专利名称：一种催化烟酸制备6-羟基烟酸的方法及其所用菌株的制作方法
技术领域：
本发明涉及6-羟基烟酸的制备方法及其所用菌林和菌林的筛选方法。特 别涉及一种利用微生物菌林催化烟酸制备6-羟基烟酸的方法，以及该微生物菌 林的筛选方法。
背景技术：
6-羟基烟酸是医药、材料行业的重要化学中间体，例如，在农药生产领域， 常用的吡啶曱胺类农药的需求量在逐步增长，在吡啶曱胺类农药的生产中需要 用到6-氯烟酸，由于直接在用氯取代第六位的氢比较困难，所以一般通过中间 步骤，先用羟基取代烟酸第六位的氢，然后再用氯取代羟基，生产6-氯烟酸。 目前国内6-羟基烟酸的生产还主要靠化学法，而化学法生产有很多的缺点，如 副产物多，而且产物与副产物很难分离，从而使得6-羟基烟酸的生产成本很高。 而且化学法生产还造成了对环境的污染。
国内外在微生物法转化烟酸生产6-羟基烟酸方面已经做出了一些工作，例入人们发现Achromobacfer xylosoxidans (Kulla, Eur. Pat. Appl. No. 0152949,1985 ), Psudomonas Fluorescena TN5 ( Toru Nagsawa. Biosci Biotech Biochem， 1994, 58 (4), 665-668. ), Serratia marcescens IF012648 (Byungserk Hurh. J Ferment Bioeng ， 1994, 77 (4), 382-385 ) 等菌抹 具有催化烟酸生产6-羟基烟酸的能力。但在这些菌林中有时会存在培养困难、 转化速度慢、产物会进一步降解等问题。因此，筛选出易培养、催化活性高、 产物转化率高的新菌林具有非常重要的意义。
发明内容
本发明提供一种催化烟酸制备6-羟基烟酸的方法及其所用菌株和菌林 的筛选方法，利用微生物催化烟酸直接转化为6-羟基烟酸；
本发明还提供一种催化烟酸制备6-羟基烟酸的菌株，该菌抹催化活性 高，催化反应稳定，对催化环境适应性强；同时，本发明还提供了催化烟酸 制备6-羟基烟酸的菌抹的筛选方法。
为了实现上述目的，本发明提供了一种催化烟酸制备6-羟基烟酸的方 法，包括用假单胞菌(尸"^/omo"w) sp.BK-1 CGMCC No. 2191悬浮液催化溶液 中的烟酸转化为6-羟基烟酸。
其中，所述假单胞菌悬浮液为用磷酸緩沖液或水悬浮该假单胞菌sp.BK-l。 所述溶液中的烟酸的浓度保持在O. 5%以上。催化反应过程在搅拌下进行。催化 反应过程中pH值为6. 0~8. 0。催化反应完成后调节pH值小于2. 0，收集固体 6-羟基烟酸。
本发明还提供一种催化烟酸制备6-羟基烟酸的菌抹，该菌抹为假单胞菌 CRse"^W2o"os) sp. BK-1 CGMCC No. 2191。
本发明还提供一种催化烟酸制备6-羟基烟酸的菌株的筛选方法，包括
用富集培养基富集培养土壤微生物；富集培养温度为25~35°C，pH 6.0~ 7. 0;所述富集培养基包括酵母粉2 ~ 5g/L，蛋白胨5 ~ 10g/L, NaCl 5 ~ 10g/L, 烟酸5 10g/L， pH 6. 0~7. 0;
富集培养后用筛选培养基进行菌林筛选；筛选培养温度为25~35°C; pH 6.0~7.0;所述筛选培养基包括烟酸5 10g/L， ( NH4) 2S04 1. 0 ~ 2. Og/L, MgSO,7H20 0.1 ~0.2g/L， NaH2P04'H20 0. 2 ~ 0. 5g/L， CaCl2.2H20 0. 2 ~ 0. 5g/L， 〖2线0. 2~0. 5g/L, pH 6. 0~7. 0;
筛选培养得到的菌株在固体培养基上涂布，挑取单菌落分别在筛选培养基 中培养，检测催化烟酸为6-羟基烟酸的酶活，将检测到酶活的菌抹放入复筛培 养基进行复筛，再次检测所述酶活，选取酶活最高的菌株；
所述固体培养基包括酵母粉2 ~ 5g/L,蛋白胨5 ~ 10g/L, NaCl 5 ~ 10g/L,烟酸5 10g/L,琼脂15 20g/L, pH 6.0-7.0;
所述复筛培养基包括烟酸10g， NaCl 10g，蛋白胨10g，酵母提取物5g， K2HP04 lg， pH 6.0-7.0，金属离子溶液10ml;
所述金属离子溶液包括CaCl2'2H20 0. 4 g/L， H3B03 0. 5 g/L, CuS04 . 5H20 0. 04 g/L， KI 0.1 g/L， FeS04 ' 7H20 0. 2 g/L, MnS04 . 7H20 0. 4 g/L， ZnS04 . 7H20 0. 4 g/L, H2Mo04 . 2H20 0. 2 g/L, MgS04 . 7H20 50 g/L， CoCl2 . 5H20 0.1 g/L。
本发明所提供的一种催化烟酸制备6-羟基烟酸的方法及其所用菌林和 菌林的筛选方法，催化过程简单，易于操作，能耗低，无污染，副产物少， 生产成本低，产物易于分离；产率可达到6. 0~ lOg . L—1 h—';筛选所得到 的菌抹催化活性高，催化反应稳定，对催化环境适应性强。
图1为6-羟基烟酸产物和6-羟基烟酸标准品纸层析图谱；
图2为Pseudomonas.BK-l催化烟酸生产6-幾基烟酸转化过程曲线。
具体实施例方式
以下通过实施例对催化烟酸制备6-羟基烟酸的菌林的筛选方法进行详 细的阐述。
A、所用到的培养基的配制
富集培养基每升含酵母粉2 5g，例如，可选2g、 3g、 4g、或5g; 蛋白胨5 10g，例如，可选5g、 6g、 7g、 8g、 9g、或10g; NaCl 5~10g， 例如，可选5g、 6g、 7g、 8g、 9g、或10g;烟酸5 10g，例如，可选5g、 6g、 7g、 8g、 9g、或10g; pH 6. 0 ~ 7. 0。
筛选培养基每升含烟酸5 10g，例如，可选5g、 6g、 7g、 8g、 9g、 或10g; ( NH4) 2S04 1. 0 ~ 2. 0g，例如，可选lg、 1. 5g、或2. 0g; MgS04 . 7H20 0. 1 ~ 0. 2g，例如，可选0. lg、 0. 15g、或0. 2g; NaH2P04 . H20 0. 2 ~ 0. 5g,例
如，可选0.2g、 0. 3g、 0.4g、或0. 5g; CaCl2 . 2H20 0. 2 ~ 0. 5g，例如，可 选0. 2g、 0. 3g、 0. 4g、或0. 5g; K2HP04 0. 2 ~ 0. 5g，例如，可选0. 2g、 0. 3g、 0. 4g、或0. 5g; pH 6. 0~ 7. 0。
复筛培养基每升含有烟酸10g, NaCl 10g，胰蛋白胨10g，酵母提取 物5g， K2HP04 lg，pH 6.0-7.0，金属离子溶液10ml。
种子培养基每升含有烟酸10g，酵母粉5g，蛋白胨10g, K2HP04 lg， NaCl 10g， pH6. 0~ 7. 0。
发酵培养基每升含蔗糖10g,玉米浆2Gg，酵母粉2g， KH2P04 3. 93g， Na2HP04 H20 lg，烟酸12.5g，金属离子液10mL， PH=6. 0 ~ 7. 0。金属离子溶 液(g/L) : CaCl2 . 2H20 0. 4, HjBOs 0. 5， CuS04 . 5H20 0. 04， KI 0.1, FeS04 7H20 0. 2， MnS04 '7H20 0. 4, ZnS04 .7H20 0. 4, H2Mo04 .2H20 0. 2, MgS04 ， 50, CoCl2 .5H20 0.1，浓盐酸20ml。
固体培养基每升含有酵母粉2 5g，例如，可选2g、 3g、 4g、或5g; 蛋白胨5 10g，例如，可选5g、 6g、 7g、 8g、 9g、或10g; NaC15-10g，例 如，可选5g、 6g、 7g、 8g、 9g、或10g; 烟酸5 10g,例如，可选5g、 6g、 7g、 8g、 9g、或10g;琼脂15-20g，例如，可选15g、 16g、 17g、 18g、 19g、 或20g; pH 6. 0~ 7. 0。
上述各培养基经120 130。C高温和0. 10~0. 15MPa高压蒸汽灭菌15 ~ 20min，然后就在洁净工作台上紫外线灭菌15 20min后使用。
菌抹的筛选
取土壤样品O. 5g，优选生产烟酸类化学物质的工厂土壤，用1.0 g/L 的NaCl溶液稀释土壤样品到5mL,取上清夜，接种于含有30mL的富集培养 基的300mL摇瓶中摇床培养1 ~ 2天，培养条件为100~ 250r/min,优选200 r/min,温度为25 35。C,优选30。C;取富集培养菌液1mL接种于筛选培养 基的摇瓶中摇床培养2 3天，条件与富集培养相同；在超净工作台上，用 无菌水稀释筛选培养后的菌液到105~108倍，涂布在富集培养基斜面上，在
25~35℃，优选30℃,的培养箱中培养1 2天，挑取不同形态的单个菌落于24孔板中，每个孔装有1.5mL的筛选培养基，25~35℃, 100~ 250r/min 的条件下培养24 30h,分别离心收集各孔中的菌体，用pH6. 0~7.0的 0. 02mol/L的磷酸緩冲液洗涤细胞两次，再用1 ~ 1. 5mL的磷酸緩冲液悬浮， 同时加入底物烟酸使其浓度为1%，反应条件为30℃,催化l 2h,利用纸 层析法与6-羟基烟酸标准品比对定性分析，结果见图1,其中1为6-羟基烟 酸标准品，2 ~ 5为转化的6-羟基烟酸产物；篩选出具有催化活性的菌抹。再将 反应液稀释到合适的浓度，在295nm的条件下利用紫外分光光度计测定6-羟基烟酸的浓度，计算单位菌体的酶活(酶活单位定义每分钟催化生成 lmol产物6-羟基烟酸所需要的酶量为1U)。再用复筛培养基进行复筛， 将催化产物做紫外光谱和核磁共振定性分析，并将分离得到酶活最高的一抹 可以高效的催化烟酸生成6-羟基烟酸的菌抹，经生理生化和分子生物学鉴 定，该菌属于假单胞菌Pseudomonas sp.BK-1。该菌抹已经于2007年9月 27日在中国微生物菌株保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为 CGMCC No. 2191。
该菌抹的16SrDNA的长度为1387bp,其序列见SEQ ID NO. 1。
Pseudomonas sp, BK—1批量生产实施例1
取冷冻的菌种划线于固体培养基上活化24h后，接种于含20mL种子培 养基的50mL三角瓶中培养24h,培养条件优选为30°C、 200r/min。吸取 0. 75mL的培养好的种子接种在50mL(300mL的三角瓶)发酵培养基中，培养 条件200 r/min， 30℃，培养36h后收集菌体，测定其酶活可以达到0. 9U/mL。
Pseudomonas sp, BK-l批量生产实施例2
以20g/L玉米浆和10g/L蔗糖为氮源和碳源的发酵培养基3L至于容量 为5L的发酵罐中，接种量为1.5%，种子培养基50mL装在300mL的三角瓶 中，种子培养条件为200r/min，30℃下培养24h，发酵的培养条件为 400r/min、 30℃,通气量为4. 2L/min， pH维持在7. 0,批量培养14h后，收集菌体，测定其酶活可以达到1.47U/mL，用等体积pH6. 0 0. 02mol/L的 磷酸緩冲液悬浮洗涤菌体2次，待后续催化使用。
以下是用假单胞菌Pseudomonas sp.BK-1催化烟酸转化为6-羟基烟酸 的具体实施方法
在菌体悬浮液中加入等体积pH6. 0~ 8. 0的0. 02mol/L的磷酸缓沖液悬 浮细胞，研究发现，如果溶液中的烟酸的高浓度可以抑制6-羟基烟酸的分 解，因此可以保持溶液中烟酸的含量，抑制6-羟基烟酸的分解，溶液中的 6-羟基烟酸的浓度可以得到较高的积累，通过流加维持悬浮液中的烟酸的浓 度为0. 5~3%以上30~48h，之后停止流加烟酸，反应持续至用HPLC检测 直至检测不出烟酸为止。反应条件为30°C, 200r/min维持pH 6. 0 ~ 8. 0。 反应完全后调节pH小于2. O，可以得到大量的白色沉淀6-羟基烟酸。
实施例1
将收集好的1L磷酸緩冲液悬浮菌体用600mL的pH6. 0的磷酸緩冲液悬 浮，用空气压缩机通气，起始烟酸的浓度为3.5%,通过HPLC检测反应液中 烟酸的变化，通过不断的流加40%的烟酸溶液，维持催化反应液中的烟酸浓 度在0. 5%以上30h, 4亭止流加烟酸后继续反应8h，反应液中的烟酸几乎全 部转化为6-羟基烟酸。最终6-雍基烟酸的积累浓度在154g/L，转化率在97% 以上(反应曲线图见图2)。反应完全后调节pH小于2. O，可以得到大量的 白色沉淀6-幾基烟酸。催化的反应条件30°C, 400r/min，通气量为 4. 2L/min, pH6. 0。序列表
<110> 北京科技大学
<120> —种催化烟酸制备6-羟基烟酸的方法及其所用菌抹
<160〉 1
<210〉 1 <211> 1387 <212> 腿
<213> Pseudomonas sp. BK-1 <400> 1
GCAGTCGAGC GGATGACGGG AGCTTGCTCC CTAGGAATCT GCCTGGTAGT GGGGGACAAC TCCTACGGGA GAAAGCAGGG GACCTTCGGG TTAGCTAGTT GGTGGGGTAA TGGCTCACCA TGATCAGTCA CACTGGAACT GAGACACGGT ATATTGGACA ATGGGCGAAA GCCTGATCCA GATTGTAAAG CACTTTAAGT TGGGAGGAAG GTTACCGACA GAATAAGCAC CGGCTAACTC GCAAGCGTTA ATCGGAATTA CTGGGCGTAA
TTGATTCAGC GGCGGACGGG TGAGTAATGC 60
GTTTCGAAAG GAACGCTAAT ACCGCATACG 120
CCTTGCGCTA TCAGATGAGC CTAGGTCGGA 180
AGGCGACGAT CCGTAACTGG TCTGAGAGGA 240
CCAGACTCCT ACGGGAGGCA GCAGTGGGGA 300
GCCATGCCGC GTGTGTGAAG AAGGTCTTCG 360
GGCAGTAAGT TAATACCTTG CTGTTTTGAC 420
TGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACAGAGGGT 480
AGCGCGCGTA GGTGGTTTGT TAAGTTGGAT 540 GTGAAAGCCC CGGGCTCAAC CTGGGAACTG CATCCAAAAC TGGCAAGCTA GAGTACGGTA 600 GAGGGTGGTG GAAATTCCTG TGTAGCGGTG AAATGCGTAG ATATAGGAAG GAACACCAGT 660 GGCGAAGGCG ACCACCTGGA CTGATACTGA CACTGAGGTG CGAAAGCGTG GGGAGCAAAC 720 AGGATTAGAT ACCCTGGTAG TCCACGCCGT AAACGATGTC AACTAGCCGT TGGAATCCTT 780 GAGATTTTAG TGGCGCAGCT AACGCATTAA GTTGACCGCC TGGGGAGTAC GGCCGCAAGG 840 TTAAAACTCA AATGAATTGA CGGGGGCCCG CACAAGCGGT GGAGCATGTG GTTTAATTTG 900 AAGCAACGCG AAGAACCTTA CCAGGCCTTG ACATGCAGAG AACTTTCCAG AGATGGATTG 960 GTGCCTTCGG GAACTCTGAC ACAGGTGCTG CATGGCTGTC GTCAGCTCGT GTCGTGAGAT 1020 GTTGGGTTAA GTCCCGTAAC GAGCGCAACC CTTGTCCTTA GTTACCAGCA CGTTATGGTG 1080 GGCACTCTAA GGAGACTGCC GGTGACAAAC CGGAGGAAGG TGGGGATGAC GTCAAGTCAT 1140 CATGGCCCTT ACGGCCTGGG CTACACACGT GCTACAATGG TCGGTACAGA GGGTTGCCAA 1200 GCCGCGAGGT GGAGCTAATC TCACAAAACC GATCGTAGTC CGGATCGCAG TTTGCAACTC 1260 GACTGCGTGA AGTCGGAATC GCTAGTAATC GCGAATCAGA ATGTCGCGGT GAATACGTTC 1320 CCGGGCCTTG TACACACCGC CCGTCACACC ATGGGAGTGG GTTGCACCAG AAGTAGCTAG 1380TCTAACC 138权利要求
1、一种催化烟酸制备6-羟基烟酸的方法，其特征是用假单胞菌(Pseudomonas)sp.BK-1 CGMCC No.2191悬浮液催化溶液中的烟酸转化为6-羟基烟酸。
2、 根据权利要求1所述的催化烟酸制备6-羟基烟酸的方法，其中，所述 假单胞菌悬浮液为用磷酸緩冲液或水悬浮该假单胞菌sp. BK-1。
3、 根据权利要求l所述的催化烟酸制备6-羟基烟酸的方法，其中，所述 溶液中的烟酸的浓度保持在0. 5%以上。
4、 根据权利要求1所述的催化烟酸制备6-羟基烟酸的方法，其中，催化 反应过程在搅拌下进行。
5、 根据权利要求1所述的催化烟酸制备6-羟基烟酸的方法，其中，催化 反应过程中pH值为6. 0 ~ 8. 0。
6、 根据权利要求5所述的催化烟酸制备6-羟基烟酸的方法，其中，催化 反应完成后调节pH值小于2. 0，收集固体6-羟基烟酸。
7、 一种催化烟酸制备6-羟基烟酸的菌抹，其特征是该菌抹是假单胞菌 (Ae^/owo"os) sp. BK—1 CGMCC No. 2191。8、 一种权利要求7所述菌林的筛选方法，其特征是，包括 用富集培养基富集培养土壤微生物；富集培养温度为25 35。C，pH 6. 0 ~7. 0;所述富集培养基包括酵母粉2 ~ 5g/L,蛋白胨5 ~ 10g/L， NaCl 5 ~ 10g/L， 烟酸5 10g/L， pH 6. 0~7. 0;富集培养后用筛选培养基进行菌林筛选；筛选培养温度为25~35°C; pH 6. 0 ~ 7. 0;所述筛选培养基包括烟酸5 ~ 10g/L, ( NH4) 2S04 1. 0 ~ 2. 0g/L, MgS04.7H20 0. l~0.2g/L, NaH2P04'H20 0. 2 ~ 0. 5g/L， CaCl2.2H20 0. 2 ~ 0. 5g/L， K2HP04 0. 2 ~0. 5g/L， pH 6.0-7.0;筛选培养得到的菌抹在固体培养基上涂布，挑取单菌落分别在筛选培养基 中培养，检测催化烟酸为6-幾基烟酸的酶活，将检测到酶活的菌抹放入复筛培养基进行复筛，再次检测所述酶活，选取酶活最高的菌林；所述固体培养基包括酵母粉2 5g/L，蛋白胨5 10g/L， NaC15~10g/L， 烟酸5 10g/L，琼脂15 20g/L， pH 6.0-7.0;所述复筛培养基包括烟酸10g， NaC110g，蛋白胨10g，酵母提取物5g, K2HP04 lg, pH 6.0-7.0,金属离子溶液10ml;所述金属离子溶液包括CaCl2 . 2H20 0. 4 g/L, H3B03 0. 5 g/L， CuS04 5H20 0. 04 g/L, KI 0.1 g/L, FeS04 . 7H20 0. 2 g/L, MnS04 . 7H20 0. 4 g/L, ZnS04 7H20 0. 4 g/L, H2Mo04 . 2H20 0. 2 g/L， MgS04 . 7H20 50 g/L， CoCl2 . 5H20 0.1 g/L。
全文摘要
本发明提供了一种催化烟酸制备6-羟基烟酸的方法，包括用假单胞菌(Pseudomonas)sp.BK-1CGMCCNo.2191悬浮液催化溶液中的烟酸转化为6-羟基烟酸。所述假单胞菌悬浮液为用磷酸缓冲液或水悬浮该假单胞菌sp.BK-1。所述溶液中的烟酸的浓度保持在0.5％以上。催化反应过程中pH值为6.0～8.0。催化反应完成后调节pH值小于2.0，收集固体6-羟基烟酸。本发明还提供一种催化烟酸制备6-羟基烟酸的假单胞菌sp.BK-1CGMCC No.2191。还提供了该菌株的筛选方法。本发明的催化过程能耗低，无污染，副产物少，产物易于分离；筛选所得到的菌株催化活性高，对催化环境适应性强。
文档编号C12P17/12GK101200746SQ20071017739
公开日2008年6月18日 申请日期2007年11月16日 优先权日2007年11月16日
发明者尹祖建, 常雁红, 晖 罗, 肖宝清 申请人:北京科技大学