一种纳米蚕丝丝素蛋白粉的制备方法

专利名称：一种纳米蚕丝丝素蛋白粉的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种利用蚕丝丝素制备纳米级的丝素蛋白粉的方法，属于功 能纳米材料技术领域。
背景技术：
功能纳米材料是纳米材料科学中最富有活力的领域，它可以应用于化工、 生物、能源、环境等高科技领域，产生深远的影响并具有广阔的应用前景。 如纳米生物材料可以应用在组织工程、再生医学材料以及生物相容界面材料 等领域。在生物相容界面材料的应用时，其主要是通过层层组装技术，实现
包括蛋白质、DNA和聚电解质等在温和的条件下在众多基材上的组装，不仅实 现了对天然生物材料的结构模拟，而且可以获得表面层状生物材料，解决一 些材料的生物相容性关键问题，可以应用于如细胞生长支架、药物缓释材料、 酶及仿酶载体以及生物传感器材料等范围。而纳米化工材料，可以通过化学 反应或物理添加赋予化工材料如降解、催化、消臭抗菌等功能。
正因为功能纳米材料具有极大的应用价值，如何制备及应用功能纳米材 料便成了专家、学者的研究热点。蚕丝丝素是由特殊的氨基酸构成，其具备 了作为生物、纺织、精细化工材料的很大的应用价值，对其纳米级丝素蛋白 粉的制备工艺及方法研究极为活跃。目前工业上尚无纳米级丝素蛋白粉制备 方法，现今工业上有采用机械粉碎法制备丝素蛋白粉的情况，但受到粉碎机 械技术的制约，只能制得微米级颗粒，而微米级颗粒与纳米级颗粒，其应用 范围及应用效果不一致。对于丝素蛋白粉纳米级颗粒的制备，目前均处在实 验室阶段。比如申请号为"200610039191.8"、发明名称为"固定化酶的丝 素纳米颗粒及其制备方法"的中国发明专利申请就公开了这样的一种方法，
它采用了水溶性丝素溶液与能与水混溶的质子型有机溶剂或极性非质子型有 机溶剂混合，形成乳白色的球形微粒分散在有机溶剂体系中，得到纳米丝素 颗粒混合液或悬浮液，去除有机溶剂，得到丝素纳米颗粒悬浮液或丝素纳米
粉末，制得的纳米颗粒约为35 125nm。该方法中，作为纤维蛋白的丝素蛋白 不溶或难溶于水，而该专利中未指出水溶性丝素溶液的制备方法，同时在水 溶性丝素溶液与能与水混溶的质子型有机溶剂或极性非质子型有机溶剂混合 过程中，丝素溶出低，损耗大，所以存在制备难度大、收率低、难以工业化 的不足。还有一件中国发明专利(专利号为"200410016856.4"、发明名称为 "蚕丝蛋白纳米微球及其制备方法")运用生物纳米技术，使蚕丝蛋白质在适 当条件下发生自组装形成纳米微球，制得的纳米颗粒约为80 3000nm。该方 法也存在制备难度大，难以工业化的不足，同时该专利还存在纳米颗粒大小 差异大、不均匀的问题。
专利号为"02138016.3"、发明名称为"一种生物活性肽-丝素肽的制备 方法"的中国发明专利也公开了一种制备丝素蛋白的方法，它以下脚蚕茧或 废蚕丝为原料，经0. 3-1. 0% (w/v)的Na2C03溶液精练后，用20-60% (w/w)的 CaCL溶液加热溶解得溶丝液，在pH2. 5-12.0， 30-80。C下用蛋白酶对溶丝液 进行酶水解反应，再用纳滤技术脱除酶解液中高浓度的CaCl2盐，对浓縮液喷 雾干燥即得。该方法虽然能制得丝素蛋白粉末，但颗粒大，无法达到纳米级， 这是因为CaCl2这种金属盐，在溶解丝素时Ca离子会被络合包裹于丝素中， 即便进行水溶液透析也无法将Ca离子除去，而该工艺是未除去CaCl2的情况 下进行的酶解反应，除了丝素-Ca离子络合物的形成影响了酶解反应、降低了 酶解效果以外，CaCl2在整个酶解系统的存在还将使其Ca离子与蛋白酶形成络 合结构，导致酶失去活性从而使酶解反应难以正常进行。即先酶解后除CaCh 的工艺流程，是无法达到制备纳米级丝素蛋白粉末的目的的。

发明内容
针对现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种利用蚕丝丝素
制备纳米级的丝素蛋白粉的方法，本方法工艺简单易行，适合工业化、大批 量生产，所得蛋白粉末颗粒均匀，大小适中，利于应用。
本发明的目的是这样实现的 一种纳米蚕丝丝素蛋白粉的制备方法，其 特征在于，它包括以下歩骤
① 、将纯净的丝素原料加入足量的盐溶液中进行盐溶得到溶丝液，所述
盐溶液为50 60wt%NaSCN或由LiBr、 CH30H和H刀三者按重量比40 60: 22 42: 10 30配成的有机无机混合溶剂；
② 、将第一步得到的溶丝液进行透析，得到丝素蛋白水溶液；
③ 、将第二步得到的丝素蛋白水溶液进行酶解，酶解用蛋白酶为a—糜 蛋白酶或者中性蛋白酶；
、将酶解液干燥收集即得丝素蛋白粉。
所述丝素原料的制备方法为将废弃茧壳或废丝用醚类化合物浸泡以除 去其中的蜡质物(废弃茧壳浸泡48小时，废丝浸泡24小时)，用水洗涤干 燥后再用乙醇煮沸1小时除去碳水化合物及灰分，经洗净后再在水中煮沸以 脱去丝胶，将得到的纯净丝素用水洗涤干燥备用。
所述酶解方法为将丝素蛋白水溶液在70 80。C水浴中加热5min后取出 并调整pH至酶解所需值，加入酶解所需量的蛋白酶，搅拌水解，经过一定反 应时间后将酶失活停止反应。
如果酶解用蛋白酶为a —糜蛋白酶，则pH值用25%氨溶液调至5. 5 7. 5， 加入蛋白酶在37。C土3。C下搅拌水解约1 1. 5h后，将溶液放入-4(TC冻库中 让酶失活停止反应。
如果酶解用蛋白酶为中性蛋白酶，则pH值用25%氨溶液调至6. 0 7. 5， 加入蛋白酶在50 55t:下搅拌水解约1 1. 5h后，将溶液放入-4CTC冻库中 让酶失活停止反应。
相比现有的制备方法，本发明具有如下有益效果
1、由于a -糜蛋白酶或者中性蛋白酶具有对丝素蛋白的酶切功能强、可 均匀酶切丝素蛋白的优点，故得到的丝素蛋白颗粒均匀，大小适中，利于应
用，颗粒大小为80 500nm。本纳米丝素蛋白小于人皮肤毛孔尺寸，可以作为 化妆品添加剂。
2、 本方法工艺简单，易于实现，单次制备量大，所用原料为废弃蚕丝， 为下脚原料再利用范畴，具备了在功能材料领域的应用前景。
3、 本方法选用的盐溶液和酶解蛋白酶价格便宜，制备成本低。
4、 本发明收率高，可达65 80%。
基于上述优点，因此本发明可进行大批量、工业化生产。
实验表明，本方法制备的纳米丝素蛋白粉末具有抗菌性能，可以作为生
物材料应用，也可以作为功能性纤维及其添加物质，同时也可作为食品添加、
精细化工制品添加材料加以应用。


图1-本发明使用a —糜蛋白酶酶解得到的蛋白粉末颗粒； 图2-本发明使用中性蛋白酶酶解得到的蛋白粉末颗粒； 图3-试样周围培养金黄葡萄球菌后的抑菌效果图。
具体实施例方式
本发明是用50 60wt%NaSCN盐溶液或LiBr、 CH:,OH和H20 (重量比40 60: 22 42: 10 30)三者配成的混合溶剂将丝素蛋白溶解，透析浓縮后再 用a -糜蛋白酶或者中性蛋白酶进行酶解细化制备颗粒均匀的纳米丝素蛋白 粉末，其纳米颗粒大小为80 500nm。用本方法制得的纳米级蚕丝丝素蛋白粉 末颗粒均匀，工艺简单，所用原料为废弃蚕丝，为下脚原料再利用范畴，具 备了在生物材料等功能材料领域的应用前景。
以下结合实施例详细介绍本发明。
1.首先得到丝素纤维原料
将废弃茧壳或废丝用醚类化合物浸泡以除去其中的蜡质物(废弃茧壳浸 泡48小时，废丝浸泡24小时)，用水洗涤干燥后再用乙醇煮沸1小时除去
碳水化合物及灰分，经洗净后再在水中煮沸以脱去丝胶，将得到的纯净丝素 用水洗涤干燥备用。用胭脂红苦味酸溶液法检验丝胶脱净后，将得到的纯净 丝素用水洗涤干燥备用。
丝素的制备不局限于上述方法，也可以采用传统的其它丝素制备方法得到。
2. 丝素蛋白水溶液的制备
溶解丝素纤维的盐溶液可以是按重量比40 60: 22 42: 10 30 (最佳 配比为50: 32: 10)配制LiBr、 CH3OH和H20三者形成的有机无机混合溶剂， 也可以是50 60wt%NaSCN盐溶液。将上步骤中得到的纯净丝素纤维溶解于上 面配制的溶剂中。盐溶液的量以能充分溶解丝素纤维即可。
3. 经透析、浓縮后待用。
4. 再生丝素蛋白粉末酶解(酶解可以采用两种蛋白酶， 一种是a—糜蛋 白酶， 一种是中性蛋白酶)
(1) a—糜蛋白酶的酶解经定溶及测定，本发明所用丝素蛋白肽溶液 浓度均在2 5mg/ml范围内。将装有丝素蛋白水溶液的烧杯放在70 8(TC水 浴中加热5min后取出，溶液用25。/。氨溶液调整pH至5. 5 7. 5，按照丝素蛋 白a—糜蛋白酶重量比为10:1 (实际中也可以采用其它比例加入，只要酶 的加入量能确保丝素蛋白粉末充分酶解)的比例加入a—糜蛋白酶，在37"C 下搅拌水解约1.5h后，将溶液直接放入-4(TC冻库中让酶失活停止反应。酶 解后丝素蛋白粉末用离心机离心后在6(TC下蒸发48小时得到干燥粉末。收率 约65 80%。粉末的尺寸观察通过场发射扫描电镜进行，观察到其为80nm至 500nm之间大小球型粉末，见图一，a和b为不同位置的截图。
(2)中性蛋白酶的酶解经定溶及测定，本发明所用丝素蛋白肽溶液浓度 均在2 5mg/ml范围内。将装有丝素蛋白水溶液的烧杯放在70 8(TC水浴中 加热5min后取出，溶液用25呢氨溶液调整pH至6.0 7. 5左右，按照丝素蛋 白中性蛋白酶重量比为10:1 (实际中也可以采用其它比例加入，只要酶的 加入量能确保丝素蛋白粉末充分酶解)的比例加入中性蛋白酶，在50 55°C
下搅拌水解约1.5h后，将溶液直接放入-4(TC冻库中让酶失活停止反应。酶 解后丝素蛋白粉末用离心机离心后在6(TC下蒸发48小时得到干燥粉末。收率 约65 70%。粉末的尺寸观察通过场发射扫描电镜进行，观察到其为80mn至 500nm之间大小球型粉末，见图二， a和b为不同位置的截图。
丝素蛋白粉末除了上述的离心后蒸发干燥收集得到外，还可以采用冷冻 干燥法收集。
抗菌实验
使用牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、水来制作培养基。琼脂粉经溶解灭菌后 接种金黄色葡萄球菌，麦康凯琼脂接种大肠杆菌。
将培养好的大肠杆菌和金黄色葡萄球菌取出，涂布方式将两种细菌分别 接种到培养皿，将丝蛋白肽粉末、锌酞菁粉末和锌酞菁-丝素蛋白肽粉末分别 接种培养18小时，观察细菌的生长情况。整个操作均在无菌操作台进行。
实验表明，本发明制备的纳米蚕丝丝素蛋白粉具备较强的抗菌性能，如 图三所示，其中图a为50 60wt。/。NaSCN溶解得到的丝素蛋白肽粉末抗菌图， 图b为酶解后的丝素蛋白纳米粉末抗菌图。
权利要求
1、一种纳米蚕丝丝素蛋白粉的制备方法，其特征在于它包括以下步骤①、将纯净的丝素原料加入足量的盐溶液中进行盐解得到溶丝液，所述盐溶液为50～60wt％NaSCN或由LiBr、CH3OH和H2O三者按重量比40～60∶22～42∶10～30配成的有机无机混合溶剂；②、将第一步得到的溶丝液进行透析，得到丝素蛋白水溶液；③、将第二步得到的丝素蛋白水溶液进行酶解，酶解用蛋白酶为α-糜蛋白酶或者中性蛋白酶；④、将酶解液干燥收集即得丝素蛋白粉。
2、 根据权利要求1所述的纳米蚕丝丝素蛋白粉的制备方法，其特征在于 将废弃茧壳或废丝用醚类化合物浸泡以除去其中的蜡质物，废弃茧壳浸泡48 小时，废丝浸泡24小时，用水洗涤干燥后再用乙醇煮沸l小时除去碳水化合 物及灰分，经洗净后再在水中煮沸以脱去丝胶，将得到的纯净丝素用水洗涤 干燥备用。
3、 根据权利要求1或2所述的纳米蚕丝丝素蛋白粉的制备方法，其特征 在于所述酶解方法为将丝素蛋白水溶液在70 8(TC水浴中加热5min左右 后取出并调整pH至酶解所需值，加入酶解所需量的蛋白酶，搅拌水解后使酶 失活停止反应。
4、 根据权利要求3所述的纳米蚕丝丝素蛋白粉的制备方法，其特征在于所述酶解用蛋白酶为a—糜蛋白酶，pH值用氨溶液调至5. 5 7.5，加入蛋白 酶在37。C土3。C下搅拌水解约1 1. 5h后，将溶液放入-4(TC冻库中让酶失活停止反应。
5、 根据权利要求3所述的纳米蚕丝丝素蛋白粉的制备方法，其特征在于: 所述酶解用蛋白酶为中性蛋白酶，pH值用氨溶液调至6.0 7.5，加入蛋白 酶在50 55。C下搅拌水解约1 1. 5小时后，将溶液放入-4(TC冻库中让酶失活停止反应。
全文摘要
本发明公开了一种纳米蚕丝丝素蛋白粉的制备方法，即用50～60wt％NaSCN或LiBr∶CH₃OH∶H₂O(重量比40～60∶22～42∶10～30)混合溶剂溶解丝素蛋白——用水透析浓缩——用α-糜蛋白酶或中性蛋白酶酶解，最后用冷冻干燥法或经离心后蒸发干燥收集。本方法得到的纳米颗粒大小为80～500nm。本项目具有制备工艺简单易行，可大批量、工业化生产的优点，同时得到的纳米丝素蛋白粉末颗粒均匀、大小适中，利于应用。
文档编号C12P21/02GK101168763SQ200710092969
公开日2008年4月30日 申请日期2007年11月9日 优先权日2007年11月9日
发明者郝雪菲, 陈忠敏 申请人:重庆工学院