副结核荧光pcr快速诊断试剂盒的制作方法

专利名称：：副结核荧光pcr快速诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种副结核荧光PCR快速诊断试剂盒，更具体地说是采用荧光PCR技术原理快速检测副结核病病原菌一一副结核分枝杆菌的方法和试剂盒，属于生物
技术领域：
。
背景技术：
：副结核病(Paratuberculosis，或Johne，sdisease)是一种以牛、羊等反刍动物为主的消耗性、慢性肠炎，以动物持续性腹泻和慢性消瘦为特征，感染地区畜群的死亡率可达2%-10%，由于该病难于根除，其对养牛业造成的损失往往超过某些传染病。副结核病广泛分布于世界各国，对奶牛业和肉牛业危害较大，被国际动物卫生组织(oie)列为B类疫病，被我国列为二类疫病，是我国进出境牛羊等动物及产品重点检疫的疫病之一。该病的病原菌为畐U结核分丰支争下菌(Mycobacteriumaviumsubsp.paratubercilosis,M.paratuberculosis)。据文献报道，副结核分枝杆菌与人的一种慢性肠道疾病克罗恩氏病有关。一些研究报道了商业性加工牛奶被副结核分枝杆菌污染的情况，国外学者针对动物性食品中副结核分枝杆菌的污染及食品加工技术对病原菌杀灭能力开展研究，证实当菌体含量较高时，牛奶经巴氏消毒后尚有副结核分枝杆菌存活。因此，副结核分枝杆菌感染对奶制品食品安全亦构成威胁。人及动物的结核、副结核病涉及多种病原菌，它们均属分枝杆菌属，结构相似，抗原性有交叉，常规方法难于鉴别。针对副结核分枝杆菌建立可靠的鉴别、鉴定技术，是有效防控和诊治副结核病的重要技术保障，对于公共卫生，养殖业健康发展、动物进出口贸易以及奶制品食品安全均具有重要意义。目前国内外用于诊断副结核病的检验方法，大体上可分为3类第一类是细菌学检验方法，如染色镜检、细菌培养和动物接种等；第二类是采用免疫学方法检测特异性抗体，如皮内变态反应、酶联免疫吸附试验(ELISA)和补体结合试验(CF)方法等；第三类是采用分子生物学检验方法，如PCR-RFLP、PCR-核酸探针、多重PCR等。由于分枝杆菌生长缓慢，细菌分离培养周期长(常需数周时间)，传统的细菌学检査方法难于适应进出境检验检疫快速通关需求，也不利于疾病临床诊疗。ELISA和CF方法等免疫学方法在特异性方面尚存在争议，国内目前尚缺乏可靠的免疫学诊断试剂。随着分子生物学技术的发展，国内外众多实验室开展了副结核PCR方法研究，但检测方法和试剂盒缺乏规范化、标准化是影响PCR结果准确性的关键。本发明方法采用T叫Man实时荧光PCR，其具体原理为在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'—3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到报告基团发出的荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光PCR等分子生物学方法具有快速、灵敏、特异性强的优点。随着分子生物学技术的发展及相关仪器设备、配套试剂的商业化推广，实时荧光PCR作为一种快速高效的检测技术，己在人、动植物传染病诊断领域得到愈来愈广泛的应用。它比常规PCR方法更为快速、敏感，并能有效避免交叉污染和便于实现自动化，迄今已应用于禽流感、链球菌、口蹄疫、乙肝等人畜疾病的快速诊断并已在国内建立检测方法标准。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一组检验副结核病毒的核苷酸序列。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种副结核荧光PCR快速诊断试剂盒。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案一组检验副结核病毒的核苷酸序列，通过已发表的文献分析总结出副结核分枝杆菌的特异性核酸序列，采用Primerexpess2.0软件设计得到是序列表SEQIDNo.l至序列表SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，其中SEQIDNo.l和SEQIDNo.2为检验副结核分枝杆菌的引物对，SEQIDNo.3为检验副结核分枝杆菌的探针序列；SEQIDNo.4为引物SEQIDNo.l和引物SEQIDNo.2扩增的核酸序列。所述序列还包括如下衍生序列即引物SEQIDNo.l和SEQIDNo.2所组成的引物对、SEQIDNo.l和SEQIDNo.2的互补序列，以及引物SEQIDNo.l向5'端延伸IO个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.2向3'端延伸IO个碱基的核酸序列，扩增序列SEQIDNo.4向5'端和3'端各延伸10个碱基的核酸序列以及各自的互补序列。所述探针序列的5'端标记的荧光染料，包括但不限于FAM、JOE、TET和HEX等染料，3'端标记的淬灭荧光染料包括但不限于TAMARA、Eclipse和BHQ。一种副结核荧光PCR快速诊断试剂盒包括1)PCR反应液，含1XPCR缓冲液；0.2pmol/L引物I;0.2pmol/L引物II，0.1pmol/L探针；200nmol/LdNTP，MgCl22.5mmol/L;2)Taq酶2.5U/pl;3)阴性对照生理盐水；4)阳性对照携带有扩增产物的质粒DNA;反应液中的引物I为SEQIDNo.l所示的核苷酸序列，引物II为SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，探针为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，阳性对照的扩增产物为SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。所述探针5'端标记FAM、HEX、TET、JOE、ROX或VIC等荧光染料，探针3，端标记TAMARA、Elcipse或BHQ淬灭标记。通过副结核分枝杆菌探针、引物的筛选，以及引物和探针浓度、Mg^浓度、Taq酶量以及荧光PCR退火温度等条件的优化得到了最适的PCR反应体系(表l)禾BPCR反应条件。表1荧光PCR检测试剂盒最适PCR反应体系组分使用浓度引物I0.2)imol/L引物n0.2|xmol/L探针0,1(omol/E10xPCR缓冲液lxMgCl22.5mmol/LdNTPs0.2M_mol/LTaq酶1U模板3^1PCR反应体系为30W，不足的都用双蒸水补充最适PCR反应条件第一步50。C3分钟；第二步95。C4分钟；第三步95°C10秒，60'C30秒，40个循环，6(TC时设置釆集荧光。本发明结果判定采用扩增曲线和Ct值为判定标准-(1)阴性对照为阴性，Ct值显示为None，阳性对照的Ct值应小于等于28.0。否则，此次实验视为无效。(2)Ct值显示为None的样本为阴性样本，Ct值533.0的样本为阳性。(3)Ct值大于33.0的样本建议重做。重做结果显示为None为阴性，否则为阳性。本发明方法的具体步骤(1)设计合成引物和探针。(2)采集样品，提取核酸。本发明可检测细菌培养液、动物活体采集的样品如血液、奶液、痰液和粪便等，以及通过剖检采集的组织样品，如淋巴结等。采用蛋白酶K消化，高温裂解、氯仿抽提等步骤从上述样品中提取核酸。(3)加样。按上述反应液体系，在反应管中分别加入反应液和核酸，记录样品编号和对应管号。(4)上机检测。在荧光PCR仪上，按上述扩增循环条件设定反应参数，放入反应管，开机检测。(5)分析、判定结果。根据扩增曲线和Ct值判定结果。全过程可在4—5小时内结束。本发明采用实时荧光PCR检测副结核分枝杆菌，可以快速诊断由副结核分枝杆菌引起的副结核病。本发明适用于进出境动物及其产品检验检疫、动物传染病疫情防控、食品安全、诊断和流行病学调查领域对副结核分枝杆菌感染的快速检测、监控和防治。本发明的优点是(l)特异性好，实时荧光PCR技术通过引物或和探针的特异性杂交对模板进行鉴别，具有很高的准确性，假阳性低；(2)灵敏度高，采用灵敏的荧光检测系统对荧光信号进行实时监控；(3)操作简单，自动化程度高，不需要传统PCR扩增后的产物电泳检测等步骤；(4)不易污染，闭管扩增，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少。下面结合附图和具体实施方式对本发明发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为副结核分枝杆菌荧光PCR试剂盒特异性试验检测图。图2为副结核分枝杆菌荧光PCR试剂盒敏感性试验检测图。具体实施例方式实施例1:副结核分枝杆菌荧光PCR快速诊断试剂盒引物和探针的制备根据副结核分枝杆菌的特异性核酸序列IS900插入序列，选择NCBI上已公布的序列之一(GeneBankNo.S74401),采用专业引物探针设计软件Primerexpress2.0软件针对IS卯O插入序列的保守区设计引物，根据引物的退火温度在60。C以及探针的退火温度比引物的退火温度高IO'C左右的原则，应用blast软件进行分析，从中筛选，最终选择了引物PB-1U、PB-1R和探针PB-1P。再应用blast软件进行核酸序列同源性分析表明，所选取的引物和探针序列均与公开数据库中所有IS900插入序列的对应序列相符合，未发现与其它物种的核酸序列有相关性，分析结果证实所设计的引物和探针为副结核分枝杆菌特异。引物PB-1U、PB-1R和探针PB-1P以及扩增产物PB-1S的核酸序列分别为序列表SEQIDNo.l至SEQIDNo.4。引物扩增产物PB-IS的长度为147bp，探针的5，端标记的荧光染料FAM，3，端标记的淬灭荧光染料TAMARA。探针和引物委托大连宝生物工程技术有限公司合成。实施例2:副结核分枝杆菌荧光PCR快速诊断试剂盒PCR检测反应体系的建立和优化一.方法1.引物、探针浓度的优化实验中将引物浓度从O.lpmol/L至0.6pmol/L以O.l|amol/L递增，探针浓度从0.025pmol/L至0.2pmol/L以0.025|imol/L递增。采用矩阵法进行对比试验，对比试验的其它条件完全一致。2.TaqDNA聚合酶(Taq酶)的优化Taq酶一个单位的定义74。C作用30分钟，能将10pmol/L的dNTPs掺入酸溶性物质中所需要的酶量。活性要求具DNA聚合酶活性及5'—3'核酸外切酶活性，无3'—5'核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94°C1小时后仍保持50%活性。3.Mg"+浓度的优化Mg^会影响PCR反应的特异性和扩增效率，在固定其它反应成分不变的情况下，采用Mg2+浓度梯度，对Mg2+浓度进行了优化，Mg2+浓度从1.5mmol/L开始，以0.5mmol/L递加，直到6mmol/L。4.PCR反应条件的优化为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，根据设计的引物和探针退火温度，以57'C为基础，以0.5'C递加，直到62'C，在此基础上进行退火温度优化。采用的反应体系如下10xPCR缓冲液3pl，25mmol/LMgCl23nl，2.5mmol/LdNTPs2.4pl，10pmol/L引物10.6^1，10|imol/L引物110.6^1，lOpmol/L探针0.6pl，5U/plTaq酶lnl，双蒸水模板3pl。在MJresearchOpticon1上进行检测，按如下反应条件设置第一步50°C，3分钟；第二步94°C，5分钟；第三步94°C，10秒，57-62。C，40秒，40个循环。MJresearchOpticonl具备梯度PCR功能，可以同时进行温度梯度实验。二.结果1.引物、探针浓度的优化多次重复实验中引物浓度为0.2pmol/L,探针浓度为0.1pmol/L时荧光增幅较高，Ct值较小，所以选定引物浓度为0.2pmol/L，探针浓度为0.1nmol/L作为副结核分枝杆菌荧光PCR检测试剂盒的引物和探针浓度。2.TaqDNA聚合酶(Taq酶)的优化Taq酶用量(以单位Unit计，简写U)的优化实验在相同反应条件，但酶的用量不同的条件下进行，试验结果见表2。根据实验结果选定IU作为酶的最适用量。表2:Taq酶用量优化实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>3.Mg^浓度的优化结果表明Mg^浓度越低反应的特异性越强，但扩增效率下降，反之，MgZ+浓度越高，扩增效率有所提高，但特异性受到影响，本发明最终选定的实际Mg^浓度为2.5mmol/L。4.PCR反应条件的优化实验结果表示，退火温度越高，反应的特异性越强，但扩增效率有所下降，反之温度越低，扩增效率有所提高，但特异性有所降低。本发明选择6(TC作为实际的退火温度，特异性和扩增效率都能够达到最优的组合。实施例3:副结核病荧光PCR快速诊断试剂盒试剂盒包括如下组分，保藏温度为-2(TC1)PCR反应液，含lXPCR缓冲液；0.2nmol/L引物I;0.2nmol/L引物II，0.1nmol/L探针；200)amol/LdNTP，MgCl22.5mmol/L;2)Taq酶5U1;3)阴性对照生理盐水；4)阳性对照携带有扩增产物的质粒DNA;反应液中的引物I为SEQIDNo.l所示的核苷酸序列，引物II为SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，探针为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，阳性对照的扩增产物为SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，所述探针5'端标记FAM荧光染料，探针3'端标记TAMARA淬灭标记。阳性对照的制备方法采用引物SEQIDNo.1和引物SEQIDNo.2，以副结核分枝杆菌的DNA为模板，进行PCR扩增，回收并纯化PCR产物，与pEASY-Blunt平端载体(购于北京全式金生物技术有限公司)连接，并转化大肠杆菌，采用常规PCR和测序对重组质粒进行验证。重组质粒分别命名为pEASY-PB(副结核分枝杆菌荧光PCR反应液的阳性对照)；将含重组质粒的大肠杆菌进行增菌培养后，采用质粒提取试剂盒(购于大连宝生物工程有限公司)纯化重组质粒DNA，测OD26o吸光度值，根据公式质粒拷贝数411={总含量(吗/pl)}/{质粒分子碱基数><10"5吗}换算成对应基因拷贝数。将纯化后的质粒稀释到2000拷贝/ml，作为试剂盒的阳性对照。实施例4:副结核病荧光PCR快速诊断试剂盒检测临床样^一.样品采集1.抗凝全血抽取动物血液与拧檬酸钠或EDTA抗凝管中。2.尿采集早晨第一次尿中段尿液。3.奶样挤出之最后乳汁含菌量较多，早晨挤出的乳汁含菌量最高。常乳在分娩后1425天内收集，取样时，先将乳头用75%酒精棉拭子擦洗消毒34次，弃去前几把始乳后，约收集200ml乳样于无菌的容器中。4.粪便选取混有粘液、血液、粘膜的粪便或用刮钥从动物直肠深部(约30cm)取少量粘液粪便，盛于灭菌容器中。5.肠段和淋巴结选取有明显病变的肠段、回盲瓣以及病肠相邻部位的淋巴结，用自来水将粪便从肠道中漂洗掉。二.样本的运输和保存待测样本在2-8。C保存不应超过24小时；-20。C保存不超过三个月；-80°(:以下长期保存。样本运输采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行。三.样本的处理(在样本制备区进行)1.抗凝全血、血清和尿样的处理方法(1)取1.2mL抗凝全血、血清或尿液样本，10,000rpm离心10min，弃上清。(2)加等体积灭菌双蒸水充分振荡使沉淀悬浮，IO，OOOrpm离心10min，弃上清。(3)重复步骤(2)。血清可省略步骤(2)和(3)。(4)加lmL灭菌生理盐水，充分振荡使沉淀悬浮，10,000rpm离心10min，弃上清。(5)加入30plDNA提取液，振荡混匀，4000rpm离心5s，56。C温浴30min，98。C温浴10min。(6)4000rpm离心5s，待液体冷却，加入等体积氯仿，振荡混匀后，10,000rpm离心10min。(7)取上清，直接用于PCR或贮存于-20。C备用。2.奶样的处理方法(1)取1.5ml奶样，10,000rpm离心10min,吸弃液体，保留上层油脂层及沉淀。(2)加灭菌生理盐水1mL，充分振荡混匀使沉淀悬浮，10,000rpm离心10min,弃上清。(3)重复步骤(2)。(4)加入50ylDNA提取液，振荡混匀，4,000rpm离心5s，56。C温浴30min，98。C温浴10min。(5)4,000rpm离心5s，待液体冷却，加入等体积氯仿，振荡混匀后，10,000rpm离心10min。(6)取上清，直接用于PCR或贮存于-2(TC备用。3.组织样本的处理方法(1)取淋巴结等组织(剔除外面脂肪)lg，加2ml柠檬酸钠磷酸缓冲液，充分研磨成乳剂。(2)加4%NaOH溶液2ml，继续研磨5-10min，使组织液化。(3)充分振荡，75。C温浴0.5-l小时。(4)取1.5ml悬浮液(避免吸取粗渣)，10,000rpm离心10min，弃上清。(5)加灭菌生理盐水1mL,充分振荡混匀使沉淀悬浮，10,000rpm离心10min，弃上清。(6)重复步骤(5)。(7)加入50u1DNA提取液，振荡混匀，4,000rpm离心5s，56。C温浴30min,98。C温浴10min。(8)4,000rpm离心5s，待液体冷却，加入等体积氯仿，振荡混匀后，10，000rpm离心10min。(9)取上清，直接用于PCR或贮存于-20'C备用。4.粪样的处理方法(1)取粪样l-2g，按1:5的比例加入4%硫酸溶液(例1g粪样，力n5mL液体)振荡混匀，37'C温浴0.5lhr。(2)取中、上层较澄清液体1.5mL,800rpm离心1min，小心吸取上清。(3)10,000rpm离心10min，弃上清。(4)力n1mL灭菌生理盐水，用吸嘴混匀并充分振荡，10,000rpm离心10min。(5)重复步骤(4)。(6)弃上清，加入100iUDNA提取液，用吸嘴混匀并充分振荡，56。C温浴30min，98。C温浴10min。(7)10,000rpm离心5min，取上清。(8)加等体积氯仿，振荡混匀，12,000rpm离心10min，小心吸取上清。(9)加入二倍体积异丙醇(-20。C预冷)，颠倒混匀，放置5-10min。(10)4。C，12,000rpm离心10min，弃上清。(11)加300u170%乙醇(4'C预冷)，振荡洗涤。(12)4。C，12,000rpm离心10min，小心吸弃上清，吸头不要碰到有沉淀一面，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品需在吸水纸不同地方沾干)，在洁净工作台室温干燥5min。(13)加入30ul灭菌双蒸水，轻轻混匀，溶解管壁上的核酸，室温放置10min，直接用于PCR或贮存于-20'C备用。四.扩增检测1.扩增试剂准备(在反应混合物配制区进行)取出副结核(PB)荧光PCR反应液，在室温下融化后，6000rpm离心5秒，每个PCR反应按以下用量配制PCR反应混合液(需配制反应液数量=样本个数+阴性对照+阳性对照)荧光PCR反应液26.6W，Taq酶0.4W。将以上PCR反应试剂按使用量吸取到一个离心管中，充分混匀，然后在每个PCR管中分装27W，转移至样本处理区。2.加样(样本处理区)在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸，盖上管盖，将PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。3.PCR扩增检测(扩增检测区)反应条件设定第一歩50。C3分钟；第二步95。C4分钟；第三步95。C10秒，6(TC30秒，40个循环，6(TC时设置采集荧光。荧光素设定ReportDye设定为FAM，QuenchDye都设定为Tamara,Referencedye设定为None。五.分析条件设定和结果判定综合分析仪器给出的各项结果，基线(baseline)以仪器给出的默认值作为参考，阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行分析。(1)质控标准阴性对照为阴性，Ct值显示为None，阳性对照的Ct值应小于等于28.0。否则，此次实验视为无效。(2)结果分析及判定Ct值显示为None的样本为阴性样本，Ct值《33.0的样本为阳性，表明结核分枝杆菌复合群阳性。Ct值大于33.0的样本建议重做。重做结果显示为None为阴性，否则为阳性。六.对牛临床样品的检测实例按上述样品处理与荧光PCR检测方法，采用副结核荧光PCR试剂盒对临床采集的28份牛血样和82份牛粪样进行检测试验，结果检出血样和粪样阳性各3份。实施例5:副结核病荧光PCR快速诊断试剂盒特异性和敏感性试验一.方法1.特异性试验提取培养的副结核分枝杆菌菌株和结核分枝杆菌、牛分枝杆菌标准菌株、禽分枝杆菌以及龟、草、堪萨斯、胞内、耻垢、胃、瘰疬、偶发分枝杆菌等分支杆菌菌株、大肠杆菌0:157，链霉菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、单增李斯特菌、致泻大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、蜡样芽孢杆菌等多种常见微生物核酸样品，按照实例3描述的扩增检测步骤，釆用副结核分枝杆菌荧光PCR试剂盒进行检测试验，同时以含荧光PCR扩增模板的重组质粒作为阳性对照，结果显示仅副结核分枝杆菌和重组质粒样品为阳性，其它菌株均呈典型阴性反应。特异性试验结果见表3和附图1。2.敏感性试验采用质粒提取试剂盒纯化携带有副结核分枝杆菌IS卯0插入序列的质粒DNA，测OD26o吸光度值，根据公式质粒拷贝数^1={总含量(ng&l)}/{质粒分子碱基数xlO—'Vg)换算成对应基因拷贝数。将质粒DNA采用无RNase,无DNase水进行10倍系列稀释，取各稀释度样品3pl，采用副结核分枝杆菌荧光PCR试剂盒按照实例4中的扩增检测程序进行试验，以测试试剂盒的检测灵敏度(基因拷贝数)。每个稀释度均作两管重复检测。结果显示，荧光PCR试剂盒的检测灵敏度可达单个基因拷贝。见表4和附图2。二.结果1.特异性试验-表3:副结核分枝杆菌荧光PCR检测试剂盒特异性试验<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>注"+"表示阳性，表示阴性。2.敏感性试验表4副结核分枝杆菌荧光PCR试剂盒检测敏感性试验(拷贝数)<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table><110>广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心北京盈九思科技发展有限公司<120>副结核荧光PCR快速诊断试剂盒<130><160>4<170>Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉17〈212〉DNA〈213〉虽U纟吉禾亥分枝申T'菌(ifeyco6actar_z'"fflava'〃/st;/s;.paraZ:〃6erciA/osis)<400〉1cgtggacgccggtaagg17〈210〉2<211>18〈212〉画〈213>虽'J结核分枝杆菌(餘co/a"erj'"历sk/匿57y/75ja/waz^erci/Josis)〈400〉2gtgacctcgcctccatcg18〈210〉3<211〉23〈212〉DNA<213>畐ll结核分枝杆-菌(i(FcciZ7acteri〃/zsk/〃/z57y力s/./arati/Ae_rc"7o5^'s0〈400〉3caccgccgcaatcaactccagca23〈210>4<211>147〈212>DNA〈213〉畐'j结核分枝杆菌(妙ca6s"eri，skz'"/zs〃/^aparatt/6erc〃Jo57.5)〈400〉4cgtggacgccggtaaggccgaccattactgcatggttattaacgacgacgcgcagcgatt60gctctcgcagcgggtggccaacgacgaggccgcgctgctggagttgattgcggcggtgac120gacgttggccgatggaggcgaggtcac14权利要求1.一组检验副结核病毒的核苷酸序列，其特征在于是序列表SEQIDNo.1至序列表SEQIDNo.4所示的核苷酸序列，其中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2为检验副结核分枝杆菌的引物对，SEQIDNo.3为检验副结核分枝杆菌的探针序列，SEQIDNo.4为引物SEQIDNo.1和引物SEQIDNo.2扩增的核酸序列。2.根据权利要求1所述的一组检验副结核病毒的核苷酸序列，其特征在于所述序列还包括如下衍生序列即引物SEQIDNo.l和SEQIDNo.2的互补序列，以及引物SEQIDNo.l向5'端延伸IO个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.2向3'端延伸10个碱基的核酸序列，扩增序列SEQIDNo.4向5'端和3'端各延伸IO个碱基的核酸序列以及各自的互补序列。3.—种副结核荧光PCR快速诊断试剂盒，其特征在于包括1)PCR反应液，含lXPCR缓冲液；0.2nmol/L引物I;0.2nmol/L引物II，0.1nmol/L探针；200nmol/LdNTP，MgCl22.5mmol/L;2)Taq酶5,;3)阴性对照生理盐水；4)阳性对照携带有扩增产物的质粒DNA;反应液中的引物I为SEQIDNo.l所示的核苷酸序列，引物II为SEQIDNo.2所示的核苷酸序列，探针为SEQIDNo.3所示的核苷酸序列，阳性对照的扩增产物为SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。所述探针5'端标记FAM、HEX、TET、JOE、ROX或VIC等荧光染料，探针3，端标记TAMARA、Elcipse或BHQ淬灭标记。全文摘要本发明公开了一种副结核荧光PCR快速诊断试剂盒，更具体地说是采用荧光PCR技术原理快速检测副结核病病原菌——副结核分枝杆菌的方法和试剂盒，属于生物
技术领域：
。一组检验副结核病毒的核苷酸序列，其特征在于是序列表SEQIDNo.1至序列表SEQIDNo.4所示的核苷酸序列。本发明的优点是(1)特异性好，实时荧光PCR技术通过引物或和探针的特异性杂交对模板进行鉴别，具有很高的准确性，假阳性低；(2)灵敏度高，采用灵敏的荧光检测系统对荧光信号进行实时监控；(3)操作简单，自动化程度高，不需要传统PCR扩增后的产物电泳检测等步骤；(4)不易污染，闭管扩增，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少。文档编号C12Q1/70GK101168783SQ20071017689公开日2008年4月30日申请日期2007年11月6日优先权日2007年11月6日发明者刘中勇,朱道中,杨国海,林志雄,茹陈,高小博申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心;北京盈九思科技发展有限公司