专利名称：一种双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES、双歧杆菌-ETEC CFA/I重组载体及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体PBES以及由其 构建的双歧杆菌-ETEC CFA I重组载体、口服活疫苗及其用途。
技术背景 产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenic五"/2en'c/n'a co//， ETEC)是发 展中国家引起急性腹泻的主要病原菌之一，在发展中国家的旅行者腹泻中，约 40%至70%由ETEC所致。在我国，二十世纪九十年代仅对广州地区的感染性腹 泻病人的流行病学调查发现， 一年中由ETEC引起的腹泻就有202%。。其中5岁 以下儿童为319%。， ETEC已知至少有两种明确的毒力因子，即定居因子抗原 (colonization factor antigen, CFA)，[又称为粘附素(adhesin)]和肠毒素。依靠 定居因子粘附在小肠粘膜细胞表面是ETEC致病的先决条件，然后才产生肠毒 素发挥作用，引起类似霍乱样的急性腹泻综合症。实验证明，ETEC若失去产生 CF的能力，进入动物或人肠道的ETEC由于不能定居不会引起腹泻。可见，如 果发明针对ETEC定居因子的疫苗，免疫后的抗定居因子抗体就可以阻断ETEC 对小肠粘膜的吸附和定居，进而就能阻断ETEC引发腹泻性疾病。
已有几种方法制造死菌苗，其中包括由纯化定居因子(如CFA I等)组成的 菌苗、由LT或LT-ST类毒素组成的菌苗和表达霍乱毒素B亚单位的食用转基因 植物菌苗。由瑞典哥德堡大学研究人员研制的最成功的菌苗是将霍乱毒素rBS 与能表达在发展中国家具有最大流行病学重要性的定居因子(CFAI、 CFAII和 CFAIV)的5株福马林灭活ETEC相结合。美国马里兰大学疫苗开发中心研究 人员正在进行活菌苗研制。其菌苗研制策略是利用减毒活志贺菌作为ETEC菌 毛抗原和LT抗原表达的载体。因此，这种构建物既可预防志贺菌又可预防ETEC。但无论哪种疫苗，均存在不同程度的副作用。经专利查新证实，国内目 前关于人用ETEC定居因子I疫苗的专利未见公布
发明内容
本发明的目的就是针对现有技术的不足，提供一种双歧杆菌-大肠
杆菌穿梭表达载体pBES以及由其构建的双歧杆菌-ETEC CFA I重组载体、双歧
杆菌-ETEC CFA/I重组载体口服活疫苗及其用途。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案 一种双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES，其特征在于所述的pBES载体
是由GenBank号为U13856的pGEX-5x-l为骨架改造而来。 该载体的构建步骤如下
第一步，用卡那霉素抗性基因替换pGEX-5x-l质粒1344-2220 nt的 Ampicillin抗性基因的序列区，即(a)先用PCR方法从GenBank号为EU233623 的质粒pEASY-Tl上扩增1203-2114 nt片段，得到卡那霉素抗性基因，正向PCR 引物为agtagacgtcctggtaag gttgggaag ，位置在1203-1219 nt， 5'端添加酶切 位点(下划线，下文标示相同)，反向引物为acgtcagtggctgcaattcagaag aactcgtc， 位置在2114-2085 nt, 5'端添加J/wNl酶切位点；PCR扩增条件为95°C 4 min， 经95。C 40Sec、 55°C 30Sec、 72°C lmin循环扩增25次；(b)将上述PCR纯化 产物和pGEX-5x-l质粒分别用JWII和AwNl双酶切，回收酶切后的PCR产物 和pGEX-5x-l大片段按l: 2混合连接，转化大肠杆菌DH5a，挑取在卡那霉素
抗性平板上生长阳性单克隆，再一次在卡那霉素抗性平板上划线纯化，同时在 青霉素平板上划线培养而不能生长的单菌落一定是阳性菌落，然后测序确认。
第二步，以第一步所得到阳性菌落中的质粒为模板，用高保真TaqDNA聚 合酶通过PCR扩增，以四环素tetO启动子替换pGEX-5x-l质粒183-932上的
Ptac启动子，同时删除pGEX-5x-l质粒上3301-4420nt的Laclq片段，引物pFl 为pGEX-5x-l上的多克隆位点序列，pRl为LacIq上游序列，引物序列如下 pF 1: attaggatccccgaattcccg， 5，端添加万譜HI酶切位点5 pRl: tcgaccgcggattcaccacc ctgaattgac， 5'端添加酶切位点，PCR扩增条件为95°C 4 min,经95。C 40 Sec、 52°C 30Sec、 72°C 1 min循环扩增30次，PCR产物用5amHI和双 酶切备用。
同时，用5awHI和5WcI1酶切切取由上海生物工程技术公司合成的tetO启 动子序歹!j， 其序列如下tcgaccgcggactggccgtcgttttactccctatcagtg atag agattgacatc cctatcagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacctgaggagggatccctag， 其中ctggcc gtcgtttta为M13测序引物序列；然后将i5a/wHI和SwII酶切后的质粒与tetO启 动子的PCR酶切产物连接转化，在卡那霉素抗性平板上挑取单克隆，电泳鉴定 后，测序确认后，同时制备A^II酶切产物备用。
第三步，合成GenBank号为AF139129的长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白B 序列及其复制起始位点，其蛋白编码序列位置在4-1018nt，序列如下
g^^g^gtacttagtacaaaaggggagcgaacttagtacaaaaggggagcgaacttagtacaaaagg
cacctggacgtgctcatggcgatcgcttcaagggtgagggagaagggcacggccacggtggagttctc
ttcgcgctgttcacgaagttcgtcaccgacccgcaggaggcgactctcgcggttggggtcaacgagga gttcgcgttcctgctcaacgacctgaccagccagttcacgcgcttcgagctggccgagttcgccgacc tcaagagcaagtacgccaaggagttctacaggcgcgccaagcagtaccgcagctcgggaatctggaag gaacagggtcgtgctgaagacgatcgccgaagagtgtgggcctctccttggcctgaagatcgagcgcc
tggaggccggg肪atgccgtttcctgcgcgtttgacgcgcgcaaccgcgaacatcatgacgtc;其中 下划线部分是合成时在两端添加AatII酶切位点，序列片段由上海生工合成，测 序确认无误；用PCR大量扩增该序列，正向引物为pRl: gcgacgtcgtacttagtacaa aagggga， 5'端添力口 Aat II酶切位点，反向弓l物为pR2: gcgacgtcatgatgttcgcggttgc g ， 5'端添加AatII酶切位点，PCR扩增条件为95°C 3 min,再经95。C 50 Sec、 54°C 40Sec、 72°C lmin的30次循环扩增；PCR产物经Aat II酶切后连接到第 二步所得的质粒对应的AatII酶切位点，连接转化，在卡那霉素抗性平板上挑取 单克隆，质粒用电泳检测后测序确认,并选择KJ36片段按顺时针方向连接的为标 准序列报道的载体，其全序列如下ccgcggactggccgtcgttttactccctatcagtga tagagattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacctgaggag ggatccccgaattcccgggtcgactcgagcggccgcatcgtgactgactgacgatctgcctcgcgcgt
ggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagcca
tttttataggttaatgtcatgataataatggtttcttagacgtcgtacttagtacaaaaggggagcga ac 11 agt acaaaaggggagc g肪c 11 agt acaaaaggggagc gaac 11 ag t acaaaaggggagc gaac
cagttcacgcgcttcgagctggccgagttcgccgacctcaagagcaagtacgccaaggagttctacag gcgcgccaagcagtaccgcagctcgggaatctggaagatcagccgcgatgagttctgccgactgcttg
gttcacgttcgcccgcgagacccctccggtgatcgacgccaggcccgtggaggcgaggaagacggacg gcgacggc幼gggccattggacgagcgtggcggggtacggcgaggtgttcacgaccacggagctgttc
ttgacgcgcgcaaccgcgaacatcatgacgtcctggtaaggttgggaagccctgcaaagtaaactgga tggctttcttgccgccaaggatctgatggcgcaggggatcaagatctgatcaagagacaggatgagga
ggcgcccggttctttttgtcaagaccgacctgtccggtgccctgaatgaactgcaggacgaggcagcg cggctatcgtggctggccacgacgggcgttccttgcgcagctgtgctcgacgttgtcactgaagcggg aagggactggctgctattgggcgaagtgccggggcaggatctcctgtcatcccaccttgctcctgccg
gaccaccaagcgaaacatcgcatcgagcgagcacgtactcggatggaagccggtcttgtcgatcagga
ccgacggcgaggatctcgtcgtgacccatggcgatgcctgcttgccgaatatcatggtggaaaatggc cgcttttctggattcatcgactgtggccggctgggtgtggcggaccgctatcaggacatagcgttggc
ccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcgg tcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagata
gcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagt
cctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaat。 至此，pBES载体构建成功，全长3016bp。
该穿梭表达载体具有如下特征(1)以SacII酶切位点序列(ccgcgg)的 第一个C为起始核苷酸，该载体有3016bp; (2) 7-103bp为M13测序引物和tetO 启动子序列区。(3) 104-150bp为多克隆位点，依次含有^a/zHI， fcoRI， 5feal， 5^7I，
和#"1五个单酶切位点。(4) 548-1400bp为长双歧杆菌的R印B(复制蛋白 B)的编码序列。(5) 1541-2336bp为卡那霉素抗性基因的编码序列。因此，该载 体与现有的双歧杆菌表达载体相比，具有下列优势(1)由于含有双歧杆菌本 身的复制蛋白及其上游的复制起始位点，使其更适合在双歧杆菌中自主复制和 稳定存在；(2)该表达载体删除了氨苄青霉素抗性基因，而选择了副作用小、 临床使用率很低的卡那霉素抗性基因作为筛选标记，使得PBES具有更大的安全 性，而现有的表达载体中含有氨苄青霉素抗性基因作为选择标记，而根据美国FDA的规定，在基因工程疫苗生产中不能使用青霉素(Penicillin)或其它P-内酰胺类的抗生素作筛选， 一方面，因为这些抗生素的使用是造成潜在痕量过 敏反应发生的重要来源，另一方面，含抗药基因的质粒会导致氨苄青霉素抗药 性在临床致病菌中散播，对公共卫生安全具有潜在的隐患。
上述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES的用途，其特征在于所述的 双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES用于以双歧杆菌为受体菌的所有外源基 因的表达。
作为双歧杆菌的通用表达载体，pBES用于在双歧杆菌中表达所有有价值的 外源基因，这类基因即可以使口服疫苗的候选抗原基因，也可以是基因治疗的 基因如P53基因、各种细胞因子基因、前体药物降解基因如TK基因等等。
用上述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES构建的双歧杆菌-ETEC CFA I 重组载体，其特征在于将ETEC CFAI基因连接到双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表 达载体pBES中，其构建方法如下
a)将产肠毒素大肠杆菌H10407中的CFAI基因，縮写为ETEC CFAI，经PCR 聚合酶链式反应，扩增并经测序证明无误后用Sa/1和A^I双酶切后连接到双歧 杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES的和双酶切位点上，构建成转化载 体pBES-ETEC CFA I; PCR正向引物为tgggagctcaggaggaaatatgca ，反向引物为: tggcgcggccgctagagtgtttgact; PCR扩增条件为95°C 5 min,再经95°C 50 Sec、 56°C 30Sec、 72°C 5 min的25次循环扩增。
b)以大肠杆菌DH5a为受体菌，用电转化法将质粒转化到受体菌中；转化条 件为13KV、 200Q、 25pF;所述的转化的大肠杆菌由中国典型培养物保藏中心 保藏，保藏号为CCTCCNo: M206117的大肠杆菌DH5a-pBES-CFAI。
优选的，所述的ETEC CFA/I为人的ETEC CFAI。
上述双歧杆菌-ETEC CFAI重组载体构建的口服活疫苗，其特征在于按以 下步骤构建-
a)从保藏号为CCTCC No: M206117的大肠杆菌DH5a-pBES-CFA I中提取 和纯化pBES-CFAI质粒。
b) 将双歧杆菌培养至对数生长期即OD6。。为0.6-0.7时，经去离子水配制的 灭菌10%甘油处理后，以双歧杆菌为受体菌，用电转化法将纯化的pBES-CFAI 质粒载体转化到受体菌中；转化条件为15KV、 200Q、 25pF;所述的双歧杆菌 为受体菌为由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No: M203050 的两歧双歧杆菌SHQ006。
c) 再将转化处理后的双歧杆菌先在无抗菌素的MRS液体培养基中复苏 60-120 min，然后在含50|iig/ml卡那霉素的MRS固体培养基上培养，选择抗性 菌落，从而获得转ETEC CFA/I基因的双歧杆菌，PCR和SDS-PAGE鉴定后的 阳性克隆即为ETEC CFA/I重组载体的种子菌。
d) 将上述经转基因转化处理后的双歧杆菌复苏后，涂布于含卡那霉素的抗 性MRS培养基上厌氧培养48小时，然后挑取单一的抗性菌落于抗性MRS液体 培养基中增菌培养，经PCR证实CFA I阳性的双歧杆菌单菌落再次涂布接种于 含卡那霉素的抗性MRS培养基平板上厌氧培养48小时；然后再挑取单一菌落 于常规液体培养基中培养，如此反复接种培养至继代培养不低于15代时，经PCR 检测证实CFA/I仍然阳性的克隆，可以作为种子菌用于大规模液体接种扩增培 养，培养物经离心浓縮，进一步制备成转ETEC CFAI基因的双歧杆菌-ETEC CFA I重组载体口服活疫苗制剂。
该疫苗的优点是服用方便，口服的双歧杆菌进入肠道后首先结合在小肠粘 膜上皮的双歧杆菌特异性受体上繁殖，有利于CFAI蛋白表达后被上皮细胞及时 和有效地吸收提呈，增加抗原的生物利用效率。同时，双歧杆菌的大量繁殖， 有利于改善肠道微生态，抵抗病源菌的定居和繁殖，加速腹泻等症状的愈好。
上述双歧杆菌-ETEC CFAI重组载体口服活疫苗的应用，其特征在于制 成发酵乳制剂、片剂和胶囊制剂的双歧杆菌-ETECCFAI重组载体口服活疫苗， 用于预防和治疗ETEC引发腹泻性疾病。
发酵乳制剂制作简便、服用方便、活菌数量大、菌体活性高，可以随时制 备和使用，但缺点是运输困难、存放时间短、需要冷链运输和存放，不便于大 规模、长时间储存。片剂和胶囊剂型可以进行微囊化处理、服用方便、运输和 存放简单，不需要冷链运输和存放，便于大规模生产、较长时间储存，是企业 化生产和流通的主要剂型。相对于发酵乳剂型，片剂和胶囊中的活菌数量要低、 菌体活性也有所下降，这是他的弱点。但无论哪种剂型，其生产流程简便，发 酵后不需要对抗原蛋白进行繁琐复杂的纯化，即使是片剂和胶囊也只作离心、 洗涤等简单处理即可收集菌体成型，有利于简化生产环节和节约生产成本。
本发明就是运用基因工程方法将ETEC的CFA I基因连接到发明人自己构 建的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES中，通过质粒转化方法把ETEC的 CFAI基因导入到人体益生菌-双歧杆菌中制成双歧杆菌(5zy^o6acfen^w平)为 受体菌的ETECCFAI重组载体口服活疫苗，即双歧杆菌-ETECCFAI重组载体 口服活疫苗。
双歧杆菌属于革兰氏阳性菌，是人类肠道的正常微生物菌群，能通过细胞 表面的磷壁酸吸附在小肠上皮细胞表面的受体上，近年来被广泛用于肠道疾病 的辅助治疗(如丽珠肠乐等)和乳制品生产，非常适宜在肠粘膜上原位表达肠 道病原菌的中和抗原，菌体本身可以起到免疫增强剂的作用，是构建肠道病原
菌口服亚单位活疫苗的理想受体菌。因此，本发明可以通过基因工程手段让双
歧杆菌替代传统的ETEC疫苗中CFAI的受体菌，既解决了活疫苗构建的载体系
统的安全性问题，又发挥了双歧杆菌抑制肠道病原菌的微生态效应。
图1是本发明的大肠杆菌-双歧杆菌穿梭表达载体pBES的结构示
意其中，(1) PtetO是四环素tetO启动子序列区。(2)MCS是多克隆位点 序列区，依次含有BamHI,EcoRI,SmaI,SalI,XhoI和NotI五个单酶切位点。(3) R印B(序列位置548-1400bp)为长双歧杆菌的复制蛋白编码序列。(4) kanR (序 列位置1541-2336bp)为卡那霉素抗性基因的编码序列。
图2是本发明pBES载体连接了绿色荧光蛋白基因(EGFP)后在 双歧杆菌中的表达的情况在488mn的荧光显微镜的图像；
图3是本发明pBES-CFA/I及其PCR产物的电泳图； 图中的M泳道DNAMarker(lKb ladder); 泳道1: pBES-CFA/I质粒；泳 道2-3 :从pBES-CFA/I质粒上用PCR扩增的CFAI片段(5014bp)，说明CFAI
被连接到载体上。
图4是本发明pBES-CFA/I及其表达产物的SDS-PAGE电泳图； 其中，泳道1:蛋白质Marker; 泳道2-4 : pBES-CFA/I在双歧杆菌中表 达的CFAI蛋白(依次为接种后4小时、8小时、IO小时的表达量)；泳道5: pBES空质粒在双歧杆菌中表达情况；泳道6:无质粒的双歧杆菌中表达情况。 说明CFA I成功地在双歧杆菌中实现了表达，并且确定了 8-10小时为表达的高 峰期。
具体实施方式
下面结合附图对本发明作进一步的说明。 实施例l
一种双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES，其特征在于所述的pBES载体 是由GenBank号为U13856的pGEX-5x-l为骨架改造而来。
该载体的构建步骤如下
第一步，用卡那霉素抗性基因替换pGEX-5x-l质粒1344-2220 nt的 Ampicillin抗性基因的序列区，即(a)先用PCR方法从GenBank号为EU233623 的质粒pEASY-Tl上扩增1203-2114 nt片段，得到卡那霉素抗性基因，正向PCR 引物为agtagacgtcctggtaag gttgggaag ，位置在1203-1219 nt, 5'端添加4artl酶切 位点，反向引物为acgt^^gigg^gcaattcagaag aactcgtc，位置在2114-2085 nt， 5，端 添加J/wNl酶切位点；PCR扩增条件为95°C 4min,经95。C 40 Sec、 55°C 30Sec、 72°C 1 min循环扩增25次；(b)将上述PCR纯化产物和pGEX-5x-l质 粒分别用A^II和J/wNl双酶切，回收酶切后的PCR产物和pGEX-5x-l大片段 按l: 2混合连接，转化大肠杆菌DH5ot，挑取在卡那霉素抗性平板上生长阳性 单克隆，再一次在卡那霉素抗性平板上划线纯化，伺时在青霉素平板上划线培 养而不能生长的单菌落一定是阳性菌落，然后测序确认。
第二步，以第一步所得到阳性菌落中的质粒为模板，用高保真T叫DNA聚 合酶通过PCR扩增，以四环素tetO启动子替换pGEX-5x-l质粒183-932上的 Ptac启动子，同时删除pGEX-5x-l质粒上3301-4420nt的Laclq片段，引物pFl 为pGEX-5x-l上的多克隆位点序列，pRl为LacIq上游序列，引物序列如下 pFl: attaggatccccgaattcccg， 5'端添力Q 5amHI酶切位点；pRl: tcgaccgcggattcaccacc ctgaattgac， 5，端添加SacII酶切位点，PCR扩增条件为95。C 4min,经95。C 40 Sec、 52°C 30Sec、 72°C 1 min循环扩增30次，PCR产物用B"wHI和双 酶切备用。
同时，用^mHI和酶切切取由上海生物工程技术公司合成的tetO启
动子序歹!l ，其序歹!J如下tcgagggggga|ctggccgtcgtttta|ctccctatcagtg atag agattgacatc
cctatcagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacctgaggagggg^ctag ，其中ctggccg
tcgtttta为M13测序引物序列(方框所示)；然后将^w;HI和SflcII酶切后的质粒 与tetO启动子的PCR酶切产物连接转化，在卡那霉素抗性平板上挑取单克隆， 电泳鉴定后，测序确认后，同时制备^^II酶切产物备用。
第三步，合成GenBank号为AF139129的长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白 B序列，其蛋白编码序列位置在4-1018nt，合成时在两端添加AatII酶切位点， 序列片段由上海生工合成，测序确认无误；用PCR大量扩增该序列，正向引物 为pRl: gcgg^gtacttagtacaaaagggga， 5'端添加Aat II酶切位点，反向引物为 pR2: gc^g^atgatgttcgcggttgcg ， 5'端添加Aat II酶切位点，PCR扩增条件为 95°C 3min,再经95。C 50 Sec、 54°C 40Sec、 72°C lmin的30次循环扩增；PCR 产物经Aat II酶切后连接到第二步所得的质粒对应的Aat II酶切位点，连接转化， 在卡那霉素抗性平板上挑取单克隆，质粒用电泳检测后测序确认,并选择KJ36 片段按顺时针方向连接的为标准序列报道的载体，至此，PBES载体构建成功， 全长3016bp。载体结构见说明书附图l。 实施例2
双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES的用途，其特征在于所述的双歧 杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES用于以双歧杆菌为受体菌的所有外源基因的 表达。
以绿色荧光蛋白(EGFP)基因在pBES中的表达为例说明如下 a)从pEGFP-Nl质粒上将EGCFP基因用如下引物扩增，pEGFPf: aattggatc gatggtgagcaagggcgaggagc， 5，端设计Bam HI酶切位点，pEGFPr: tgggcggccgc ttacttgtacagctcgtc， 5'端设计Not I酶切位点。
b)用Bam HI和Not I分别酶切EGFP的PCR产物和pBES质粒，按2: 1 比例混合后连接,转化大肠杆菌DH5a，在卡那霉素抗性平板上挑取单克隆，用 EGFP引物进行PCR检测阳性克隆，该阳性克隆记作pBES-EGFP，提取 pBES-EGFP质粒备用。
c) 将双歧杆菌培养至对数生长期即OD6。。为0.6-0.7时，经去离子水配制的 灭菌10%甘油处理后，以双歧杆菌为受体菌，用电转化法将纯化的pBES-EGFP 质粒载体转化到受体菌中；转化条件为15KV、 200Q、 25pF;所述的双歧杆菌 为受体菌为由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No: M203050 的两歧双歧杆菌SHQ006。
d) 再将转化处理后的双歧杆菌先在无抗菌素的MRS液体培养基中复苏 60-120 min，然后在含50|ig/ ml卡那霉素的MRS固体培养基上培养，选择抗性 菌落，从而获得转EGFP基因的双歧杆菌，在488nm荧光显微镜下可以明显见 到发绿色荧光的菌体。表达效果见说明书附图2。
实施例3
双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES构建的双歧杆菌-ETEC CFAI重组载 体，将ETECCFAI基因连接到双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES中，其构 建方法如下
将产肠毒素大肠杆菌H10407中的CFAI基因，縮写为ETEC CFAI，经PCR 聚合酶链式反应，扩增并经测序证明无误后用和A^I双酶切后连接到双歧 杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES的&/I和I双酶切位点上，构建成转化载 体pBES-ETEC CFA/I; PCR正向引物为tgggagctcaggaggaaatatgca ，反向引物为 tggcgcggccgctagagtgtttgact; PCR扩增条件为95°C 5 min，再经95°C 50 Sec、 56°C 30Sec、 72°C 5 min的25次循环扩增。
b)以大肠杆菌DH5a为受体菌，用电转化法将pBES-ETEC CFA I质粒转化 到受体菌中；转化条件为13KV、 200Q、 25pF;所述的被转化的大肠杆菌由中
国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No: M206117的大肠杆菌 DH5a-pBES-CFAI;验证结果见说明书附图3。
所述的ETEC CFA/I为人的ETEC CFAI。 实施例4
权利要求3所述的双歧杆菌-ETEC CFA I重组载体构建的口服活疫苗，其 特征在于按以下步骤构建-
a)从保藏号为CCTCC No: M206117的大肠杆菌DH5oc-pBES-CFA I中提取 和纯化pBES-CFAI质粒。
b) 将双歧杆菌培养至对数生长期即OD6。Q为0.6-0.7时，经去离子水配制的 灭菌10%甘油处理后，以双歧杆菌为受体菌，用电转化法将纯化的pBES-CFAI 质粒载体转化到受体菌中；转化条件为15KV、 200Q、 25pF;所述的双歧杆菌 为受体菌为由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No: M203050 的两歧双歧杆菌SHQ006。
c) 再将转化处理后的双歧杆菌先在无抗菌素的MRS液体培养基中复苏 60-120 min，然后在含50|ng/ ml卡那霉素的MRS固体培养基上培养，选择抗性 菌落，从而获得转ETEC CFAI基因的双歧杆菌，PCR和SDS-PAGE鉴定后的 阳性克隆即为ETEC CFAI重组载体的种子菌。
d) 将上述经转基因转化处理后的双歧杆菌复苏后，涂布于含卡那霉素的抗 性MRS培养基上厌氧培养48小时，然后挑取单一的抗性菌落于抗性MRS液体 培养基中增菌培养，经PCR证实CFA I阳性的双歧杆菌单菌落再次涂布接种于 含卡那霉素的抗性MRS培养基平板上厌氧培养48小时；然后再挑取单一菌落 于常规液体培养基中培养，如此反复接种培养至继代培养不低于15代时，经PCR 检测证实CFA I仍然阳性的克隆，可以作为种子菌用于大规模液体接种扩增培
养，验证结果见说明书附图3。
e)将作为种子菌的双歧杆菌-ETECCFAI接种在含卡那霉素的抗性MRS液 体培养中，在接种后第4、 8、 IO小时分别取样，培养物经离心浓縮后，进一步 经SDS-PAGE检测CFA I蛋白的表达情况，确证重组载体口服活疫苗能够表达 CFAI，结果见说明书附图4。 实施例5
所述双歧杆菌-ETEC CFAI重组载体口服活疫苗的应用，其特征在于制 成双歧杆菌发酵乳制剂、胶囊等剂型的双歧杆菌-ETEC CFA I重组载体口服活 疫苗，用于预防和治疗ETEC引发腹泻性疾病。
双歧杆菌发酵乳制剂的制作方法如下
a) 配方鲜牛奶 52%、白砂糖7.8%、磷酸二氢钠0.2%、水 40°/。、卡
那霉素0.005%;操作时先用热水溶解白糖和磷酸二氢钠，搅拌均匀，随后与 鲜奶混合，通过双联过滤器进入离心净乳机，除去杂质。
b) 12(TC瞬时杀菌，时间10秒，为最大限度地保持牛奶的养分，物料进入 平衡缸，经离心式卫生泵送人板式热交换器，经过预热、高温杀菌、保温、冷 却，达到杀菌的目的。
c) 在高压均质机中进行均质，两次均质均采用两段均质。 一段均质压力为 70kgf / cm2， 二段均质压力为30kgf / cm2。
d) 接种及发酵首先接种5%转化双歧杆菌发酵菌种液，37'C培养9小时 左右，终止酸度为804。
e) 罐装按5mL规格进行玻璃安培罐装，真空封口， 4'C保藏。
f)微生物指标活性双歧杆菌数》l(^cfu / mL，大肠菌群数〈30cfii / 100mL， 致病菌不得检出。
实施例6
双歧杆菌胶囊制剂的制作方法如下
a) MRS液体培养基配方蛋白胨1.0% 、葡萄糖0.1% 、酵母汁0.1%、 牛肉膏1.0%、 K2HPO4 0.2%、 L-半胱氨酸盐酸盐0.02% 、卡那霉素0.005%、 蒸馏水1000ml， pH值调至7.0，搅拌混合均匀，随后通过双联过滤器进入离心 净乳机，除去杂质。
b) 120'C瞬时杀菌，时间10秒，为最大限度地保持培养基的养分，物料进 入平衡缸，经离心式卫生泵送人板式热交换器，经过预热、高温杀菌、保温、 冷却，达到杀菌的目的。
c) 在高压均质机中进行均质，两次均质均采用两段均质。 一段均质压力为 70kgf / cm2， 二段均质压力为30kgf / cm2。
d) 接种及发酵首先接种5Q/^转化双歧杆菌发酵菌种液，37"C培养9小时 左右，终止酸度为80G丁。
f) 将上述双歧杆菌发酵液离心(3500 g， 15min， 4'C)收集菌体，洗涤，重 新悬浮在生理盐水中，调整菌体最终浓度》1.0X 101Q个/ ml。
g) 将上述浓縮菌液与海藻酸钠溶液混合均匀后加入植物油中，在搅拌器上 搅拌至形成一个无明显水相的均匀混浊乳状液。然后快速地加入CaCl2水溶液， 直至w / O乳状液被破坏，形成海藻酸钙胶粒。胶粒通过轻柔地离心(400 g， 10min) 收集，洗涤，真空冷冻干燥。
h) 装填到胶囊壳中，铝塑薄膜厌氧密封，4'C保存。
i) 微生物指标活性双歧杆菌数》109cfU / g，大肠菌群数〈30cfU / 100mL，致病菌不得检出。
权利要求
1、一种双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES，其特征在于所述的pBES载体是由GenBank号为U13856的pGEX-5x-1为骨架改造而来；该载体的构建步骤如下第一步，用卡那霉素抗性基因替换pGEX-5x-1质粒1344-2220nt的Ampicillin抗性基因的序列区，即(a)先用PCR方法从GenBank号为EU233623的质粒pEASY-T1上扩增1203-2114nt片段，得到卡那霉素抗性基因，正向PCR引物为agtagacgtcctggtaag gttgggaag，位置在1203-1219nt，5’端添加AatII酶切位点，反向引物为acgtcagtggctgcaattcagaag aactcgtc，位置在2114-2085nt，5’端添加AlwN1酶切位点；PCR扩增条件为95℃ 4min，经95℃ 40Sec、55℃30Sec、72℃ 1min循环扩增25次；(b)将上述PCR纯化产物和pGEX-5x-1质粒分别用AatII和AlwN1双酶切，回收酶切后的PCR产物和pGEX-5x-1大片段按1∶2混合连接，转化大肠杆菌DH5α，挑取在卡那霉素抗性平板上生长阳性单克隆，再一次在卡那霉素抗性平板上划线纯化，同时在青霉素平板上划线培养而不能生长的单菌落一定是阳性菌落，然后测序确认；第二步，以第一步所得到阳性菌落中的质粒为模板，用高保真Taq DNA聚合酶通过PCR扩增，以四环素tetO启动子替换pGEX-5x-1质粒183-932上的Ptac启动子，同时删除pGEX-5x-1质粒上3301-4420nt的LacIq片段，引物pF1为pGEX-5x-1上的多克隆位点序列，pR1为LacIq上游序列，引物序列如下pF1attaggatccccgaattcccg，5’端添加BamHI酶切位点；pR1tcgaccgcggattcaccaccctg aattgac，5’端添加SacII酶切位点，PCR扩增条件为95℃ 4min，经95℃ 40Sec、52℃ 30Sec、72℃ 1min循环扩增30次，PCR产物用BamHI和SacII双酶切备用；同时，用BamHI和SacII酶切切取由上海生物工程技术公司合成的tetO启动子序列，其序列如下tcgaccgcggactggccgtcgttttactccctatcagtg atag agattgacatccctatcagtgatagagatactgagcacatcagcaggacgcactgacctgaggagggatccctag，其中ctggccgtcgtttta为M13测序引物序列；然后将BamHI和SacII酶切后的质粒与tetO启动子的PCR酶切产物连接转化，在卡那霉素抗性平板上挑取单克隆，电泳鉴定后，测序确认后，同时制备Aat II酶切产物备用；第三步，合成GenBank号为AF139129的长双歧杆菌KJ36质粒的复制蛋白B序列，其蛋白编码序列位置在4-1018nt，合成时在两端添加Aat II酶切位点，序列片段由上海生工合成，测序确认无误；用PCR大量扩增该序列，正向引物为pR1gcgacgtcgtacttagtacaaaagggga，5’端添加Aat II酶切位点，反向引物为pR2gcgacgtcatgatgttcgcggttgcg，5’端添加Aat II酶切位点，PCR扩增条件为95℃ 3min，再经95℃ 50Sec、54C 40Sec、72℃ 1min的30次循环扩增；PCR产物经Aat II酶切后连接到第二步所得的质粒对应的Aat II酶切位点，连接转化，在卡那霉素抗性平板上挑取单克隆，质粒用电泳检测后测序确认，并选择KJ36片段按顺时针方向连接的为标准序列报道的载体；至此，pBES载体构建成功，全长3016bp。
2、权利要求1所述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES的用途，其特征 在于所述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES用于以双歧杆菌为受体菌 的所有外源基因的表达。
3、权利要求1所述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES构建的双歧杆菌 -ETEC CFA/I重组载体，其特征在于将ETEC CFA/I基因连接到双歧杆菌-大 肠杆菌穿梭表达载体pBES中，其构建方法如下a)、将产肠毒素大肠杆菌H10407中的CFA/I基因，縮写为ETEC CFM，经 PCR聚合酶链式反应，扩增并经测序证明无误后用6^/1和WW I双酶切后连接到 双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES的S"ZI和油f I双酶切位点上，构建成转 化载体pBES-ETECCFA/I; PCR正向引物为tgggagctcaggaggaaatatgca，反向引 物为tggcgcggccgctagagtgtttgact; PCR扩增条件为95°C 5 min，再经95°C 50 Sec、 56°C 30Sec、 72°C 5 min的25次循环扩增;b)以大肠杆菌DH5oc为受体菌，用电转化法将质粒转化到受体菌中；转化条 件为13KV、 200Q、 25pF;所述的转化的大肠杆菌由中国典型培养物保藏中心 保藏，保藏号为CCTCC No: M206117的大肠杆菌DH5a-pBES-CFAI 。
4、 根据权利要求3所述的双歧杆菌-ETEC CFA/I重组载体，其特征在于 所述的ETEC CFA/I为人的ETEC CFA/1。
5、 权利要求3所述的双歧杆菌-ETEC CFA/I重组载体构建的口服活疫苗，其特征在于按以下步骤构建a)、从保藏号为CCTCC No: M206117的大肠杆菌DH5a-pBES-CFA I中提 取和纯化pBES-CFA I质粒；b) 、将双歧杆菌培养至对数生长期即OD6oo为0.6-0.7时，经去离子水配制 的灭菌10%甘油处理后，以双歧杆菌为受体菌，用电转化法将纯化的pBES-CFA I质粒载体转化到受体菌中；转化条件为15KV、 200Q、 25pF;所述的双歧杆 菌为受体菌为由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCCNo: M203050 的两歧双歧杆菌SHQ006;c) 、再将转化处理后的双歧杆菌先在无抗菌素的MRS液体培养基中复苏 60-120 min，然后在含50ng/ml卡那霉素的MRS固体培养基上培养，选择抗性 菌落，从而获得转ETEC CFA/I基因的双歧杆菌，PCR和SDS-PAGE鉴定后的 阳性克隆即为ETEC CFA/I重组载体的种子菌；d) 将上述经转基因转化处理后的双歧杆菌复苏后，涂布于含卡那霉素的抗 性MRS培养基上厌氧培养48-72小时，然后挑取单一的抗性菌落于抗性MRS 液体培养基中增菌培养，经PCR证实CFA/I阳性的双歧杆菌单菌落再次涂布接 种于含卡那霉素的抗性MRS培养基平板上厌氧培养48-72小时；然后再挑取单 一菌落于常规液体培养基中培养，如此反复接种培养至继代培养不低于15代时， 经PCR检测证实CFA/I仍然阳性的克隆，可以作为种子菌用于大规模液体接种 扩增培养，培养物经离心浓縮，进一步制备成转ETEC CFA/I基因的双歧杆菌 -ETEC CFA/I重组载体口服活疫苗制剂。
6、权利要求5所述双歧杆菌-ETEC CFA/I重组载体口服活疫苗的应用， 其特征在于制成乳酸发酵制剂、片剂和胶囊制剂的双歧杆菌-ETEC CFA/I重 组载体口服活疫苗，用于预防和治疗ETEC引发腹泻性疾病。
全文摘要
本发明公开了一种双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES以及由其构建的双歧杆菌-ETEC CFA/I重组载体、双歧杆菌-ETEC CFA/I重组载体口服活疫苗及其用途。所述的pBES载体是由GenBank号为U13856的pGEX-5x-1为骨架改造而来；所述的双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES用于以双歧杆菌为受体菌的所有外源基因的表达。用上述双歧杆菌-大肠杆菌穿梭表达载体pBES构建的双歧杆菌-ETEC CFA/I重组载体；所述的ETEC CFA/I为人的ETEC CFA/I。上述双歧杆菌-ETEC CFA/I重组载体构建的口服活疫苗；上述双歧杆菌-ETEC CFA/I重组载体口服活疫苗的应用，用于预防和治疗ETEC引发腹泻性疾病。本发明可以通过基因工程手段让双歧杆菌替代传统的ETEC疫苗中CFA/I的受体菌，既解决了活疫苗构建的载体系统的安全性问题，又发挥了双歧杆菌抑制肠道病原菌的微生态效应。
文档编号C12N15/63GK101182532SQ20071009297
公开日2008年5月21日 申请日期2007年11月13日 优先权日2007年11月13日
发明者宋方洲, 马永平 申请人:重庆医科大学