGGUACCGGGCCCCCCCUCGAGGUCGACGGUAUCGAUAAGCUUGAUUAGAUAUCAAAGAGAGUACUGCACAGAAGCCGGUCUUGUCGAUCAGGAUGAUCUGGACGAAGAGCAUCAGGGGCUCGCGCCAGCCGAACUGUUCGCCAGGCUCAAGGCGAGCAUGCCCGACGGCGAGGAUCUCGUCGUGACCCAUGGCGAUGCCUGCUUGCCGAAUAUCAUGGUCCCUCAGGCAGACUCAGGAUCUAAUCGAAUUCCUGCAGCCCGGGGGAUCCACUAGUUCUAGAGCGGCCGCCACCGCGGUGGAGCUCCAGCUUUUGUUCCCUUUAGUGAGGGUUAAUUUCGAGCUUGGCGUAAUCAUGGUCAUAGCUGUUUCC-3，权利要求1.一组针对Hendra病毒的引物和探针，包括以下序列(1)Hendra病毒的上游引物，其序列为SEQIDNO1；(2)Hendra病毒的下游引物，其序列为SEQIDNO2；(3)Hendra病毒的TaqMan探针，其序列为SEQIDNO3；(4)内参RNA的TaqMan探针，其序列为SEQIDNO4；或者包含上述序列SEQIDNO1～SEQIDNO4的向5’端或/和3’端延长的序列；或者与上述序列SEQIDNO1～SEQIDNO4同源性大于85％的序列；或者上述序列SEQIDNO1～SEQIDNO4的碱基互补序列。2.—种Hendra病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒，其组成包括OneStepRT-PCRMasterMix、标准品RNA、内参RNA、Primer&ProbeMix、逆转录酶和水；其中所述的Primer&ProbeMix为序列SEQIDN01~SEQIDN04的混合物。3.根据权利要求2所述的一种Hendra病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒，其特;^正在于，所述OneSt印RT-PCRMasterMix为含RT-PCR緩冲液、Mgcl;.，dNTPs、DNA聚合酶和无RNA酶水的混和液，其中DNA聚合酶为热启动TaqDNA聚合酶。4.才艮据权利要求2所述的一种Hendra病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒,其特征在于，所述标准品RNA序列为SEQIDN05。5.根据权利要求2所述的一种Hendra病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒,其特4i^于，所述内参RNA序列为SEQIDN06。6.根据权利要求2所述的一种Hendra病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒,其特;^正在于，所述的水为无RNA酶水。7.根据权利要求2所述的一种Hendra病毒一步法实时RT-PCR检测试剂盒，其特征在于，试剂盒中各组分的量为2xOneSt印RT-PCRMasterMix1.25nil/管、标准品RNA冻干管(浓度梯度)共6管、内参RNA冻干管l管、5xprimer&ProbeMixl.(kl/管、逆转录酶腦LV80ul/管和无RNA酶水10ml/瓶。全文摘要本发明涉及一组引物及探针及相应的试剂盒，其中包括一对可以同时检测Hendra病毒和参照基因的引物和两条针对Hendra病毒和参照基因的TaqMan探针，使PCR反应体系中的引物和探针数量由通常的6条减少到4条，从而可以实现Hendra病毒和参照基因在同一管进行高效率的扩增，能够实现对不同物种目的基因的检测，通用性强，减少了引物和探针的数量及实验试剂成本和操作步骤，并减少了PCR实验通常需要避免的污染机会。本发明试剂盒适用于科研或临床中Hendra病毒的检测，尤其适用病毒性疾病预防控制工作中对Hendra病毒的监测。文档编号C12N15/11GK101250591SQ20071009278公开日2008年8月27日申请日期2007年9月29日优先权日2007年9月29日发明者徐鸣明,曾志磊,鹏谢申请人:谢鹏;曾志磊