专利名称：一种检测结核杆菌的试剂盒及其专用探针与引物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种检测细菌的试剂盒及其专用探针与引物，特别是涉及一种检测 结核杆菌的试剂盒及其专用探针与引物。
背景技术：
结核病是严重危及全球的公共卫生问题之一，自1985年以来结核病疫情在全球 范围内急剧上升，据世界卫生组织报道，目前全球有近l/3的人感染了结核杆菌，即 20亿人口感染了结核杆菌，其中活动性肺结核病人约2000万，每年新增结核病人约 800万一1000万，每年约有300万人死于结核病。结核病已成为导致全世界成人因传 染病而死亡的主要疾病之一。我国是全球22个结核病高发国家之一，活动性肺结核 病人数居世界第二位。据2000年全国结核病流行病学抽样调査估计，全国现有活动 性肺结核病人450万，其中传染性肺结核病人150万。
临床诊断肺结核的主要依据是检测痰液中结核分枝杆菌0^co^cto^m r^wcw/a^， TB)，其中，涂片法简单易行，但阳性率较低；罗氏培养法虽然是金标准， 但检测周期长，均难以满足临床需要。近年来，作为分枝杆菌种系鉴定及药敏的许多 分子生物学方法得到长足发展，这些方法能将诊断的时间从几周縮短到几天，其中 实时荧光定量PCR因其技术成熟，具有较高的灵敏性和特异性，已逐步应用到临床 中。
发明内容
本发明的目的是提供一种检测结核杆菌的专用探针和引物。 本发明所提供的专用探针，其碱基序列如SEQ IN NO: 3所示；专用引物由正
向引物和反向引物组成，所述正向引物的碱基序列如SEQ IN NO: l所示，所述反
向引物的碱基序列如SEQ IN NO: 2所示。
所述探针的3'端连接有一个荧光淬灭基团TAMRA， 5'端连接有一个荧光报告
基团FAM。
本发明的第二个目的是提供一种用于结核杆菌检测的试剂盒。 本发明所提供的结核杆菌检测试剂盒包括上述检测结核杆菌的特异性探针及 通用引物。
为了方便使用，本发明所提供的结核杆菌检测试剂盒还包括结核杆菌基因PCR
扩增试剂，以及结核杆菌标准品。
所述结核杆菌基因PCR扩增试剂为2XProbe — PCR Master Mix。 所述结核杆菌标准品包括阳性定量参考品、阴性质控品、临界阳性质控品和强 阳性质控品，其中阳性定量参考品的浓度梯度为108、 107、 106、 Kfc叩ies/mL。 本发明的第三个目的是提供一种利用上述试剂盒对结核杆菌进行检测的方法。 本发明所提供的检测结核杆菌的方法，是以待测痰液提取的DNA为模板，用上 述试剂盒进行荧光定量PCR检测。
本发明针对现有结核杆菌检测方法检测周期长、阳性率低的不足，提供了一种 快速简单、特异性较强、灵敏度较高的检测结核杆菌的试剂盒，可广泛用于结核杆 菌的诊断，具有重要的实际应用价值。利用本发明方法对疑似结核痰标本50例进 行检测，结果表明，阳性检出准确率达98%以上，表明该方法具有较高的检出率。
图l为定量曲线
图2为琼脂糖凝胶电泳验证本发明试剂盒的可靠性
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法。 实施例l、检测结核杆菌的专用探针和引物的设计
根据对NCBI数据库结核杆菌基因序列分析，以Genbank号分别为CP000717. 1， CP000611. 1， AM408590. 1， DQ217928. 1， AF189827. 1， AF189829. 1， AF189826. 1， A F189824. 1， AF189762. 1, AF189761. 1， AF189757. 1, AF189755. 1， AF189753. 1， AE0005 16. 2， BX248343. 1， Z48304. 1， AJ879180. 1， AJ879179. 1, Y15749. 1， BX842582. 1， BX84 2581. 1， BX842583. 1， BX842580. 1， BX842579. 1， BX842578. 1， BX842577. 1， BX842576. 1, BX842574. 1， AF357173. 1， AF357166. 1, AF390039. 1， AF181860. 1， X98154. 1， AJ242 908. 1, AJ242907. 1, X52471, 1， Y14614. 1， Y14613. 1， X17348. 1， X57835. 2, Y14048. 1， Y14047. 1， Y14046. 1， Y14045. 1， AD000007. 1， AD000019. 1, Y17220. 1， Y17219. 1， Y158 05. 1， AJ345006. l的保守序列，经ClustalW软件对比找出其保守序列区的相同序列， 经NCBI-Blast分析，与其他微生物无同源性序列，并在此区域设计探针及相应的 引物。
其专用探针的碱基序列如SEQ IN NO: 3所示。专用引物由正向引物和反向引
物组成，所述正向引物的碱基序列如SEQ IN NO: l所示，所述反向引物的碱基序 列如SEQ IN NO: 2所示。
实施例2、用本发明的试剂盒对待测样品进行荧光定量检测
一、 样品来源
深圳出入境检验检疫局疑似结核痰标本50例。
二、 痰液中结核杆菌DNA的提取
1、 痰液样品的预处理
1) 吸取待测痰液200uL放入1. 5mL的印pendo管中，加入5mol/L NaOH 500uL,混 匀，室温中摇动20分钟。
2) 加入lmol/L NaH2P04 700uL，混匀(起中和作用)，10， 000rmp离心5分钟。
3) 去上清液，补加TE至100uL，混匀，加入20uL浓度为50mg/mL的溶菌酶。
4) 置37。C消化30分钟。
2、 DNA的提取
1) 细胞复合裂解液置65'C水浴中，使其中的结晶溶解。
2) 将300uL结晶已溶解的细胞复合裂解液加入到上述预处理好的痰液样品中， 混璇器震荡混匀20秒，置65"水浴中反应20分钟。
3) 加入200uL蛋白沉淀液，上下颠倒5 — 6次使两者混匀。
4) 13000—16000r即离心3 — 5分钟。
5) 将上清液(约500uL)转移至新的离心管中，加入等体积异丙醇，此时可见透 明的絮状物，混匀后13000 — 16000rmp离心3 — 5分钟，倾去上清。
6) 加入200uL 70%的乙醇溶液，来回倒置，清洗管壁，13000 —16000rmp离心 3 — 5分钟。
7) 吸去70%乙醇，倒置离心管于干净的滤纸上，自然干燥15分钟左右，加入 30uL DNA溶解液，快速漩涡震荡l-2秒，使沉淀的DNA完全溶解。
三、 标准品的制备及曲线的绘制 1、标准品的制备
标准品包括阳性定量参考品、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品。 可以用本发明试剂盒中提供的标准品，也可以按照如下方法配制。
以结核杆菌阳性DNA样品2uL做为PCR反应的模板，加入PCR反应液23uL， PCR 反应液中含有鹿PCR Buffer3uL、 25mmol/L MgCl2l. 2uL、 10 mmol/L d證s 3uL、
4U/uL Taq DNA聚合酶0. 5uL及lOpmol^l上、下游引物各luL，灭菌双蒸水1，。 于PT-200 PCR扩增仪进行如下循环先94。C预变性4min;然后94°C 30s， 58°C 30s， 72°C 30s， 30个循环；最后72。C延伸10min。 PCR产物经1. 5%琼脂糖电泳，凝胶 回收试剂盒回收PCR电泳产物，与线性化后的pMD18-T载体(Invitrogen公司)4°C 下连接12h—16h，连接反应体系中含有PCR凝胶回收产物3uL、连接缓冲液5uL、 线性化后的pMD18-T载体luL和T4连接酶luL，连接产物转化感受态大肠杆菌 DH5a ，转化后的细胞涂布于含有氨苄青霉素抗性的1.5X琼脂固体LB培养基上， 37t:倒置培养12h — 16h，用灭菌牙签挑取单克隆，接种于含50rag/mL氨苄青霉素的 5mL液体LB培养基中，200rpm摇床37"C震摇过夜；取1. 6mL过夜培养物，抽提质粒， 经PCR初步鉴定，对阳性克隆进行测序分析，将筛选出的阳性菌株进一步扩增，抽 提质粒DNA，用核酸蛋白紫外分析仪准确定量(连续测定4次，每次重复4管，取均 值)，并进行10倍系列稀释，得到浓度分别为108、 107、 106、 105 copies/mL的4 个标准品，既为阳性定量参考品。
阴性质控品以生理盐水制备，强阳性质控品和临界阳性质控品根据浓度和拷贝 数以标准品经灭菌水稀释后制得。
2、曲线的绘制
反应液总体系为20uL，每份反应液中含有2XProbe—PCR Master Mix 10uL， 上、下游引物(10umol/uL)各0. 5uL，探针(10咖ol/uL)0. 2uL，高压灭菌水6. 8uL， 结核杆菌阳性DNA样品2uL。
反应条件为95°C 15min (XI) ， 94°C 10s—60°C 20s —72°C 30s (X40)。
按照上述反应体系及反应条件，随着PCR体系在每一个循环结束后测定吸光值， 就得到了以循环数为横坐标、吸光值为纵坐标的定量曲线和以标准品浓度的对数值 为横坐标,Ct值为纵坐标的标准曲线。
定量曲线结果如图l所示，从图l中可以看出，各个稀释度标准阳性株在第一 个循环结束后测到一个基础吸光值，接下来一直到第15个循环结束时都没有明显变 化。从第16个循环开始其中一个反应的吸光值增大，定量曲线开始抬头；20个循环 (Ct值)后，曲线迅速上扬，至第33个循环前后达到峰值，随后进入平台期， 一直到反 应结束。阴性对照未出现扩增曲线。
四、实时荧光定量PCR检测
1、待测样品的检测及其检测结果
按照步骤三中2的反应体系和反应条件对待测样品进行检测，并与标准曲线进
行比较。结果表明，经本发明试剂盒检测，在50例疑似结核痰标本中，结核杆菌 阳性有49例，阳性率为98%。
2、 重复性实验
重复测定阳性DNA五次，分别得到五个Ct值，Ct值分别是15. 68、20. 81、25. 74、 28.47、 32.38，标准差分别是O. 11、 0.07、 0.65、 0.22、 0.27，变异系数分别是 0.67%、 0.32%、 2.52%、 0.76%、 0.83%，计算平均Ct值、标准差和变异系数。 结果表明，随着拷贝数的降低,Ct值增大，标准差和变异系数也呈逐渐增大的趋势。
3、 本发明试剂盒检测结果可靠性验证
为了验证本发明试剂盒检测结果的可靠性，对实时荧光定量PCR反应产物进行 琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。其中，1、 2为反应产物，3为124bp的阳 性对照，N为阴性对照，M为100bpMarker。检测结果与目的片段大小一致，对PCR 反应产物测序，经NCBI-Blast分析，结果表明，产物序列为结核杆菌基因序列。
利用本发明试剂盒进行的检测过程可以用罗氏LightCycler仪器来完成，软件 版本是3.5，具体操作过程如下
(1) 加样
取提取物样品(包括待测样品、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质控品) 上清液2uL以及阳性定量参考品2uL，分别加入专用毛细管中，盖上PCR反应盖(注 意盖反应盖时，手用力方向要垂直，以免毛细管断裂)4000rpm离心3分钟，按顺 序插入圆形卡盘倒置20秒钟后放入仪器。
(2) 结果分析
反应结束后自动保存检测数据文件，调整荧光记数值(Fluorescence)为F1/F2, 点击Quantification进入分析界面。在Analysis栏选择Fit Points, Baseline Adjustment 栏选择Proportional,调节噪声容限至基线噪声以上，要求在Step3 Analysis下r数 值介于一l.O 一0. 97。
记录Calculated Concentration下面仪器自动分析计算出的未知标本数值(C)。
(3) 质量控制 阴性质控品Ct值为空白；
阳性质控品增长曲线呈S型曲线，且强阳性质控品定量参考值在5.0X 105IU/mL — 5. 0X107IU/mL范围，临界阳性质控品定量参考值在2. 0X 102IU/mL—5. 0
X 104IU/mL范围；(参考值为仪器自动分析计算出的数值)
阳性定量参考品增长曲线呈S型曲线，Ct值〈37，且0.97《lrl《l; 以上要求需在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。 (4)结果判定
Ct值〈33为阳性，且Ct值〈33时定量值有参考意义；Ct值〉33时，定量值 无参考意义。
五、本发明试剂盒检测灵敏度、线性范围和特异性的确定
1、 本发明试剂盒检测灵敏度的确定
对阳性样本以IO倍梯度进行稀释，最低浓度为1.0X10 IU/mL，然后以各浓度 稀释液为模板进行实时PCR检测。结果表明，荧光信号随样本浓度下降而降低，1.0 X103 IU/raL浓度以上的可以检测到荧光信号，因此确定本发明试剂盒对处理后样 品检测的灵敏度为1.0X103 IU/mL。
2、 本发明试剂盒检测线性范围的确定
对DNA浓度为1. OX 10 —1. OX 1(y。IU/mL的标准品进行检测，发现浓度小于1. 0 X103lU/mL和大于1.0X108lU/mL的增长曲线不呈S型曲线，不在检测的线性范围 之内，可见，本发明试剂盒检测的线性范围为1.0X 103 —1.0X 108IU/mL。
(1) 如果增长曲线不呈S型曲线、Ct值为空白或Ct〉33则样品的结核杆菌 DNA总含量小于检测极限。
(2) 如果增长曲线呈S型曲线且Ct值〈33，则按以下方法判断 若样品的C〈1.000E + 03，则样品的结核杆菌DNA总含量〈1.0X103 IU /mL; 若样品的1.000E+03《C《1.000E+08，则样品的结核杆菌DNA总含量二C IU
AiL;
若样品的C >1.000E + 08，则样品的结核杆菌DNA总含量〉1.0X108111 /mL。 当样品的C 〉1.000E+08时，若需要精确定量结果，可将提取后的样品稀释至 线性范围内再检测。
3、 本发明试剂盒特异性实验
分别用结核杆菌DNA提取物、金黄色葡萄球菌DNA提取物、肺炎链球菌DNA提 取物、肺炎克雷伯杆菌DNA提取物为模板进行实时PCR检测。结果只有以结核杆菌 DNA为模板的样品检测到荧光信号，以金黄色葡萄球菌DNA提取物、肺炎链球菌DNA 提取物、肺炎克雷伯杆菌DNA提取物为模板的PCR反应，均未检测到荧光信号。
实施例3、用痰涂片和影像学诊断结果为阳性的样品对本发明试剂盒的检验结 果进行验证
一、 样品来源
深圳出入境检验检疫局提供的痰涂片和影像学诊断结果为结核杆菌阳性的患
者痰液共109例。
二、 检测方法、步骤和结果
检测方法和步骤同实施例2。
结果表明，经本发明试剂盒检测，结核杆菌阳性有108例，阳性率为99%。
<160> 3
〈210〉 1
<211> 22
<212〉 DNA <213〉人工序列
<400〉 1
cggtcttgtataggccgttgat 22
〈210〉 2
<211> 22
〈212〉 DNA <213>人工序列
<400〉 2
cagtacacatcgatccggttca 22
<210> 3
〈211〉 23
<212〉 DNA 〈213〉人工序列
<400> 3
ttgtcataggagcttccgaccgc 2权利要求
1、一种检测结核杆菌的专用探针，其碱基序列如SEQ IN NO3所示。
2、 根据权利要求1所述的探针，其特征在于所述探针的一端连接有荧光淬灭 基团，另一端连接有荧光报告基团。
3、 根据权利要求2所述的探针，其特征在于所述探针的3'端连接有一个荧光 淬灭基团T扁RA， 5'端连接有一个荧光报告基团FAM。
4、 一种检测结核杆菌的专用引物，由正向引物和反向引物组成，所述正向引物 的碱基序列如SEQ IN N0: l所示，所述反向引物的碱基序列如SEQ IN NO: 2所示。
5、 一种检测结核杆菌的试剂盒，包括权利要求l、 2或3所述的探针和权利要求 4所述的专用引物。
6、 根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括结核杆菌基 因PCR扩增试剂。
7、 根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于所述PCR扩增试剂为2XProbe —PCR Master Mix。
8、 根据权利要求6或7所述的试剂盒，其特征在于所述试剂盒还包括结核杆 菌标准品，该标准品包括阳性定量参考品、阴性质控品、临界阳性质控品和强阳性质 控品，其中阳性定量参考品的浓度梯度为108、 107、 106、 105 copies / mL。
9、 一种利用权利要求5所述的试剂盒检测结核杆菌的方法，是提取待测痰液DNA, 并以其为模板，用权利要求5所述试剂盒进行荧光定量PCR检测。
10、 根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述实时荧光定量PCR的反应程 序为95°C 15min ， 1个循环；94°C 10s， 60°C 20s， 72°C 30s ， 40个循环。
全文摘要
本发明公开了一种检测结核杆菌的试剂盒及其专用探针与引物，本发明所提供的专用探针的碱基序列如SEQ IN NO3所示，所述专用引物由正向引物和反向引物组成，所述正向引物的碱基序列如SEQ IN NO1所示，所述反向引物的碱基序列如SEQIN NO2所示。用本发明的方法检测结核杆菌具有快速简单、灵敏度高、特异性强的优点，解决了现有结核杆菌检测方法中检测周期长、阳性率低的不足，具有重要的实际应用价值。
文档编号C12Q1/68GK101168779SQ20071017686
公开日2008年4月30日 申请日期2007年11月6日 优先权日2007年11月6日
发明者刘胜牙, 叶健忠, 兵 吴, 朱玉兰, 王佃鹏, 高朝贤, 黄宗炎 申请人:深圳国际旅行卫生保健中心