人与动物共患结核病荧光pcr快速诊断试剂盒的制作方法

专利名称：：人与动物共患结核病荧光pcr快速诊断试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒，更具体地说是针对引起人、畜、禽结核病的各种病原菌或病原菌复合群提供实时荧光PCR快速检测方法和诊断试剂，包括检测结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群的实时荧光PCR方法和试剂，属于生物
技术领域：
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背景技术：
：结核病是威胁人类及动物健康的重大传染病。世界卫生组织(WHO)专门发布了全球结核控制战略，并把每年的3月24号定为世界防治结核病日。结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex,MTC)是人及哺乳动物的结核病原菌，包括结核分枝杆菌(又称人型结核分枝杆菌，Mycobacteriumtuberculosis,M.tuberculosis)，牛分枝杆菌(牛型结核分枝杆菌，Mycobacteriumbovis,M.bovis)，卡介苗BCG(MycobacteriumbovisBCG，BCG)，非洲l分枝杆菌(Mycobacteriumafricanum,M.africanum)禾Q田鼠分枝杆菌(Mycobacteriummicroti,M.microti)。其中，结核分枝杆菌、牛分枝杆菌为主要的人畜结核致病菌。人结核病主要由结核分枝杆菌(M.tuberculosis，又称人型结核分枝杆菌)引起。据统计，世界约1/3人口感染结核分枝杆菌，每年约300万人死于人结核。我国结核病患者数量位居世界第二位。结核分枝杆菌可感染牛、猪等动物，引起动物结核病，存在通过动物进一步扩大在人畜间传染的危险。牛分枝杆菌(M.bovis，又称牛型结核分枝杆菌)是牛结核病的主要致病菌。牛分枝杆菌还可感染人、猪、猴、鹿等约50种温血动物和20多种禽类。牛结核病被世界动物卫生组织(OIE)列为B类疫病，是进出境动物重点检疫的疫病之一。据报道，牛结核病所造成的损失大于牛的其他各种疾病所造成的损失总和，每年牛结核病给世界造成的经济损失达30多亿美元。牛结核病在世界各国均有发生，在我国依然是最常见的多发性疾病。发达国家纷纷制定牛结核病根除计划，我国也由政府组织每年春、秋季开展牛结核防疫工作。牛分枝杆菌和结核分枝杆菌感染人类或动物引起的结核病变临床不能区分。调査表明，牛群中的牛结核感染与人群中结核病发病有直接关联，特别是在未执行牛结核根除计划的发展中国家。牛分枝杆菌传播感染人类造成公共卫生难题。由牛分枝杆菌感染引起的人肺结核可达5%-10%以上。WHO专家委员会曾指出"除非扑灭牛结核病，否则人类结核病的控制不会成功"。此外，艾滋病患者合并感染牛分枝杆菌的情况正得到愈来愈多的关注。另一方面，由于牛分枝杆菌可通过牛奶排出，奶制品中牛分枝杆菌的污染及其与人肺结核的关联在发达国家早已得到重视，并采取针对性措施。禽结核病主要在家禽中发生，被OIE列为B类疫病，被我国列为三类动物疫病。该病由禽分枝杆菌(Mycobacteriumavium,M.avium，又称鸟分枝杆菌，禽型结核分枝杆菌)引起。禽分枝杆菌还可感染猪、牛等大动物，除危害家畜健康，其感染还干扰牛结核菌素皮试(PPD)结果，造成假阳性，影响牛结核病防治、根除及进出境动物检疫。禽分枝杆菌、副结核分枝杆菌均属禽分枝杆菌复合群(Mycobacteriumaviumcomplex,MAC)。该群除上述两种病原菌外，还包括胞内分枝杆菌(Mycobacteriumintracellulare)禾口瘰疬分枝杆菌(Mycobacteriumscrofulaceum)。近年来，MAC在人群中的感染呈上升趋势，众多的临床实例表明MAC是与艾滋病合并感染的主要非结核分枝杆菌。综上所述，人及动物的结核、副结核病涉及多种病原菌，它们均属分枝杆菌属，结构相似，抗原性有交叉，常规方法难于鉴别。针对相关病原菌或病原菌复合群建立可靠的鉴别、鉴定技术，是有效防控和诊治结核、副结核病的重要技术保障，对于公共卫生，养殖业健康发展、动物进出口贸易以及奶制品食品安全均具有重要意义。目前国内外用于诊断结核病的检验方法，大体上可分为3类第一类是细菌学检验方法，如染色镜检、细菌培养和动物接种等；第二类是采用免疫学方法检测结核菌的特异性抗体，如皮内变态反应、酶联免疫吸附试验(ELISA)和补体结合试验(CF)方法等；第三类是采用分子生物学检验方法，如PCR-RFLP、PCR-核酸探针、多重PCR等。由于分枝杆菌生长缓慢，细菌分离培养周期长(常需数周时间)，传统的细菌学检查方法难于适应进出境检验检疫快速通关需求，也不利于疾病临床诊疗。皮内变态反应是世界动物卫生组织(OIE)推荐的牛结核病诊断方法，也是目前在进出境动物检疫、牛结核病疾病防控、根除等方面常采用的方法，但由于试剂质量以及非典型分枝杆菌的干扰等原因，常造成非特异性反应。ELISA和CF方法等免疫学方法在特异性方面尚存在争议，国内目前尚缺乏可靠的免疫学诊断试剂。随着分子生物学技术的发展，国内外众多实验室开展了结核、副结核PCR方法研究，但检测方法和试剂盒缺乏规范化、标准化是影响PCR结果准确性的关键。世界卫生组织于2006年IO月发表报告指出，世界迫切需要投资研究更有效和费用更低的结核病诊断方法，尽早发现病情尽早治疗，以减少这种疾病对人类、特别是对发展中国家人口的危害。本发明方法采用TaqMan实时荧光PCR，其具体原理为在PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'—3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到报告基团发出的荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。荧光PCR等分子生物学方法具有快速、灵敏、特异性强的优点。随着分子生物学技术的发展及相关仪器设备、配套试剂的商业化推广，实时荧光PCR作为一种快速高效的检测技术，已在人、动植物传染病诊断领域得到愈来愈广泛的应用。它比常规PCR方法更为快速、敏感，并能有效避免交叉污染和便于实现自动化，迄今已应用于禽流感、链球菌、口蹄疫、乙肝等人畜疾病的快速诊断并已在国内建立检测方法标准。
发明内容本发明要解决的技术问题是提供一组检验人与动物共患结核病的核苷酸序列。本发明要解决的另一个技术问题是提供一种针对人与动物共患结核病各种病原菌的检测试剂盒，具体而言提供了结核分枝杆菌荧光PCR检测试剂、牛分枝杆菌荧光PCR检测试剂、禽分枝杆菌荧光PCR检测试剂和结核分枝杆菌复合群荧光PCR检测试剂。为实现上述目的，本发明采用以下技术方案-一组检验人与动物共患结核病的核苷酸序列，通过己发表的文献分析总结出待测病原体的特异性核酸序列，釆用Primerexpess2.0软件设计得到是序列表SEQIDNo.l至序列表SEQIDNo.l2所示的核苷酸序列，其中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2为检验结核分枝杆菌的引物对，SEQIDNo.3为检验结核分枝杆菌的探针序列；SEQIDNo.5和SEQIDNo.6为检验牛分枝杆菌的引物对，SEQIDNo.7为检验牛分枝杆菌的探针序列；SEQIDNo.9禾卩SEQIDNo.10为检验禽分枝杆菌的引物对，SEQIDNo.ll为检验禽分枝杆菌的探针序列；SEQIDNo.l3禾nSEQIDNo.14为检验结核分枝杆菌复合群的引物对，SEQIDNo.15为检验结核分枝杆菌复合群的探针序列。所述序列还包括如下衍生序列和扩增序列-(1)引物SEQIDNo.l和SEQIDNo.2所组成的引物对、SEQIDNo.l和SEQIDNo.2的互补序列，以及引物SEQIDNo.l向5'端延伸IO个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.2向3'端延伸IO个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.l和引物SEQIDNo.2扩增的核酸序列SEQIDNo.4，扩增序列SEQIDNo.4向5'端和3'端各延伸IO个碱基的核酸序列以及各自的互补序列；(2)引物SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所组成的引物对，SEQIDNo.5和SEQIDNo.6的互补序列，以及引物SEQIDNo.5向5'端延伸10个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.6向3'端延伸10个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.5和引物SEQIDNo.6扩增的核酸序列SEQIDNo.8，扩增序列SEQIDNo.8向5'端和3'端各延伸10个碱基的核酸序列以及各自的互补序列；(3)引物SEQIDNo.9和SEQIDNo.10所组成的引物对，SEQIDNo.9禾BSEQIDNo.10的互补序列，以及引物SEQIDNo.9向5'端延伸10个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.10向3'端延伸10个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.9和引物SEQIDNo.10扩增的核酸序列SEQIDNo.l2，扩增序列SEQIDNo.12向5'端和3'端各延伸10个碱基的核酸序列以及各自的互补序列；(4)引物SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所组成的引物对，SEQIDNo.13和SEQIDNo.14的互补序列，以及引物SEQIDNo.13向5'端延伸IO个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.14向3'端延伸10个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.13和引物SEQIDNo.14扩增的核酸序列SEQIDNo.l6，扩增序列SEQIDNo.16向5'端和3'端各延伸10个碱基的核酸序列以及各自的互补序列；(5)结核分枝杆菌的探针序列SEQIDNo.3，SEQIDNo.3的互补序列，以及探针的5'端和向上延伸10个碱基和3'端向下延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及其互补序列；(6)牛分枝杆菌的探针序列SEQIDNo.7，SEQIDNo.7的互补序列，以及探针的5'端和向上延伸10个碱基和3'端向下延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及其互补序列；(7)禽分枝杆菌的探针序列SEQIDNo.ll，SEQIDNo.ll的互补序列，以及探针的5'端和向上延伸10个碱基和3'端向下延伸IO个碱基区域范围内得到的探针序列及其互补序列；(4)结核分枝杆菌复合群的探针序列SEQIDNo.15，SEQIDNo.15的互补序列，以及探针的5'端和向上延伸10个碱基和3'端向下延伸IO个碱基区域范围内得到的探针序列及其互补序列。所述探针序列的5'端标记的荧光染料，包括但不限于FAM、JOE、TET和HEX等染料，3'端标记的淬灭荧光染料包括但不限于TAMARA、Eclipse和BHQ。人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒包括1)4种PCR反应液，各含1XPCR缓冲液；0.2pmol/L引物I;0.2pmol/L引物II，0.1nmol/L探针；200pmol/LdNTP，MgCl22.5mmol/L;2)Taq酶2.5，1;3)阴性对照生理盐水4)阳性对照携带有扩增产物的质粒DNA4种RT-PCR反应液分别为结核分枝杆菌反应液、牛分枝杆菌反应液、禽分枝杆菌反应液和结核分枝杆菌复合群反应液；结核分枝杆菌反应液中的引物I为SEQIDNo.l，引物II为SEQIDNo.2，探针为SEQIDNo.3;牛分枝杆菌反应液中的引物I为SEQIDNo.5，引物II为SEQIDNo.6，探针为SEQIDNo.7;禽分枝杆菌反应液中的引物I为SEQIDNo.9，引物II为SEQIDNo.lO，探针为SEQIDNo.ll;结核分枝杆菌复合群反应液中的引物I为SEQIDNo.l3，引物II为SEQIDNo.l4，探针为SEQIDNo.15，所述探针5'端标记FAM、HEX、TET、JOE、ROX或VIC等荧光染料，探针3'端标记TAMARA、Elcipse或BHQ淬灭标记。通过对引物和探针浓度，Mg^浓度、Taq酶浓度以及PCR变性和退火温度的优化，建立了最适的PCR反应体系和PCR反应条件。荧光PCR检测试剂盒最适PCR反应体系见下表1。表1荧光PCR检测试剂盒最适PCR反应体系组分_使用浓度_引物I0.2pmol/L引物II0.2pmol/L探针O.lnmol/L10xPCR缓冲液lxMgCl22.5mmol/LdNTPs0.2,ol/LTaq酶1U模板3^1PCR反应体系为30^1，不足的都用双蒸水补充结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌和结核分枝杆菌复合群的最适PCR反应条件为第一步50。C3分钟；第二步95。C4分钟；第三步95。C10秒，60。C30秒，40个循环，60'C时设置采集荧光。本发明结果判定采用扩增曲线和Ct值为判定标准(1)阴性对照为阴性，Ct值显示为None，阳性对照的Ct值应小于等于28.0。否则，此次实验视为无效。(2)Ct值显示为None的样本为阴性样本，Ct值^33.0的样本为阳性。(3)Ct值大于33.0的样本建议重做。重做结果显示为None为阴性，否则为阳性。本发明方法的具体步骤(1)设计合成引物和探针。(2)、釆集样品，提取核酸。本发明可检测细菌培养液、动物活体采集的样品如血液、奶液、痰液和粪便等，以及通过剖检釆集的组织样品，如淋巴结等。采用蛋白酶K消化，高温裂解、氯仿抽提等步骤从上述样品中提取核酸。(3)、加样。按上述反应液体系，在反应管中分别加入反应液和核酸，记录样品编号和对应管号。(4)、上机检测。在荧光PCR仪上，按上述扩增循环条件设定反应参数，放入反应管，开机检测。(5)、分析、判定结果。根据扩增曲线和Ct值判定结果全过程可在5小时内结束。本发明采用实时荧光PCR诊断人和动物共患结核病，可以同时先采用结核分枝杆菌复合群荧光PCR检测试剂和禽分枝杆菌荧光PCR检测试剂检测是否存在结核病病原菌，然后通过结核分枝杆菌荧光PCR检测试剂和牛分枝杆菌荧光PCR检测试剂对结核分枝杆菌复合群荧光PCR检测试剂阳性的样本进行分型，可以快速准确进行诊断。本发明适用于进出境检验检疫对人员、动物及其产品进行结核病快速排查、人与动物结核病疫情防控、食品安全以及诊断和流行病学调査领域对结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌、禽分枝杆菌感染的快速检测、监控和防治。本发明的优点是(l)特异性好，实时荧光PCR技术通过引物或和探针的特异性杂交对模板进行鉴别，具有很高的准确性，假阳性低；(2)灵敏度高，采用灵敏的荧光检测系统对荧光信号进行实时监控；(3)操作简单，自动化程度高，不需要传统PCR扩增后的产物电泳检测等步骤；(4)不易污染，闭管扩增，不需要开盖，交叉污染和污染环境机会少。下面结合附图和具体实施方式对本发明发明作进一步说明，并非对本发明的限定，依照本领域公知的现有技术，本发明的实施方式并不限于此，因此凡依照本公开内容所作出的本领域的等同替换，均属于本发明的保护范围。图1为采用结核分枝杆菌复合群荧光PCR试剂盒对人痰液样品的检测图。图2为人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒结核分枝杆菌荧光PCR反应液特异性试验检测图l.阳性质粒样品；2.结核分枝杆菌标准菌株；3.结核分枝杆菌临床分离株。图3为人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒牛分枝杆菌荧光PCR反应液特异性试验检测图l.阳性质粒样品；2.牛分枝杆菌标准菌株；3.BCG菌株。图4为人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒禽分枝杆菌荧光PCR反应液特异性试验检测图l.阳性质粒样品1;2.阳性质粒样品2;3.禽分枝杆菌标准菌株。图5为人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒结核分枝杆菌复合群荧光PCR反应液特异性试验检测图l.阳性质粒样品；2.结核分枝杆菌标准菌株；3.牛分枝杆菌标准菌株；4.BCG菌株；5.结核分枝杆菌临床分离株。图6为人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒结核分枝杆菌荧光PCR反应液对阳性质粒模板的敏感性试验检测图。图7为人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒牛分枝杆菌荧光PCR反应液对阳性质粒模板的敏感性试验检测图。图8为人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒禽分枝杆菌荧光PCR反应液对阳性质粒模板的敏感性试验检测图。图9为人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒核分枝杆菌复合群荧光PCR反应液对阳性质粒模板的敏感性试验检测图。具体实施例方式实施例1:人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒引物和探针的制备根据结核分枝杆菌特异性的229bp序列，选择其中的一条序列(GeneBankNo.CP000611)，采用Primerexpress2.0软件，根据引物的退火温度在60°C以及探针的退火温度比引物的退火温度高l(TC左右的原则，选择了引物SEQIDNo.1、SEQIDNo.2和探针SEQIDNo.3，Blast同源性分析显示，选择的引物和探针为结核分枝杆菌复合群的特异性序列，与其它序列无同源性。引物扩增产物SEQIDNo.4的长度为91bp。根据牛分枝杆菌的特异性12.7kb的缺失序列，选择其中的一条序列(GeneBankNo.AM408590),采用Primerexpress2.0软件，根据引物的退火温度在60°C以及探针的退火温度比引物的退火温度高l(TC左右的原则，选择了引物SEQIDNo.5、SEQIDNo.6和探针SEQIDNo.7，Blast同源性分析显示，选择的引物和探针为结核分枝杆菌复合群的特异性序列，与其它序列无同源性。引物扩增产物SEQIDNo.8的长度为90bp。根据禽分枝杆菌的共有序列IS1245插入序歹U，选择其中的一条序列(GeneBankNo.L33879),采用Primerexpress2.0软件，根据引物的退火温度在6(TC以及探针的退火温度比引物的退火温度高IO'C左右的原则，选择了引物SEQIDNo.9、SEQIDNo.10和探针SEQIDNo.11,Blast同源性分析显示，选择的引物和探针为结核分枝杆菌复合群的特异性序列，与其它序列无同源性。引物扩增产物SEQIDNo.12的长度为94bp。根据结核分枝杆菌复合群的共有序列IS6110插入序列，选择其中的一条序列(GeneBankNo.DQ217928)，采用Primerexpress2.0软件，根据引物的退火温度在60°C以及探针的退火温度比引物的退火温度高lO'C左右的原则，选择了引物SEQIDNo.13、SEQIDNo.14和探针SEQIDNo.15，Blast同源性分析显示，选择的引物和探针为结核分枝杆菌复合群的特异性序列，与其它序列无同源性。引物扩增产物SEQIDNo.16的长度为125bp。探针的5'端标记的荧光染料FAM,3'端标记的淬灭荧光染料TAMARA。引物、探针以及扩增产物的核苷酸序列见序列表。探针和引物委托大连宝生物工程技术有限公司合成。实施例2:人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒PCR检测反应体系的建立和优化一.方法1.引物、探针浓度的优化实验中将引物浓度从0.1pmol/L至0.6pmol/L以0.1pmol/L递增，探针浓度从0.025pmol/L至0.2pmol/L以0.025pmol/L递增。采用矩阵法进行对比试验，对比试验的其它条件完全一致。2.TaqDNA聚合酶(Taq酶)的优化Taq酶一个单位的定义74'C作用30分钟，能将lO^mol/L的dNTPs掺入酸溶性物质中所需要的酶量。活性要求具DNA聚合酶活性及5'—3'核酸外切酶活性，无3'—5'核酸外切酶活性及核酸内切酶活性；具热稳定性，94°C1小时后仍保持50%活性。3.Mg&浓度的优化M^+会影响PCR反应的特异性和扩增效率，在固定其它反应成分不变的情况下，采用MgS+浓度梯度，对Mg^浓度进行了优化，Mgh浓度从1.5mmol/L开始，以0.5mmol/L递加，直到6mmol/L4.PCR反应条件的优化为了提高PCR反应的灵敏度和特异性，根据设计的引物和探针退火温度，以57'C为基础，以0.5'C递加，直到62'C，在此基础上进行退火温度优化。采用的反应体系如下10xPCR缓冲液3^1，25mmol/LMgCl23pl，2.5mmol/LdNTPs2.4pl，lOpmol/L引物I0.6nl，lOpmol/L引物II0.6pl，lO^tmol/L探针0.6pl，5U/nlTaq酶lpl，双蒸水13.7pl，模板3pl。在MJresearchOpticon1上进行检测，按如下反应条件设置第一步50°C,3分钟；第二步94°C，5分钟；第三步94°C，10秒，57-62°C，40秒，40个循环。MJresearchOpticonl具备梯度PCR功能，可以同时进行温度梯度实验。二.结果1.引物、探针浓度的优化多次重复实验中引物浓度为0.2pmol/L，探针浓度为O.lpmol/L时荧光增幅较高，Ct值较小，所以选定引物浓度为0.2pmol/L，探针浓度为0.1^mol/L作为人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒的引物和探针浓度。2.TaqDNA聚合酶(Taq酶)的优化Taq酶用量(以单位Unit计，简写U)的优化实验在相同反应条件，但酶的用量不同的条件下进行，试验结果见表2。根据实验结果选定1U作为酶的最适用量。表2:T叫酶用量优化实验结果<table>tableseeoriginaldocumentpage14</column></row><table>3.Mg^浓度的优化结果表明Mg^浓度越低反应的特异性越强，但扩增效率下降，反之，Mg&浓度越高，扩增效率有所提高，但特异性受到影响，本发明最终选定的实际Mg^浓度为2.5mmol/L。4.PCR反应条件的优化实验结果表示，退火温度越高，反应的特异性越强，但扩增效率有所下降，反之温度越低，扩增效率有所提高，但特异性有所降低。本发明选择6(TC作为实际的退火温度，特异性和扩增效率都能够达到最优的组合。实施例3:人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒试剂盒包括如下组分，保藏温度为-20'C1)四种PCR反应液(结核分枝杆菌荧光PCR反应液、牛分枝杆菌荧光PCR反应液、禽分枝杆菌荧光PCR反应液和结核分枝杆菌复合群荧光PCR反应液)，含1XPCR缓冲液；0.2pimol/L引物I;0.2|amol/L引物II，0.1pmol/L探针；200pmol/LdNTP,MgCl22.5mmol/L;2)Taq酶2.5Ul;3)阴性对照灭菌生理盐水4)阳性对照携带有扩增产物的质粒DNA阳性对照的制备方法-采用引物SEQIDNo.1和引物SEQIDNo.2，以结核分枝杆菌的DNA为模板，采用引物SEQIDNo.5和引物SEQIDNo.6，以牛分枝杆菌的DNA为模板；采用引物SEQIDNo.9和引物SEQIDNo.10，以禽分枝杆菌的DNA为模板；采用引物SEQIDNo.13和引物SEQIDNo.l4，以结核分枝杆菌的DNA为模板，分别进行PCR扩增，回收并纯化PCR产物，与pEASY-Blunt平端载体(购于北京全式金生物技术有限公司)连接，并转化大肠杆菌，采用常规PCR和测序对重组质粒进行验证。重组质粒分别命名为pEASY-MT(结核分枝杆菌荧光PCR反应液的阳性对照)；pEASY-MB(牛分枝杆菌荧光PCR反应液的阳性对照)；pEASY-MA(禽分枝杆菌荧光PCR反应液的阳性对照)和pEASE-IS6110(结核分枝杆菌复合群荧光PCR反应液的阳性对照)。将含重组质粒的大肠杆菌进行增菌培养后，采用质粒提取试剂盒(购于大连宝生物工程有限公司)纯化重组质粒DNA，测OD26o吸光度值，根据公式质粒拷贝数/^={总含量(pg/pl)W质粒分子碱基数xl(T'、g)换算成对应基因拷贝数。将纯化后的质粒稀释到2000拷贝/ml，作为试剂盒的阳性对照。实施例4:人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒检测临床样品一.样品釆集1.抗凝全血抽取动物血液与柠檬酸钠或EDTA抗凝管中。2.尿采集早晨第一次尿中段尿液。3.奶样挤出之最后乳汁含菌量较多，早晨挤出的乳汁含菌量最高。常乳在分娩后1425天内收集，取样时，先将乳头用75%酒精棉拭子擦洗消毒34次，弃去前几把始乳后，约收集200ml乳样于无菌的容器中。4.粪便选取混有粘液、血液、粘膜的粪便或用刮钥从动物直肠深部(约30cm)取少量粘液粪便，盛于灭菌容器中。5.痰牛咯痰极少，宜在清晨采集用橡胶管自口腔伸入至气管内，外锻连接注射器吸取痰液。亦可取出牛咳出的痰块。二.样本的运输和保存待测样本在2-8。C保存不应超过24小时；-20匸保存不超过三个月；-80°。以下长期保存。样本运输采用冰壶加冰或泡沫箱加冰密封进行。三.样本的处理(在样本制备区进行)1.抗凝全血、血清、尿和脑脊液的处理方法(1)取1.2mL抗凝全血或尿或脑脊液样本，10,000rpm离心10min，弃上清。(2)加等体积灭菌双蒸水充分振荡使沉淀悬浮，10,000rpm离心10min，弃上清。(3)重复歩骤(2)。血清可省略歩骤(2)和(3)。(4)加lmL灭菌生理盐水，充分振荡使沉淀悬浮，10,000rpm离心10min，弃上清。(5)加入30iUDNA提取液，振荡混匀，4000rpm离心5s，56。C温浴30min，98°C温浴10min。(6)4000rpm离心5s，待液体冷却，加入等体积氯仿，振荡混匀后，10,000rpm离心10min。(7)取上清，直接用于PCR或贮存于-2(TC备用。2.奶样的处理方法(1)取1.5ml奶样，10,000rpm离心10min，吸弃液体，保留上层油脂层及沉淀。(2)加灭菌生理盐水1mL，充分振荡混匀使沉淀悬浮，10,000rpm离心10min，弃上清。(3)重复步骤(2)。(4)加入50ulDNA提取液，振荡混匀，4,000rpm离心5s，56。C温浴30min，98。C温浴10min。(5)4,000rpm离心5s，待液体冷却，加入等体积氯仿，振荡混匀后，10,000rpm离心10min。(6)取上清，直接用于PCR或5C存于-2(TC备用。3.痰的处理方法(1)在样本中加入23倍体积4X的NaOH溶液，摇匀，室温液化20min,使其充分液化(无明显固状物并且吸出时无拖丝现象即为液化完全；若液化不完全，可适当再加入少量4%的NaOH溶液直至液化完全)。(2)取样本1.5ml,10,000rpm离心10min，弃上清。(3)加灭菌生理盐水1mL，充分振荡混匀使沉淀悬浮，10,000rpm离心10min，弃上清。(4)重复步骤(3)。(5)加入50ulDNA提取液，振荡混匀，4，000rpm离心5s，56。C温浴30min，98。C温浴10min。(6)4,000卬m离心5s，待液体冷却，加入等体积氯仿，振荡混匀后，10，000rpm离心10min。(7)取上清，直接用于PCR或贮存于-20'C备用。4.组织样本的处理方法(1)取淋巴结等组织(剔除外面脂肪)lg，加2ml柠檬酸钠磷酸缓冲液[l]，充分研磨成乳剂。(2)加4。/。NaOH溶液2ml，继续研磨5-10min，使组织液化。(3)充分振荡，75'C温浴0.5-1hr。(4)取1.5ml悬浮液(避免吸取粗渣)，10,000rpm离心10min，弃上清。(5)加灭菌生理盐水1mL，充分振荡混匀使沉淀悬浮，10，000rpm离心10min，弃上清。(6)重复歩骤(5)。(7)加入50ulDNA提取液，振荡混匀，4,000rpm离心5s，56。C温浴30min，98。C温浴10min。(8)4,000rpm离心5s，待液体冷却，加入等体积氯仿，振荡混匀后，10,000rpm离心10min。(9)取上清，直接用于PCR或贮存于-2(TC备用。5.粪样的处理方法(1)取粪样l-2g，按1:5的比例加入4%硫酸溶液(例lg粪样，力n5mL液体)振荡混匀，37。C温浴0.5-lhr。(2)取中、上层较澄清液体1.5mL，800rpm离心1min，小心吸取上清。(3)10,000rpm离心10min，弃上清。(4)加1mL灭菌生理盐水，用吸嘴混匀并充分振荡，10,000ipm离心10min。(5)重复步骤(4)。(6)弃上清，加入100ulDNA提取液，用吸嘴混匀并充分振荡，56'C温浴30min，98。C温浴10min。(7)10,000rpm离心5min，取上清。(8)加等体积氯仿，振荡混匀，12,000rpm离心10min，小心吸取上清。(9)加入二倍体积异丙醇(-20。C预冷)，颠倒混匀，放置5-10min。(10)4。C，12,000rpm离心10min，弃上清。(11)加300y170%乙醇(4。C预冷)，振荡洗涤。(12)4°C，12,000rpm离心10min，小心吸弃上清，吸头不要碰到有沉淀一面，倒置于吸水纸上，尽量沾干液体(不同样品需在吸水纸不同地方沾干)，在洁净工作台室温干燥5min。(13)加入30ul灭菌双蒸水，轻轻混匀，溶解管壁上的核酸，室温放置10min，直接用于PCR或贮存于-20'C备用。四.扩增检测1.扩增试剂准备(在反应混合物配制区进行)取出结核分枝杆菌复合群(MTC)荧光PCR反应液，在室温下融化后，6000rpm离心5秒，每个PCR反应按以下用量配制PCR反应混合液(需配制反应液数量=样本个数+阴性对照+阳性对照)荧光PCR反应液26.6W，Taq酶0.4W。将以上PCR反应试剂按使用量吸取到一个离心管中，充分混匀，然后在每个PCR管中分装27W,转移至样本处理区。2.加样(样本处理区)在已分装有PCR反应混合液的PCR管中分别加入已提取好的核酸，盖上管盖，将PCR管放入荧光PCR检测仪内，记录样本放置顺序。3.PCR扩增检测(扩增检测区)反应条件设定第一歩50。C3分钟；第二步95。C4分钟；第三步95°C10秒，60'C30秒，40个循环，6CTC时设置采集荧光。4.荧光素设定ReportDye设定为FAM，QuenchDye都设定为Tamara，Referencedye设定为None。五.分析条件设定和结果判定综合分析仪器给出的各项结果，基线(baseline)以仪器给出的默认值作为参考，阈值(Threshold)设定原则以阈值线刚好超过正常阴性对照品扩增曲线的最高点为准，具体还需根据仪器噪音情况进行调整，选择FAM通道进行分析。(1)质控标准阴性对照为阴性，Ct值显示为None，阳性对照的Ct值应小于等于28.0。否则，此次实验视为无效。(2)结果分析及判定Ct值显示为None的样本为阴性样本，Ct值《33.0的样本为阳性，表明结核分枝杆菌复合群阳性。Ct值大于33.0的样本建议重做。重做结果显示为None为阴性，否则为阳性。六.对临床样品的检测实例按上述样品处理和荧光PCR检测方法，采用人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒，对门诊人群的痰液样品进行检测试验，结果检出多例阳性样品，见附图l。实施例5人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒特异性和敏感性试验一.方法1.特异性试验提取培养的结核分枝杆菌标准菌株与临床分离株、牛分枝杆菌标准菌株、禽分枝杆菌、副结核分枝杆菌、龟、蟾、草、堪萨斯、胞内、耻垢、胃、瘰疬、偶发分枝杆菌等非结核分枝杆菌菌株以及含PCR扩增模板的阳性重组质粒进行检测试验。2.敏感性试验l采用引物SEQIDNo.1和引物SEQIDNo.2,以结核分枝杆菌的DNA为模板，采用引物SEQIDNo.5和引物SEQIDNo.6，以牛分枝杆菌的DNA为模板；采用引物SEQIDNo.9和引物SEQIDNo.10，以禽分枝杆菌的DNA为模板；采用引物SEQIDNo.13和引物SEQIDNo.14，以结核分枝杆菌的DNA为模板，分别进行PCR扩增，回收并纯化PCR产物，与pEASY-Bhmt平端载体(购于北京全式金生物技术有限公司)连接，并转化大肠杆菌，采用常规PCR和测序对重组质粒进行验证。重组质粒分别命名为pEASY-MT(结核分枝杆菌荧光PCR反应液的阳性对照)；pEASY-MB(牛分枝杆菌荧光PCR反应液的阳性对照)；pEASY-MA(禽分枝杆菌荧光PCR反应液的阳性对照)和pEASE-IS6110(结核分枝杆菌复合群荧光PCR反应液的阳性对照)。将含重组质粒的大肠杆菌进行增菌培养后，采用质粒提取试剂盒(购于大连宝生物工程有限公司)纯化重组质粒DNA，测OD260吸光度值，根据公式质粒拷贝数^1={总含量(pg4d)}/{质粒分子碱基数><10-15^}换算成对应基因拷贝数。将质粒DNA采用无RNase,无DNase水进行10倍系列稀释，取各稀释度样品3pl，采用人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒按照实例3描述的扩增检测步骤进行检测试验，以测试试剂盒的检测灵敏度(基因拷贝数)。3.敏感性试验2取BCG冻干粉(卡介苗冻干粉，购于国家药品生物制品检定所)，用灭菌生理盐水充分溶解作为BCG原液(含大于5Xl(f菌细胞/ml)。将BCG原液用灭菌生理盐水进行10倍系列稀释。取BCG原液或各稀释度样品按一定量添加到阴性牛血样、奶样、粪样中，振荡混匀，置4T:过夜后提取DNA，按照实施例4所描述的方法，进行核酸提取和扩增检测。二.结果1.特异性试验结核分枝杆菌荧光PCR反应液对结核分枝杆菌标准菌株与临床分离株以及重组质粒pEASY-MT均呈典型阳性反应，其它分枝杆菌菌株的检测结果均为阴性反应，见附图2;牛分枝杆菌荧光PCR反应液对牛分枝杆菌标准菌株、卡介苗(BCG)和重组质粒pEASY-MB呈典型阳性反应，其它分枝杆菌菌株的检测结果均为阴性反应，见附图3;禽分枝杆菌荧光PCR反应液对禽分枝杆菌菌株及重组质粒pEASY-MA呈典型阳性反应，其它分枝杆菌菌株的检测结果均为阴性反应，见附图4;结核分枝杆菌复合群荧光PCR反应液对结核分枝杆菌标准菌株与临床分离株、牛分枝杆菌标准菌株以及重组质粒pEASY-MTC均呈典型阳性反应。检测结果与理论推导相符，见附图5。对大肠杆菌0:157,链霉菌、猪链球菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏杆菌、单增李斯特菌、致泻大肠埃希氏菌、阪崎肠杆菌、小肠结肠炎耶尔森氏菌、蜡样芽孢杆菌等多种常见微生物核酸样品，采用该试剂盒按照实例4描述的扩增检测步骤进行检测试验，结果显示均呈典型阴性反应。表明人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒检测特异性强。2.敏感性试验l:检测结果显示，结核分枝杆菌荧光PCR反应液的检测灵敏度可达10"质粒稀释度，相当于0.3个基因拷贝，见附图6;牛分枝杆菌荧光PCR反应液的检测灵敏度可达10"质粒稀释度，相当于2.5个基因拷贝，见附图7;禽分枝杆菌荧光PCR反应液的可达10"质粒稀释度，相当于1.8个基因拷贝，见附图8;结核分枝杆菌复合群荧光PCR反应液的可达10'2质粒稀释度，相当于0.24个基因拷贝，见附图9。3.敏感性试验2:检测结果显示采用荧光PCR试剂盒对血样、奶样的检测灵敏度均达到每个反应O.15-1.5个菌细胞，对粪样的检测灵敏度达到每个反应15个菌细胞。〈110〉广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心北京盈九思科技发展有限公司〈120〉人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒〈130〉〈160〉16〈170〉Patentlnversion3.3<210>1〈211〉21〈212〉DNA〈213>结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)<400〉1cggtgtaatcagttttgaagc21〈210〉2〈211〉20〈212〉DNA<213>结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)〈400〉2gcggacccattttcgatcaa20〈210〉3<211>28〈212〉DNA<213〉结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)〈400〉3taggtagtccagtagagccccatagcca28〈210>4〈211>91<212〉腿〈213〉结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis)〈400〉4cggtgtaatcagttttgaagccacgcgcatctaggtagtccagtagagccccatagccac60agcctagatcgttgatcgaaaatgggtccgc91<210>5〈211>21〈212〉DNA〈213>牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)〈400>5gacgccttcctaaccagaatt21<210>6<211>18〈212>腿〈213〉牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)〈400〉6ggagagcgccgttgtagg18<210>7<211>28〈212〉DNA<213〉牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)<400〉7aattcatacaagccgtagtcgtgcagaa28<210〉8〈211〉90〈212〉■〈213〉牛分枝杆菌(Mycobacteriumbovis)〈400〉8gacgccttcctaaccagaattgtgaattcatacaagccgtagtcgtgcagaagcgcaaca60ctcttggagtggcctacaacggcgctctcc90〈210〉9〈211>17〈212〉廳〈213〉禽分枝杆菌(Mycobacteriumavium)〈400〉9tccgcgtgagtctctgt17<210>10〈211〉17<212>腿<213>禽分枝杆菌(Mycobacteriumavium)〈400〉10cgagcacctccagcaag17〈210〉11〈211〉27<212>腿〈213〉禽分枝杆菌(Mycobacteriumavium)〈400>11acgaccaagaatcactaccgagsggaa27<210>12〈211〉94〈212〉謹<213〉禽分枝杆菌(Mycobacteriumavium)〈400〉12tccgcgtgagtctctgtggtgaaacgaccaagaatcactaccgagaggaacatcgcgatg60gccctggaccagtctgccttgctggaggtgctcg94〈210>13<211>18<212〉腿〈213〉结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)<400>13gCEigggttcgcctacgtg18〈210〉14〈211〉18〈212〉DNA〈213>结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)〈400〉14cgggtxcagatggcUgc18〈210〉15〈211〉22〈212>廳〈213>结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)〈400〉15tgtcaccgacgcctacgctcgc22<210>16<211>125〈212〉DNA〈213>结核分枝杆菌复合群(Mycobacteriumtuberculosiscomplex)〈400>16gcagggttcgcctacgtggcctttgtcaccgacgcctacgctcgcaggatcctgggctgg60cgggtcgcttccacgatggccacctccatggtcctcgacgcgatcgagcaagccatctgg120acccg12权利要求1.一组检验人与动物共患结核病的核苷酸序列，其特征在于是序列表SEQIDNo.1至序列表SEQIDNo.12所示的核苷酸序列，其中SEQIDNo.1和SEQIDNo.2为检验结核分枝杆菌的引物对，SEQIDNo.3为检验结核分枝杆菌的探针序列；SEQIDNo.5和SEQIDNo.6为检验牛分枝杆菌的引物对，SEQIDNo.7为检验牛分枝杆菌的探针序列；SEQIDNo.9和SEQIDNo.10为检验禽分枝杆菌的引物对，SEQIDNo.11为检验禽分枝杆菌的探针序列；SEQIDNo.13和SEQIDNo.14为检验结核分枝杆菌复合群的引物对，SEQIDNo.15为检验结核分枝杆菌复合群的探针序列。2.根据权利要求1所述的一组检验人与动物共患结核病的核苷酸序列，其特征在于所述序列为(1)引物SEQIDNo.l和SEQIDNo.2所组成的引物对、SEQIDNo.l和SEQIDNo.2的互补序歹i」，以及引物SEQIDNo.l向5，端延伸10个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.2向3'端延伸10个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.l和引物SEQIDNo.2扩增的核酸序列SEQIDNo.4，扩增序列SEQIDNo.4向5'端和3'端各延伸10个碱基的核酸序列以及各自的互补序列；(2)引物SEQIDNo.5和SEQIDNo.6所组成的引物对，SEQIDNo.5和SEQIDNo.6的互补序列，以及引物SEQIDNo.5向5'端延伸10个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.6向3'端延伸10个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.5和引物SEQIDNo.6扩增的核酸序列SEQIDNo.8，扩增序列SEQIDNo.8向5'端和3'端各延伸10个碱基的核酸序列以及各自的互补序列；(3)引物SEQIDNo.9禾BSEQIDNo.10所组成的引物对，SEQIDNo.9禾BSEQIDNo.10的互补序列，以及引物SEQIDNo.9向5'端延伸10个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.10向3'端延伸10个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.9和引物SEQIDNo.10扩增的核酸序列SEQIDNo.l2，扩增序列SEQIDNo.12向5'端和3'端各延伸10个碱基的核酸序列以及各自的互补序列；(4)引物SEQIDNo.13和SEQIDNo.14所组成的引物对，SEQIDNo.13和SEQIDNo.14的互补序列，以及引物SEQIDNo.13向5'端延伸IO个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.14向3'端延伸10个碱基的核酸序列，引物SEQIDNo.13和引物SEQIDNo.l4扩增的核酸序列SEQIDNo.l6，扩增序列SEQIDNo.16向5'端和3'端各延伸10个碱基的核酸序列以及各自的互补序列；(5)结核分枝杆菌的探针序列SEQIDNo.3，SEQIDNo.3的互补序列，以及探针的5'端和向上延伸IO个碱基和3'端向下延伸IO个碱基区域范围内得到的探针序列及其互补序列；(6)牛分枝杆菌的探针序列SEQIDNo.7，SEQIDNo.7的互补序列，以及探针的5'端和向上延伸IO个碱基和3'端向下延伸IO个碱基区域范围内得到的探针序列及其互补序列；(7)禽分枝杆菌的探针序列SEQIDNo.ll，SEQIDNo.ll的互补序列，以及探针的5'端和向上延伸10个碱基和3'端向下延伸10个碱基区域范围内得到的探针序列及其互补序列；(4)结核分枝杆菌复合群的探针序列SEQIDNo.15,SEQIDNo.15的互补序列，以及探针的5'端和向上延伸10个碱基和3'端向下延伸IO个碱基区域范围内得到的探针序列及其互补序列。3.人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒，其特征在于包括1)4种PCR反应液，各含1XPCR缓冲液；0.2pmol/L引物I;0.2pmol/L引物II，0.1|imol/L探针；200pmol/LdNTP，MgCl22.5mmol/L;2)Taq酶2.5U/^il;3)阴性对照生理盐水4)阳性对照携带有扩增产物的质粒DNA4种RT-PCR反应液分别为结核分枝杆菌反应液、牛分枝杆菌反应液、禽分枝杆菌反应液和结核分枝杆菌复合群反应液；结核分枝杆菌反应液中的引物I为SEQIDNo.l，引物II为SEQIDNo.2，探针为SEQIDNo.3;牛分枝杆菌反应液中的引物I为SEQIDNo.5,引物II为SEQIDNo.6，探针为SEQIDNo.7;禽分枝杆菌反应液中的引物I为SEQIDNo.9,引物II为SEQIDNo.lO，探针为SEQIDNo.ll;结核分枝杆菌复合群反应液中的引物I为SEQIDNo.l3，引物I1为SEQIDNo.l4，探针为SEQIDNo.l5，所述探针5'端标记FAM、HEX、TET、JOE、ROX或VIC等荧光染料，探针3'端标记TAMARA、Elcipse或BHQ淬灭标记。全文摘要本发明公开了一种人与动物共患结核病荧光PCR快速诊断试剂盒，属于生物
技术领域：
。一组检验人与动物共患结核病的核苷酸序列是序列表SEQIDNo.1至序列表SEQIDNo.12所示的核苷酸序列。发明公开的内容包括结核分枝杆菌复合群、结核分枝杆菌、牛分枝杆菌以及禽分枝杆菌特异的荧光PCR引物和探针序列，各试剂盒的荧光PCR反应体系、检测程序、反应参数和判定方法，以及菌液、奶样、血样、痰液、粪样、淋巴结等各种临床样品的前处理和核酸提取方法。本发明为人与动物结核病诊断提供了特异、敏感、快速的技术手段和质量可靠的诊断试剂。采用本发明提供的试剂盒方法，可在一天内完成从样品处理到荧光PCR检测全过程，检测灵敏度可达到单个基因拷贝或单个菌细胞。文档编号C12Q1/68GK101168780SQ200710176890公开日2008年4月30日申请日期2007年11月6日优先权日2007年11月6日发明者刘中勇,曾碧健,杨国海,林志雄,茹陈,高小博申请人:广东出入境检验检疫局检验检疫技术中心;北京盈九思科技发展有限公司