T型非病毒载体及包含其的复合药物的制作方法

专利名称：：T型非病毒载体及包含其的复合药物的制作方法
技术领域：
：本发明属于基因治疗药物领域。具体地说，本发明涉及非病毒载体融合蛋白TNF咖2-S0N2-GRP与限制性表达绿脓杆菌外毒素基因杀伤功能域高效突变型重组体5XNFBS-SCP-/^Y/iM/t的复合药物。非病毒载体中的TNFam2是强效低毒的肿瘤坏死因子a(TNFa)衍生物，S0N2是一种DNA结合蛋白，GRP是胃泌素释放肽。毒素基因重组体上的5XNFBS是经5次重复克隆的NF-icB的结合位点，SCP是一种肿瘤特异性启动子，/^//i^^是绿脓杆菌外毒素基因杀伤功能域高效突变型。本非病毒载体可结合并携带上述毒素基因重组体进入GRP受体阳性的细胞，但毒素基因只能在NF-KB+SCP+GRP受体阳性的恶性肿瘤细胞内表达，进而强效杀灭此类对化疗与放疗不敏感的肿瘤细胞。本非病毒载体还可独立地杀伤GRP受体阳性的恶性肿瘤细胞。本发明还涉及此复合药物及单独的非病毒载体在恶性肿瘤治疗中的用途。
背景技术：
：已知上千种来自微生物、植物、动物以及化学合成的蛋白质毒素具有抗肿瘤或抗病毒活性。但它们是人体异源的毒素蛋白质，在付之临床应用时存在两个问题一是由于其细胞杀伤作用不具备肿瘤细胞特异性，可对人体产生严重的毒副作用；二是其作为人体异源蛋白质，具有很强的免疫原性，导入人体血循环不仅可导致抗体的迅速生成而被中和失活，并可引起人体发生严重的过敏反应。久来人们试图改造此类蛋白质以应用于临床对疾病的治疗。如绿脓杆菌外毒素(/^ei/c/OT朋asexotoxinA，PE)是由绿脓杆菌分泌的一种毒素。PE由分别行使受体结合、转位和酶催化(杀伤细胞)活性的三个结构域domainIa(第1-252位氨基酸)-domainll(第253-364位氨基酸)-domainlb(第365-399位氨基酸)domain-III(第400-613位氨基酸)组成。对PE的改造，曾在提高其杀伤作用的细胞靶向性和降低其免疫原性这两方面进行过探索。目前，PE的应用研究普遍采用蛋白质形式。为避免毒素对正常细胞的毒副作用，实现细胞毒作用对肿瘤细胞的靶向性，首先通过删除结构域Ia来取消PE原有的普遍结合于任何细胞表面的能力。研究还发现，PE分子的细胞毒作用可因第609-613位氨基酸的REDLK被替换为KDEL而显著提高。基此，曾有人探索运用基因工程技术，把经KDEL改造并删除了结构域Ia的PE片段作为细胞毒效应结构域，并将之与肿瘤特异性受体的配体(或抗体)融合，经DNA重组与表达改造成为具有肿瘤细胞耙向性的融合蛋白，如TGFct-PE40，以降低PE的毒副作用。该融合蛋白在体外实验、或临床研究的早期阶段可以收到较好的效果；但进一步临床研究表明，该种导向融合蛋白仍可造成严重的肝毒性；而且其中的绿脓杆菌毒素PE40对人体仍具有很强的免疫原性，在应用于人体的初期即产生抗体，致使该蛋白因中和作用而失效。通过点突变以消除抗原表位只能在一定程度上、部分地降低毒素蛋白的免疫原性，其免疫原性仍然显著存在。同时，所利用的肿瘤细胞特异性受体往往同时存在于肿瘤细胞与正常细胞表面，所以，此类导向融合蛋白在杀伤肿瘤细胞的同时，还杀伤了其表面也有相同受体的正常细胞。因此，上述关于人体外源毒素蛋白的导向改造是不成功的，寻求其改造新途径是必要的。已有研究结果表明，双链DNA是低免疫原性的，而且不引起和促进机体发生系统性自身免疫反应[l]。我们首先考虑将人体异源毒素蛋白质改为其编码基因导入血循环，以从根本上避免前者的免疫原性。我们认为，实现基因的靶向转移和表达以确保基因治疗的安全性，是基因治疗设计中必须考虑的首要问题。根据基因作用的原理，如将治疗基因特异性地转移到肿瘤细胞内或将其表达限制在肿瘤细胞内，则可有效避免其对正常组织细胞的伤害，同时也可提高毒素基因转移的准确性与效率，达到靶向性杀伤的效果。据报告，survivin，作为IAP(inhibitorofap叩tosis)家族的新成员，参与细胞的抗凋亡作用和对细胞增殖的调节。已有的研究发现，survivin呈肿瘤细胞特异性高表达，且该特异性表达与survivinpromoter(启动子)的转录活性呈正相关关系，即survivinpromoter在肿瘤细胞普遍具有较高的转录启动功能，而在绝大多数的成体正常细胞则活性极低。已证实由269bp组成的survivincorepromoter(縮写为SCP)具有肿瘤细胞特异性转录活性，因此可将肿瘤细胞表示为SCP+，正常细胞表示为SCP—。另据报告，NF-kB(nuclearfactorkappaB)对survivin表达有促进作用。作为转录因子的NF-kB呈肿瘤细胞特异性高表达和激活，即肿瘤细胞中的NF-kB可与其特异结合位点(即kBsite，序列为gggactttcc，表示为NFBS)相结合，发挥其转录功能，因此肿瘤细胞可表示为NF-icB+;而在正常细胞中，NF-KB处于被抑制状态，停留在细胞质中，无法进入细胞核以发挥功能，因此，正常细胞为NF-kB—。本研究考虑运用具有肿瘤特异性的两个因子NF-kB与SCP的联合控制把毒素基因的表达严格限制在肿瘤细胞内。基因治疗的一种载体是非病毒载体。它可根据实际需要加以设计。而且采用非病毒载体可避免采用病毒载体时所可能造成的一些难以解决的问题。非病毒载体的研制，普遍采用化学合成的多肽的混合的技术路线。如化学合成的结合受体的配体、或结合抗原的抗体多肽片段，用以结合耙细胞表面的受体或抗原；化学合成的带正电荷的多聚赖氨酸多肽片段，用以结合表达型功能效应基因重组体；之后，把配体或抗体多肽片段、多聚赖氨酸多肽片段、功能效应基因重组体加上脂质体包裹成为一种复合物，用以同靶细胞结合，并将功能基因重组体导入细胞内，使之表达，从而发挥治疗作用。这一技术路线的突出缺点有二一是化学合成肽的成本过高，几乎不可能被工业开发实践所采纳；二是脂质体有很强的杀伤细胞的毒副作用。有鉴于此，本发明采取基因工程的技术路线，应用功能相似的特定的人源基因片段，经DNA重组与表达从而获得一种特定的融合蛋白以作为非病毒载体，不使用脂质体，以便在实现功能效应基因的准确靶向转移的同时，降低成本投入，避免非病毒载体的毒副作用与免疫原性。我们在设计与构建非病毒载体时，使用了富含带正电荷的碱性氨基酸并包含核定位序列的DNA结合蛋白SON—个片段。己知它可结合富含负电荷的DNA重组体并可引导该重组体进入细胞核，开始持续转录的进程。我们在设计与构建非病毒载体时，使用了一类腺癌细胞表面富集的一种受体GRPR的受体配体多肽胃泌素释放肽GRP。当前，GRPR已成为广泛关注的肿瘤治疗的作用靶点。由于GRP与GRPR的结合，则可将下述的复合药物携带到此类细胞的表面，之后经细胞的内吞作用进入细胞。我们在设计与构建非病毒载体时，使用了经突变改造的突变型基因7)VF^么它所表达的TNFa的衍生物TNF咖2是强效低毒的。TNF咖2是野生型TNFa经删除原第1至7位氨基酸，以及原第8至10位氨基酸由Pro-Ser-Asp替换为Arg-Lys-Arg而得到的突变体(151个氨基酸)[2，3]。它已被批准作为非专利药物用于临床对恶性肿瘤的治疗。这说明，其毒副作用即使有、也没有超出临床允许的范围。基因治疗的一类药物是DNA与蛋白质的复合物(DNA/ProteinComplex)。如上所述，普遍采用的技术路线是研制化学合成肽、功能基因重组体加脂质体混合而成的复合物。其缺点是成本高，有毒副作用。而且，多数其有杀伤功能的基因的表达被置于构成型启动子如pSV40或pCMV的驱动之下，在配体或抗体的引导下，功能基因重组体既进入肿瘤细胞，也进入正常细胞，以致在杀伤肿瘤细胞的同时，也杀伤正常细胞，造成不同程度的毒副作用。有鉴于此，本发明采取"双限制"的策略，从两个方面把毒素基因的表达加以限制一方面，利用受体与配体相结合的关系，把复合物导入该受体阳性的细胞；另一方面运用肿瘤特异性的转录因子与启动子的双重控制把复合物中的毒素基因的表达严格限制在一类恶性肿瘤细胞内。毒素基因即使进入正常细胞也不会表达，正常细胞将不被杀伤，从而提高功能基因表达的准确性，并使毒副作用最小化。再，一旦将此类复合药物导入患者血循环，其结合GRP受体的情况将不同于体外细胞试验。在体内，在GRPR+肿瘤细胞表面富集有大量的GRP受体，而在某些正常细胞表面只有少量的GRP受体。复合药物在体内流动运转的过程中，其GRP配体处于同细胞表面GRP受体竞争性结合的过程主要结合到GRP受体富集的肿瘤细胞表面，较少地结合到GRP受体较少的正常细胞表面。处在复合物中的TNFam2则有更少的机会同TNFa受体结合。这样，由于结合到正常细胞表面的TNFa受体而导致对正常细胞的杀伤作用的机会就更少了。而且，该TNFam2己被应用于临床。因此，其毒副作用将被进一歩最小化。
发明内容一方面，本发明提供了一种非病毒载体，它是一种靶向性融合蛋白。所述融合蛋白由细胞因子突变体多肽、富含碱性氨基酸并包含核定位序列的多肽，和受体配体多肽组成。根据本发明，所述细胞因子突变体多肽是TNFa突变形成的强效低毒的衍生物TNFam2;所述富含碱性氨基酸并包含核定位序列的多肽是DNA结合蛋白SON及其片段或衍生物，如S0N2;所述受体配体多肽是胃泌素释放肽GRP或其衍生物。上述三种多肽的DNA编码序列均取自人基因组，以避免其蛋白质产物的免疫原性。优选地，我们构建了一种非病毒载体TNFam2-S0N2-GRP(即TSG)。其作用原理如下述。GRPR是G蛋白偶联膜表面的胃泌素释放肽GRP的受体。在一类恶性肿瘤如胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多种肿瘤细胞表面富集此受体GRPR。我们采用GRP作为非病毒载体的靶细胞定位结构域，以期通过GRP与GRPR的结合，携带毒素基因进入GRPR+的细胞。我们选择上述恶性肿瘤作为靶细胞，还因为此类腺癌往往对化疗或放疗不敏感，或有抗性。GRP的氨基酸序列如SEQIDNO.6所示，其DNA编码序列如SEQIDNO.7所示。此非病毒载体上的S0N2是一种DNA结合蛋白SON中的富含阳性氨基酸的一个片段，并含有核定位序列，带正电荷,用以结合所述带负电荷的毒素基因重组体。其核定位序列用以引导上述毒素基因重组体在进入细胞后继之进入细胞核，开始毒素基因转录的进程。S0N2的氨基酸序列如SEQIDNO.3所示，其DNA编码序列如SEQIDNO.5所示。此非病毒载体上的TNFam2是经突变改型的强效低毒的TNFa衍生物。TNFcon2的氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其DNA编码序列如SEQIDNO.2所示。本非病毒载体上的S0N2-GRP的编码基因难以高表达。TNFam2编码基因易于高表达。把TNFam2编码基因克隆在S0N2-GRP的编码基因上游，获得了TNF咖2-S0N2-GRP(TSG)融合蛋白(TNFam2_S0N2-GRP的氨基酸序列如SEQIDNO.8所示，其DNA编码序列如SEQIDN0.9所示)的高表达。优选地，本发明提供了编码本非病毒载体的融合基因及其表达型重组体。本发明还提供了生产该融合蛋白的工程菌及该融合蛋白的制备方法。另一方面，本发明鉴于双链DNA(质粒)的低免疫原性、且不引起和促进机体发生系统性自身免疫反应的特点，摒弃将毒素蛋白直接导入人体血循环的技术路线，而采用将毒素蛋白的DNA编码序列导入人体血循环，以期从根本上避免来自外源毒素蛋白质的免疫原性。本发明提供了本非病毒载体和一种关于毒素基因的限制性表达的DNA重组体的复合药物，以用于耙向性恶性肿瘤的基因治疗。所述表达型重组体包含一种表达对细胞具有杀伤活性的蛋白质的基因。根据本发明，所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌外毒素、白喉毒素、商陆、蓖麻毒素，或其他一切对细胞具有杀伤能力的来自人体、动植物或者微生物的蛋白，或者是它们的杀伤活性功能区域、突变体或类似物；以及人工合成的对细胞具有杀伤能力的蛋白质或多肽及其编码基因。优选地，其中所述的对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌外毒素，或者是其第二或第三功能结构域；更优选地，所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质是绿脓杆菌外毒素的第三功能结构域或其突变体。在本发明的一个优选实施方案中，所述突变体为绿脓杆菌外毒素第III功能域突变体(C端的REDLK突变成KDEL)，称为PEIIImut。其氨基酸序列如SEQIDNO.10所示，其DNA编码序列如SEQIDNO.11所示。优选地，本发明构建了在NF-kB(5XNFBS的DNA序列如SEQIDNO.12所示)和SCP(SCP的DNA序列如SEQIDNO.13所示)双重控制下的5X^83-30-/5￡/77/^(片段5XNFBS-SCP-/^//iM^的DNA序列如SEQIDNO.17所示)毒素基因重组体。本发明将所述非病毒载体与限制性表达的毒素基因重组体按质量比在体外混合装配成复合药物TNFam2-S0N2-GRP/5XNFBS-SCP-/^//7ffli/t，以用于对肿瘤细胞的耙向性杀伤作用。利用本非病毒载体TNFam2-S0N2-GRP(TSG)结合并携带在NF-kB和survivincorepromoter(SCP)双重控制下的5XNFBS-SCP-/^7//M7t毒素基因重组体靶向导入GRPR+肿瘤细胞。在NF-kb+与SCP+的肿瘤细胞内，毒素基因/^7/7/m/t基因得以表达，从而杀灭该细胞。同时，即使表达型重组体被导入GRPR+正常细胞(NF-kB—和SCP—)，由于在5XNFBS-SCP控制下的毒素基因/^7/7m/t在正常细胞内不表达，因此正常细胞不会被杀伤。这样，毒素蛋白质的免疫原性和毒副作用己被最小化。这一复合药物的主要适应症是GRPR+的胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等肿瘤。该类腺癌往往对化疗与放疗耐受、不敏感，或有抗性。这是本发明的一个主要特征。总之，本发明的复合药物具有明确的杀伤GRPR+恶性肿瘤的特异性，因此，该药物的使用应遵循"个体化诊断与个体化治疗"的原则。此类具有杀伤作用的耙向特异性、毒副作用与免疫原性最小化的新型药物，当前国际上称之为"智能药物"。另外，非病毒载体TNFam2-S0N2-GRP(TSG)可独立地发挥对GRPR+恶性肿瘤的杀伤作用。但其杀伤强度将相对低于绿脓毒素蛋白质，如PEIIImut。图1.本发明复合药物的总体设计图图2.PCR反应以扩增得到目的产物-yWeI-SCP-5ksI-。第l孔DNA分子量标准SD002(600bp，500bp,400bp,300bp，200bp，100bp)。第2、3孔PCR产物(287bp，二复孔)。图3.T-SCP克隆筛选的PCR结果。第1至8孔分别为1号至8号克隆(阳性克隆的PCR产物为287bp)。第9孔DNA分子量标准DL15，000(15000bp，10000bp,7500bp，5000bp，2500bp，1000bp,250bp)。图4.PCR反应以扩增得到目的产物-J/OTI-5XNFBS-5"acI-。第1、2孔:PCR产物(函p)。第3孔为DNA分子量标准DL15,000(15000bp,10000bp,7500bp,5000bp，2500bp，1000bp,250bp)。第4孔为DNA分子量标准SD002(600bp,500bp，400bp，300bp，200bp，100bp)。图5.为筛选5XNFBS-SCP-^vc克隆的I&&cI双酶切结果。第l孔为DNA分子量标准SD002(600bp,500bp，400bp,300bp，200bp,100bp)。第2至7孔:分别为1号至6号克隆(阳性克隆经酶切得到两个片段，分别为5082bp和93bp)。第8孔为DNA分子量标准DL15，000(15000bp，10000bp，7500bp,5000bp，2500bp，1000bp,250bp)。图6.5XNFBS-SCP-Z"c的DNA测序报告。8图7.各调控序列在三个肿瘤细胞株(MCF-7，MDA-MB-231，HeLa)和一个非肿瘤细胞株(CCC-ESF-1)所引导的勿cj'/erase的表达结果。(A)检测结果以经过内对照校正的RLU(relativeluciferaseunit,即相对荧光素酶单位)值表示。RLl^萤火虫荧光素酶活性单位/海肾荧光素酶活性单位(B)各调控序列在不同细胞株中所引导的基因表达，与在非肿瘤细胞株(CCC-ESF-1)的RLU值之比。(C)每种细胞株的各调控序列所引导的基因表达，与各自Psv40-ESV40所对应的RLU值之'比。縮写(1)Psv40-Esv40:SV40promoter-SV40enhancer;(2)SCP:survivincorepromoter;(3)5XNFBS-SCP:5XkBsites-survivincorepromoter;(4)SCP-Esv40:survivincorepromoter_SV40enhancer;(5)5XNFBS-SCP-Esv40:5XkBsites-survivincorepromoter-SV40enhancer;.(6)5XNFBS:5XkBsites(NF-kB结合位点)图8.PCR反应以扩增得到目的产物-AfcoI-IsI-。第1孔PCR产物(666bp)。第2孔DNA分子量标准lOObpLadder(1500bp，lOOObp，900bp,800bp，700bp,600bp,500bp,400bp,300bp,200bp，lOObp)。第3孔阴性对照。图9.5XNFBS-SCP-克隆的PCR筛选结果。第l孔DNA分子量标准DL15，000(15000bp,lOOOObp,7500bp,5000bp，2500bp，lOOObp,250bp)。第2至4，6至8孔分别为1号至6号克隆(阳性克隆的PCR产物为666bp)。第5孔DNA分子量标准lOObpLadder(1500bp，1000bp，900bp，800bp,700bp,600bp，500bp,400bp，300bp，200bp，100bp)。第9孔阴性对照。图10.5XNFBS-SCP-Z^/iTM^克隆的AcoTV单酶切和AfcoI&AaI双酶切鉴定结果。第l孔为DNA分子量标准DL2,000(2000bp,1000bp,750bp,500bp，250bp，100bp)。第2孔为5XNFBS-SCP-尸i7/iM^克隆的EcoRV单酶切产物(阳性克隆经酶切得到单一片段，为4171bp)。第3孔为5XNFBS-SCP-/^//7m^克隆的AfcoI&J6aI双酶切产物(阳性克隆经酶切得到两个片段，分别为3519bp和652bp)。第4孔为DNA分子量标准DL15，000(15000bp,10000bp,7500bp,5000bp,2500bp,1000bp，250bp)。图11.5XNFBS-SCP-/^/77历"的DNA测序报告。图12-A，图12-B，图12-C，图12-D.肿瘤特异性表达重组体5XNFBS-SCP-PEIIImut和组成性表达重组体Psv40-/^i77M/卜Esv40的构建。图12-A.重组体5"6F-Zwc的构建图12-B.重组体5XNFBS-SC尸-Z"c的构建图12-C.重组体5XNFBS-5^尸-尸j57iT历W的构建图12-D.重组体Psv40-Z^i7i/z7W-Esv40的构建图13.RT-PCR检测,i57/i/z7^的转录情况。第l孔DNA分子量标准DL2，000(2000bp，1000bp，750bp，500bp,250bp，100bp)。第2、3孔5乂^83-3[-/^///历^转染后的RT-PCR产物(356bp)。第4孔阴性对照。第5孔阳性对照(322bp)。图14.脂质体介导5XNFBS-SCP-/^777M/t以及Psv40-/^i77y^t-Esv40(对照)转染的MTT检测结果。所显示的值是细胞增殖抑制率(％)，代表细胞杀伤活性大小。DNA工作浓度均为1.33ug/ml。图15.经AnnexinV-FITC&PI处理后的流式细胞仪检测图。(MCF-7:肿瘤细胞株NF-kB+SCP+;CCC-ESF-1:非肿瘤细胞株NF-kB+SCP—)(1)Psv40-UJ/鹏t-Esv40(SV40p，oter-尸肌/鹏t-SV40enhancer);(2)5XNFBS-SCP,i7i/z"t(5XkBsites-survivincorepromoterU77鹏f).图16.PCR反应得到分别包含TNFam2,S0N2，GRP的DNA编码序列的目的产物。1:product1:-yVc/eI-(7)V尸a/z^-"'/^er)-fcofI-(498bp)。2:DNA分子量标准lOObpLadder(1500bp，1000bp,900bp,800bp，700bp,600bp,500bp,400bp，300bp,200bp,100bp)。3:product2:-^co7I-5置》fe威I-(184bp)。4:product3:-TVofeI-5YWiK5feaI-(184bp)。5:product4:-5feI-(h'/^er-M乃-fe/z7#I-(137bp)。图17.A^eI&I双酶切筛选pCW-75"克隆。第1至7孔:分别为1号至7号克隆的酶切结果(阳性克隆经酶切得到两个片段，分别为4887bp和656bp)。第8孔DNA分子量标准100bpLadder(1500bp，1000bp,900bp，800bp，700bp,600bp,500bp,400bp，300bp,200bp，100bp)。图18.为筛选pCW-W克隆的AWeI&fe/必I双酶切。第1至5孔分别为5个克隆的酶切产物(阳性克隆经酶切得到两个片段，分别为4887bp和287bp)。第6孔DNA分子量标准DL15,000(15000bp,10000bp，7500bp，5000bp,2500bp，1000bp，250bp)。图19.PCR反应以扩增得到目的产物-AWeI-(7M^a-"/7^r)-&o/PI-S(9A^&肪I-。第1孔为PCR产物(667bp)。第2孔DNA分子量标准lOObpLadder(1500bp，1000bp，900bp，800bp，700bp，600bp,500bp,400bp，300bp，200bp，100bp)。图20.pCW-75Y7克隆的PCR筛选结果。第l孔阴性对照。第2至4，第7至9孔分别为六个克隆的PCR产物(阳性克隆的PCR产物为786bp)。第5孔为DNA分子量标准lOObpLadder(1500bp，1000bp，900bp,800bp,700bp,600bp,500bp,400bp,300bp，200bp，100bp)。第6孔为DNA分子量标准DL2,000(2000bp,1000bp,750bp,500bp,250bp，100bp)。图21.pCW-n的DNA测序报告。图22-A，图22-B，图22-C.非病毒载体蛋白TNFrnn2-S0N2-GRP(即TSG)的表达重组体pCW-75^的构建步骤。图22-A.片段TiVFa/^-h'Mer-W船的构建图22-B.片段pCW-(7的构建图22-C.重组体pCW-75"6"的构建图23.包涵体提取各步上清及全菌体的SDS-PAGE电泳结果。第1孔细胞培养物之上清第2孔3%Triton洗涤后之上清第3孔细胞裂解处理后之上清第4孔菌体(未诱导)第5孔菌体(诱导)第6孔蛋白分子量标准(66，45,35,27kDa)第7孔5%Triton缓冲液洗涤后之上清第8孔尿素溶液洗涤后之上清第9孔盐酸胍溶液洗涤后之上清图24.包涵体提取各步沉淀及全菌体的SDS-PAGE电泳结果。第1孔3%Triton洗涤后之沉淀第2孔细胞裂解处理后之沉淀第3孔5%Triton缓冲液洗涤后之沉淀第4孔尿素溶液洗漆后之沉淀第5孔盐酸胍溶液洗涤后之沉淀第6孔包涵体溶解液第7孔蛋白分子量标准(97.4，66.2，42.7,31.0,14.4kDa)第8孔菌体(诱导)第9孔菌体(未诱导)图25.经诱导菌体的SDS-PAGE结果凝胶扫描。定量分析显示，目的蛋白TSG的表达量占经诱导全菌体表达蛋白总量的37.819%.图26.蛋白TSG的反相液相层析图谱。在洗脱峰分别收集的1号管蛋白TSG收集样品和2号管蛋白TSG收集样品。图27.经反相液相层析后所收集的蛋白TSG样品的SDS-PAGE电泳结果。第l孔菌体(诱导)第2孔蛋白分子量标准(97.4，66.2，42.7,31.0，20.1,14.4kDa)第3孔包涵体溶解液第4孔1号管蛋白TSG收集样品第5孔2号管蛋白TSG收集样品图28.经反相液相层析后所收集的蛋白TSG样品的SDS-PAGE结果的凝胶扫描。定量分析显示，目的蛋白TSG在收集样品蛋白中的纯度为90.608%.图29-A，图29-B，图29-C，图29-D，图29-E.蛋白TSG的N端1-15个氨基酸的测序报告。氨基酸序列测定分析报告显示蛋白TSG的N末端15个氨基酸序列为MRKRKPVAHVVANPQ，与理论序列相符(ABIPR0CISE491测序仪)。图30.TSG/5XNFBS-SCP-/^J7777"t复合药物的琼脂糖凝胶迁移延迟试验，对非病毒载体蛋白TSG的结合携带DNA的能力进行评价。第l孔DNA分子量标准DL15，000(15000bp,10000bp,7500bp，5000bp,2500bp,1000bp,250bp)。第2至第8孔不同质量比的蛋白TSG与DNA的孵育产物。图31-A，图31-B，图31-C.荧光显微镜下观察细胞分别经脂质体/pEGFP-Nl和TSG/pEGFP-Nl转染。图32.脂质体/pEGFP-Nl，以及蛋白TSG/pEGFP-Nl对三个细胞株的转染效率的分析比较。图33.不同工作浓度的蛋白TSG/DNA复合物，或蛋白TSG单独应用等对肿瘤细胞株MCF-7(GRPR+NF-kB+SCP+)的杀伤作用。[以细胞增殖抑制率(%)表示，即对细胞杀伤活性]图中显示杀伤率与蛋白TSG/DNA复合物，或蛋白TSG单独应用等的剂量的依赖关系。图34.不同工作浓度的蛋白TSG/DNA复合物，或蛋白TSG单独应用等对肿瘤细胞株HeLa(GRPR—NF-kB+SCP+)的杀伤作用。[以细胞增殖抑制率(%)表示，即对细胞杀伤活性]图中显示杀伤率与蛋白TSG/DNA复合物，或蛋白TSG单独应用等的剂量的依赖关系。图35.不同工作浓度的蛋白TSG/DNA复合物，或蛋白TSG单独应用等对非肿瘤细胞株CCC-ESF-1(GRPR—NF-kB+SCF)的杀伤作用。[以细胞增殖抑制率(％)表示，即对细胞杀伤活性]图中显示杀伤率与蛋白TSG/DNA复合物，或蛋白TSG单独应用等的剂量的依赖关系。图36.不同工作浓度的蛋白TSG的单独应用分别对MCF-7、HeLa、CCC-ESF-1三个细胞株的杀伤作用。[以细胞增殖抑制率(%)表示，即对细胞杀伤活性]图中显示杀伤率与蛋白TSG单独应用的剂量的依赖关系。图37.蛋白TSG/丽A复合物，或蛋白TSG单独应用等在最高工作浓度时对于MCF-7、HeLa和CCC-ESF-1这三个细胞株的杀伤作用。[以细胞增殖抑制率(%)表示，即对细胞杀伤活性]具体实施方案本发明的复合药物的总体设计见图1。根据本发明的第一个方面，本发明提供了一种非病毒载体，其本质是一种靶向性融合蛋白，所述融合蛋白由细胞因子突变体多肽、富含碱性氨基酸并包含核定位序列的多肽，和受体配体多肽组成。根据本发明，所述细胞因子突变体多肽是肿瘤坏死因子a(頂Fa)突变后序列TNFam2;所述富含碱性氨基酸并包含核定位序列的多肽是DNA结合蛋白SON或其片段；所述受体配体多肽是能够与GRPR相结合的GRP或相关片段，类似物或突变体。本发明的非病毒载体所包含的各多肽的DNA编码序列均取自人基因组，以避免其表达产物对人体的免疫原性。优选地，所述细胞因子突变体多肽TNFam2，是TNFa的强效、低毒突变体；其氨基酸序列如SEQIDNO.1所示，其DNA编码序列如SEQIDNO.2所示。优选地，所述富含碱性氨基酸并包含核定位序列的多肽是DNA结合蛋白SON的包含53个氨基酸的片段S0N2;其氨基酸序列如SEQIDNO.3所示。其DNA编码序列为S0N2原序列(如SEQIDN0.4所示)和已经过大肠杆菌偏爱密码子改造的序列，如SEQIDNO.5所示。优选地，所述受体配体多肽是GRP;其氨基酸序列如SEQIDN0.6所示。其DNA编码序列如SEQIDNO.7所示。特别优选地，所述非病毒载体是TNF咖2-S0N2-GRP(TSG)，即自N端至C端依次由TNFam2多肽、S0N2多肽和GRP多肽组成，其氨基酸序列如SEQIDNO.8所示。其DNA编码序列如SEQIDNO.9所示。优选地，通过基因工程方法经体外重组获得融合基因，并在原核细胞中表达该融合基因而获得本发明的非病毒载体(融合蛋白)。在本发明的实施方案中，所述融合基因的核苷酸序列如SEQIDNO.9所示的序列，或其野生型核苷酸序列，其编码融合蛋白TSG。TSG自N端至C端依次包括TNFam2的151个氨基酸、S0N2的53个氨基酸和GRP的27个氨基酸，其中碱性氨基(赖氨酸和精氨酸)共44个。TSG的氨基酸序列如SEQIDN0.8所示。在本发明的一个实施方案中，所述融合基因克隆在温度控制型原核表达载体pCWlll的PL-SI)的下游，成为PL-SD-7M^^-5WA^-67尸f即PL-SD-757^,命名为pCW-75K。(该温度控制型原核表达载体pCWlll，即为陈伟京等于2001年12月发表于《中国医学科学院学报》第23巻第6期的题目为《在大肠杆菌中以融合蛋白高效表达基因工程产品人心钠素》的文献中公丌的pCWl载体。pCWlll的核苷酸序列如S印IDNO.14所示)[4]。该重组体转化大肠杆菌DH5a，获得可以表达融合蛋白的工程菌。在另一方面，本发明提供了包含本非病毒载体和一种表达型DNA重组体的复合药物，以用于靶向性恶性肿瘤的基因治疗，所述表达型重组体包含一种表达对细胞具有杀伤能力的蛋白质的基因。本发明所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌外毒素、白喉毒素、商陆、蓖麻毒素，或其他一切对细胞具有杀伤能力的来自人体、动植物或者微生物的蛋白，或者是它们的活性功能区域、突变体或类似物；以及人工合成的对细胞具有杀伤能力的蛋白质或多肽及其编码基因。优选地，其中所述的对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌外毒素，或者是其第二或第三功能结构域。本发明将绿脓杆菌外毒素PE的第三结构域的C末端的5个氨基酸残基REDLK的密码子突变为KDEL的密码子，并引入终止密码子，从而得到一种DNA重组体，即尸^7/iy^"为了增强毒素基因/^7^M/t在人体内表达的安全性，减少其毒副作用，本发明设计在毒素基因的上游插入了5个拷贝的NF-kB结合位点(5XNFBS)和survivincorepromoter(SCP)，以期将毒素基因的表达限制在肿瘤细胞内。有鉴于此，本发明构建了5XNFBS-SCP-/^7/7/W毒素基因重组体。优选地，所述对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌外毒素第三功能结构域或其突变体，其中所述突变体PEIIImut的氨基酸序列如SEQIDNO.10所示。其DNA编码序列/^////K/f如SEQIDNO.11所示。在本发明的实施方案中，首先应用荧光酶基因作为报告基因以检测本发明所设计的调控元件5XNFBS-SCP的功能与调控效果。所述的5XNFBS的核苷酸序列如SEQIDNO.12所示。所述的SCP的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示。运用pGL3系列载体(购于Promega)构建了表达型重组体5XNFBS-SCP-Z"c(艮卩kBsite-survivincorepromoter-_Z"ci/erase)禾口Psv40-ZwrEsv40(作为对照的SV40promoter-J"ci/erase-SV40enhancer)。通过检测荧光酶基因分别在肿瘤特异性5XNFBS-SCP的驱动下和在无特异性的构成型SV40promoter与SV40enhancer的驱动下其表达情况的不同，从而验证本发明设计的5XNFBS-SCP的调控作用的肿瘤特异性。特别优选地，本发明的复合药物为130/5\^83-5[-/^//7/^^。如前文所述，非病毒载体中的GRP引导该复合药物结合到GRPR+肿瘤细胞和正常细胞的表面，并经细胞的内吞作用进入此类细胞。但该复合药物中的毒素基因只在NF-KB+SCP+的肿瘤细胞内表达，从而杀伤13该GRPR'的肿瘤细胞；而该复合药物中的毒素基因不能在NF-kB—SCP—的if.常细胞内表达，TF.常细胞将不被杀伤。作为对照的TSG/Psv40-尸i57/i/m/t-Esv40的检测结果表明，在构成型启动子SV40promoter和增强子SV40enhancer的驱动下，毒素基因的表达不具有肿瘤细胞特异性既杀伤肿瘤细胞、也杀伤正常细胞，出现了严重的毒副作用。因此，该重组体无应用前景。同时，通过RT-PCR证实/^7/iM7t在5XNFBS-SCP的引导下能够实现转录与表达。MTT检测与流式细胞仪检测结果，都证实了毒素基因/^7//历"t的表达所产生的肿瘤细胞特异性细胞杀伤作用。此同时，本发明还利用绿色荧光蛋白基因的表达比较研究了本非病毒载体与脂质体转染效率的不同。再，本发明把毒素蛋白的表达限制在细胞内，这就相当于比较彻底避免了毒素蛋白的免疫原性问题。随着靶细胞的死亡，毒素蛋白质将随着靶细胞的降解而被降解，一并被机体清除机制所清除。以下通过实施例进一歩描述本发明。实施例1重组质粒5XNFBS-SCP-Z"c(即5XkBsites-survivincorepromoter-J"ci/ersse)的构建1.1SCP(艮卩survivincorepromoter)序歹U的克隆已证实，位于人survivin基因的DNA序列(14796bp)的第2543-2811位的长度为269bp的SCP所引导的基因表达具有肿瘤特异性。为利用荧光素酶报告基因表达系统对其予以评价，SCP将通过载体MCS中的A7eI和5kgI位点插入载体。首先将其接入pMD18_Tsimplevector[购自宝生物工程(大连)有限公司(TAKARA)]。据GenBank提供的人survivin基因的DNA序列设计引物，以人基因组DNA为模板进行PCR反应，得到长度为287bp的目的片段-MeI—SCP—5"/ffaI-(见图2)。将该片段与线性pMD18-Tsimplevector相连。利用菌液PCR对连接产物进行鉴定，得到产物为287bp片段的阳性克隆(见图3)。将此有目的片段插入的阳性重组质粒命名为T-SCP。测序结果显示所得序列与GenBank提供的序列吻合。1.25XNFBS(S卩5XkBsites)序列的克隆NF-kB结合位点(kBsite)是呈肿瘤细胞特异性高表达和激活的转录因子NF-kB的DNA结合序列。5XNFBS即包含5个拷贝的NF_kB结合位点的DNA片段。每个拷贝为14bp，即tggggactttccgc(其中的gggactttcc为结合位点，余为旁侧序列)。5个连续拷贝共70个核苷酸。依此，设计两条退火用单链DNA，以两者的退火产物为模板进行PCR反应，得到长度为106bp的目的片段-f/mI-5XNFBS-5"acI-(见图4)。1.3重组质粒SCP-(艮卩survivincorepromoter-Juci/"erase)的构建质粒T-SCP与荧光素酶报告基因表达载体pGL3-Basic分别进行MeI和I双酶切，分别得到277bp小片段，即AfteI—SCP—5k3I，和4811bp大片段。将两片段相连接得到经鉴定正确的重组质粒SCP-Z"c(5088bp)。1.4重组质粒5XNFBS-SCP-的构建将片段-,/wI-5XNFBS-5"acI-与重组质粒SCP-Z恥'分别进行I和feeI双酶切，得到93bp小片段，即/T/otl-5XNFBS-5"acI，和5082bp大片段。将两片段相连接。将连接产物经/Tp/7I、&cI双酶切鉴定(见图5)及送测序(见图6)，证实己得到正确的重组质粒5XNFBS-SCP-Z〃c(5175bp)。实施例2其他多种荧光素酶报告基因表达重组体的构建2.1重纟且质丰立SCP_ZwrEsv40(艮卩survivincorepromoter—7wci/"erase"SV40enhancer)的构建将来自实施例1.3的277bp片段MeI—SCP—5"鹏I，借位点顺eI和S鹏I插入质粒pGL3-Enhancer。经证实已得到正确的重组质粒SCP-Z"rEsv40。2.2重组质粒5XNFBS-Z〃c(即kBsite-^;ci/arase)的构建将来自实施例1.4的93bp片段I-5XNFBS-&cI，借位点I和&cI插入质粒pGL3-Basic。经证实已得到正确的重组质粒5XNFBS-Z〃c。2.3重组质粒5XNFBS—SCP—Z〃^Esv40(即kBsites-survivincorepromoter-Jwcj'/ersse"SV40enhancer)的构建将来自实施例1.4的93bp片段Jp/I-5XNFBS-&jcI，借位点必/7I和I插入重组质粒SCP-^y^Esv40。经证实己得到正确的重组质粒5XNFBS-SCP-^y^Esv40。实施例3由脂质体介导荧光素酶报告基因表达重组体的瞬时转染，对调控序列所引导的基因表达的肿瘤特异性予以评价。3.1将上述^/ci/erase表达载体进行大量提取。包括(1)Psv40-Z〃C"Esv40(2)SCP-(3)5XNFBS-SCP-Z"c(4)SCP-ZEsv40(5)5XNFBS-SCP-ZEsv40(6)5XNFBS-Z〃c3.2各种形式调控序列引导基因表达情况检测由脂质体介导，将上述^ciTersse表达载体分别对三个肿瘤细胞株(人乳腺癌细胞株MCF-7和MDA-MB-231，和人宫颈癌细胞株HeLa;三者均为NF-kB+SCP+);和一个非肿瘤细胞株(人胚胎皮肤成纤维细胞株CCC-ESF-1，为NF-!cB+SCP—)分别进行瞬时转染；并对所收获细胞进行双荧光素酶活性检测和整理分析。其中，NF-kB+示NF-kB处于激活状态；其在成体正常细胞一般处于失活状态，为NF-kB—。SCP+表示SCP能够引导基因高水平表达；CCC-ESF-l所引导的基因表达处于极低的水平，表示为SCP—(同成体正常细胞)。将各调控序列在各细胞株所引导的^/w'/erae的表达结果作图(见图7)。经统计学分析，可知5XNFBS-SCP(即kBsites-survivincorepromoter)在进行比较的调控序列中，其所引导的基因表达具有最高的肿瘤细胞特异性。其在成体正常细胞(NF-KB—SCP")中所引导的基因表达水平应将更低于在CCC-ESF-1(NF-kB+SCP—)的水平，说明5XNFBS-SCP表现很强的肿瘤细胞特异性。实施例4肿瘤特异性表达重组体5XNFBS-SCP-/^7/7/zw^和组成性表达重组体Psv40-/^///My卜Esv40的构建4.1/^//i/7H7f序列的克隆依据以PE的天然编码序列为模板进行PCR反应，得到(PE天然编码序列中的第400-608位氨基酸)-KDEL所对应的编码序列，且带入终止密码子和酶切位点，进行引物设计。经PCR反应得到666bp的目的产物-Afco1-/^777/"卜^3I-(见图8)。4.2肿瘤特异性表达重组体5XNFBS-SCP-/^/7//^f的构建将片段-AfcoI-/^/J7/Bi^-J/^I-进行AfcoI和J6sI双酶切，得到652bp片段AfcoI-/^77i/wt-J/I。将质粒5XNFBS-SCP-Zwc同样进行AfcoI和JfeI双酶切，得到3519bp片段。将两片段相连接。经菌液PCR鉴定，得到产物为666bp片段的阳性克隆(见图9)。经I和J6aI双酶切鉴定，得到两片段分别为652bp和3519bp;经￡co7V单酶切鉴定，得到一个线性片段(见图10)。测序结果显示已得到正确的重组质粒5乂^83-30-/^///历^(4171bp)(见图11)。4.3组成性表达重组体Psv40-/^/T7/ZK7f-Esv40的构建将上述652bp片段I-/^/J7/z7^-ZZI，插入质粒pGL3-Control,经证实得到正确的重组质粒PsvAO-Z^/iT/m/f-EsvAC^肿瘤特异性表达重组体5XNFBS-SCP-/^7/iyz"t和组成性表达重组体Psv40-/^i7iM/t-Esv40的构建步骤，如图12所示。实施例5通过RT-PCR证实/^////^f在5XNFBS-SCP的引导下能够实现转录。由脂质体介导肿瘤特异性表达重组体5XNFBS-SCP-Z^/J/孤"对肿瘤细胞株MDA-MB-231(NF-icB+SCP+)的瞬时转染。以提取的总RNA作为模板，进行RT-PCR反应。所得到的目的产物为356bp，证实/^J/iy^t在5XNFBS-SCP的引导下能够实现转录与表达(见图13)。实施例6对肿瘤特异性表达重组体5XNFBS-SCP-/^7iTy^t和组成性表达重组体PsvAO-Z^J/iM/t-Esv^的细胞杀伤作用进行MTT检测由脂质体分别介导5XNFBS-SCP-尸^/7/m^和组成性表达重组体Psv40-/^/77y7i/卜Esv40的瞬时转染，进行MTT检测分析。以空白组调零，利用吸光值计算细胞增殖抑制率(％，以此表示细胞杀伤活性)，计算公式细胞增殖抑制率(%)=[(对照组-实验组)/对照组]乂100%转染用细胞为两个肿瘤细胞株(MCF-7和HeLa，均为NF-kB+SCP+)和一个非肿瘤细胞株(CCC-ESF-l，为NF-kB+SCP—)。MTT检测结果，即细胞杀伤活性，以细胞增殖抑制率(％)表示。作图(见图14)并作表如下<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>经证实5XNFBS-SCP-/^7/i/w/t能够实现/^//7/ffl^的肿瘤细胞特异性表达，并产生相应的肿瘤特异性细胞杀伤作用。其所产生的细胞杀伤作用，在肿瘤细胞株(NF-icB+SCP+)处于较高的水平；而在非肿瘤细胞(NF-kB+SCP—)则极低，仅等同于由于脂质体或外源DNA的添加所产生的作用。实施例7AnnexinV-FITC联合PI法的流式细胞仪检测，进一步证实5XNFBS-SCP-尸i7/i/^t产生肿瘤细胞特异性细胞杀伤作用和机制。依据流式细胞仪检测报告结果(见图15)，进行整理分析(表格如下)。证实5XNFBS-SCP-/^//7/zW能够产生肿瘤细胞特异性细胞杀伤作用。表中数值为各类细胞占细胞总数百分比(％)<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>实施例8含融合基因7M^/^-5"OViW;y尸的非病毒载体蛋白表达重组体pCW-:T5^的构建这里所使用的表达型载体质粒pCWlll是本实验室自行构建的。它以常用的原核质粒pBR322为基础。在原四环素抗性基因Tetr位点处克隆入一个X噬菌体的PL启动子和适于大肠杆菌系统的SD序列。一股而言，为要获得目的基因的高表达，则把该基因克隆于PL-SD的下游；如这里的PL-SD-7M^^-5"(9A2W^/7。为控制PL启动子的作用，在PL的上游插入一个人噬菌体的CI-857基因。在工程菌培养温度为32nC时，CI-857表达出一种蛋白，并结合到PL启动子上，使之处于被阻遏状态。一旦要求PL启动子发挥驱动作用，则将工程菌的培养温度升高至42"C，在这种情况下，CI-857基因将不表达，PL启动子去阻遏，继之发挥驱动其下游目的基因表达的作用。该策略来自X噬菌体基因关系的研究结果，而且已被诸多基因工程载体构建工作所采用。组装在PBR322载体质粒上的Apm「等基因在pCWlll上保持在原位置上。与此载体相匹配的宿主细胞，一般采用大肠杆菌DH5a。pCWlll的全序列如SEQIDNO.14所示。pCWlll是一个成熟的表达型原核载体，曾用以表达多种目的基因均获得成功。TNFam2是野生型TNFa经过原第1至7位氨基酸的缺失，以及原第8至10位氨基酸由Pro-Ser-Asp替换为Arg-Lys-Arg而得到强效、低毒的突变体(151个氨基酸)(氨基酸序列见SEQIDNO.1，DNA编码序列见SEQIDNO.2)。S0N2片段(53个氨基酸)包括核定位序列且以碱性氨基酸为主要组成，用于表达的编码序列己进行大肠杆菌偏好密码子的替换(氨基酸序列见SEQIDNO.3，DNA编码序列见SEQIDNO.5)。GRP为全长27个氨基酸(氨基酸序列见SEQIDNO.6，DNA编码序列见SEQIDNO.7)。三个结构域之间借柔性连接短肽linker(各含10个氨基酸)相连(氨基酸序列见SEQIDNO.15，DNA编码序列见SEQIDNO.16)。8.1重组体pCW-7XpCW-5X的构建经PCR反应分别获得目的产物-yWeI-(7M^迈2-h'/^er)-i5boyI-(498bp)和-fco/PI-^WA^^mWI-(184bp)(见图16)。将两片段及表达载体pCWlll分别经双酶切(yWeI与&MI，^b^I与^3/^1)，并将各自的酶切产物大片段回收连接。所得到的连接产物经yWel和^^WI双酶切鉴定，阳性克隆得到产物分别为656bp和4887bp(见图17)，并经测序证实已得到完全正确的重组体pCW-r5"(5543bp)。经PCR反应分别获得目的产物-/WeI-5"6Wi^5)肪I-(184bp)，和-5"鹏I-(h'Mer-CA"-泡/ff〃I-(137bp)。将两片段及表达载体pCWlll分别经双酶切(M/eI与5"/z;sI，5feal与fe历〃1)，并将各自的酶切产物大片段回收连接。所得到的连接产物经A^eI和及mWI双酶切鉴定，阳性克隆得到产物分别为287bp和4887bp(见图18)，并经测序证实已得到完全正确的重组体pCW-5^(5174bp)。8.2表达重组体pCW-75^的构建以重组体pCW-7^为模板，经PCR反应得到-A^eI-(7M^z^-h'/Aer)-I-5"6)A^"5"鹏I-(667bp)(见图19)。将该片段与重组体pCW-5^分别进行/fcfeI和5k3I双酶切，并分别回收大片段，即分别为/WeI-(7M^/z^-h'/^er)-feo7I-5WA^5k3I(652bp)禾卩pCW-57aI-("'/^e/-6^/^-fe/a￥I(5008bp)，将两片段相连。所得到的连接产物经菌液PCR鉴定，阳性克隆得到产物符合786bp(见图20)，经测序证实已得到完全正确的表达重组体pCW-75K(5660bp)。(测序结果见图21)非病毒载体蛋白TNFam2-S0N2-GRP(TSG)的表达重组体pCW-75^的构建步骤，，如图22所示。实施例9融合基因r56"的诱导表达、包涵体提取与检测9.1诱导表达和包涵体提取9.1.1大体积温控诱导表达18取包含表达重组体pCW-7:SY的工程菌液50u1接种至5ml含氨苄LB液体培养基，37°C振荡培养12hr。将所得到的5ml菌液全部接种至300ml含氨苄LB液体培养基，32°C振荡培养12hr。将所得到的300ml菌液平均接种至4L含氨苄LB液体培养基中(500ml/瓶，共8瓶)，32°C振荡培养4hr至0D值达到0.6，置42。C继续振荡培养4hr。9.1.2菌体收集与洗涤6，000g离心15min收集菌体，称重湿菌体。向菌体沉淀加入3%TritonX-100洗涤液，室温搅拌30min充分悬浮菌体。6，OOOg离心15min收集菌体沉淀。(按照10ml-50ml缓冲液/lg湿菌体的比例，本研究采用200ml)9.1.3溶菌酶破细胞用细胞裂解缓冲液(50mMTris-HC1，2mMEDTA，100mMNaCl，0.5%TritonX-IOO，lmg/ml溶菌酶。pH8.5-9.0)将菌体悬浮，室温下继续搅拌30min，使悬液因溶菌酶的作用而粘稠。9.1.4超声破细胞先冰浴5分钟。超声波功率约70W，每次作用5sec，共100次，每次间隔20sec。至液体不再粘稠。为防止因超声产热对蛋白产生破坏作用，使用玻璃烧杯盛装待处理菌体裂解产物，且全程于冰水浴中；超声探头深入液面及距烧杯底部的距离都需大于3cm。超声完毕，6，000g离心15min收集沉淀。9.1.5包涵体洗涤与溶解用5%TritonX-100洗涤缓冲液彻底悬浮沉淀，并超声波处理30次。6，OOOg离心15min收集沉淀。再分别使用尿素缓冲液、盐酸胍缓冲液悬浮沉淀，超声波处理并离心收集沉淀。用35ml包涵体溶解液充分溶解包涵体沉淀，得到包涵体溶液。9.2蛋白鉴定9.2.1SDS-PAGE蛋白电泳电泳将上述各步的上清和沉淀留样进行SDS-PAGE凝胶电泳。在Tris-甘氨酸电泳缓冲液中，选择恒流电泳。即首先以8mA使样品通过浓縮胶；当溴酚蓝泳至两层胶的分界处时，再以12mA的电流至溴酚蓝刚泳出分离胶。9.2.2凝胶的染色与脱色电泳结束后，小心取下凝胶，用至少5倍于凝胶体积的考马斯亮蓝染色液浸泡凝胶，室温振摇染色4hr以上。回收染液，将凝胶浸泡于脱色液中振摇，更换脱色液数次，直至蛋白条带清晰显示。9.2.3凝胶分析将留存的包涵体提取各步骤的上清与沉淀进行SDS-PAGE凝胶电泳检测(见图23，24)。经与依据蛋白TSG的理论氨基酸序列计算得到的平均分子量所对应位置的比对，证实目的蛋白TSG以包涵体表达形式表达；在包涵体的提取过程中，其损失情况不明显。626nm波长的凝胶扫描定量分析结果显示，目的蛋白TSG的表达量占经诱导全菌体表达蛋白总量的37.819%(见图25)。实施例IO对包涵体中的目的蛋白TSG利用反相高效液相层析进行纯化，并复性10.1反相柱的准备起始缓冲液(A液):10%乙睛，0.05%TFA;洗脱缓冲液(B液):90%乙睛，0.1%TFA。反相柱自填6mlSourcel5RPC树脂；柱床(CV)=12ml。利用A液清洗机器管路，并在25min内达到A液的柱平衡。再采用梯度上升的方式，在5min内达到B液的柱平衡。随后，重新瞬时恢复至A液的柱平衡。10.2上样将得到的包涵体溶液14，000卬m离心10min后，取上清经过0.22um孔径滤膜，得到包涵体上样用液。当达到A液柱平衡后，用上样注射器吸取样品3ml推入上样柱(不要引入气泡)，并设置流速为3ml/min。10.3蛋白的洗脱与目的蛋白的收集流速保持在3ml/min。上样后8min，开始实施蛋白的B液梯度洗脱(B液在30min内由0%梯度升至100%)，随之，流动相的极性将逐渐增加，相应极性的蛋白组分从固定相洗脱下来，随洗脱液出柱，A260和A280监测，收集相应的明显的洗脱峰所对应的洗脱液(见图26)。10.4层析收集样品的SDS-PAGE电泳检测。将反相层析收集样品，以及上柱样品、菌体样品，一同进行SDS-PAGE电泳检测，鉴定含有目的蛋白的洗脱收集样品(见图27);对此样品所对应电泳结果进行凝胶扫描显示目的蛋白TSG的量占该样品的蛋白总量的90.608。/。(见图28)。10.5蛋白的复性将含有目的蛋白的洗脱收集样品分装至透析袋(15ml/袋)，分别在2L透析缓冲液透析5小时；再重复一次。将透析袋中的蛋白样品收集混匀，存放于4'C。实施例ll融合蛋白TSG的测定11.1BCA法蛋白定量经复性得到蛋白样品，使用BCAProteinAssayReagentkit(PIERCE),按照产品说明书所提供方法，在96孔板进行显色反应，酶标仪测定各孔在光波562nm时的吸收值；再利用以标准白蛋白样品(BSA，2mg/ml)所作的蛋白浓度与光吸收值的二维标准曲线，得到吸收值所对应的蛋白浓度(mg/ml)。经定量检测，蛋白样品的浓度为1.2mg/ml。共50ml，因此经复性所得到的蛋白总量为60mg，因来自12.21g湿菌体，蛋白得率为4.9mg/g。11.2N端氨基酸序列测定(见图29)报告显示蛋白TSG的N末端15个氨基酸序列为MRKRKPVAHVVANPQ，与理论序列相符。实施例12复合药物的制备与转染靶向性12.1琼脂糖迁移延迟分析融合蛋白TSG作为非病毒载体，通过静电作用与目的质粒形成蛋^质/DNA复合物。将两者以不同的比例进行孵育并进行琼脂糖凝胶电泳，比较迁移率变化情况，当比例合适以形成蛋白/DNA复合物，则呈明显的出孔延迟现象。检测结果显示，制备蛋白TSG/质粒5XNFBS-SCP-Z^7/iMyt复合物，选择两者质量比为4:1(见图30)。12.2蛋白TSG/DNA复合物的转染蛋白TSG与绿色荧光蛋白报告载体pEGFP-Nl(购自BDBioscience)以质量比4:1进行孵育形成复合物对细胞进行转染。转染结果荧光照片见图31，并计算转染效率为<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>并作图(见图32)。转染效率的检测结果显示，融合蛋白TSG作为非病毒载体，与质粒DNA形成复合物所产生的细胞转染呈GRPR+细胞靶向性。实施例13融合蛋白TSG/毒素基因肿瘤特异性表达重组体5XNFBS-SCP-/^7///^t复合药物及融合蛋白TSG单独应用的杀伤细胞实验13.1MTT法检测复合物及融合蛋白TSG单独应用对细胞的杀伤作用。待转染质粒毒素基因组成性表达型重组体Psv40-/^7///^t-Esv40毒素基因肿瘤特异性表达型重组体5XNFBS-SCP-/^///M;t待转染用蛋白TSG待转染细胞株肿瘤细胞株MCF-7(GRPR+NF-kB+SCP+);HeLa(GRPR—NF-kB+SCP+);非肿瘤细胞株CCC-ESF-1(GRPR—NF_kB+SCP—)转染用制剂1ip/Psv40U/丽卜Esv40;TSG/Psv40-尸￡/77孤"-Esv401ip/5XNFES-SCP-Z^TT/ffli/t;TSG/5XNFBS-SCP-ProteinTSG;5XNFBS-SCPUJ/威liposomeDNA分别采用四种工作浓度，艮卩1.33吗/ml，2.00吗/ml，4.00吗/ml禾卩8.0(Hig/ml。所对应的蛋白TNFam2-S0N2-GRP的工作浓度分别为各自DNA浓度的4倍。13.2杀伤细胞实验结果整理并统计学分析经MTT检测得到的结果[以细胞增殖抑制率(％)表示]:MCF-7HeLaCCC-ESF-1(GRPR+NF-kB+SCP+)(GRPR—NF-kB+SCP+)(GRPR—NF-kB+SCP—)1ip/Psv40-尸肌/迈"-Esv40(<formula>formulaseeoriginaldocumentpage22</formula>对复合物在最高工作浓度所对应的结果(％)进行统计学分析MCF-7HeLaCCC-ESF-l(GRPR+NF--kB+SCP+)(GRPR—NF-kB+SCP+)(GRPR—NF-kB+SCP—1lip/Psv40-尸肌/迈"卜Esv4051.98±3.7267.08±5.1645.42±6.292TSG/Psv40-尸肌/啦卜Esv4057.53±4.1226.18±1.3819.03±2.5631ip/5XNFBS-SCP-尸肌/迈z/f46.80±3.3152.48±6.2911.31±1.374TSG/5XNFBS-SCP-尸J5777迈W63.15±4.2325.07±2.3918.86±1.515ProteinTSG37.26±5.7935.89±2.3726.89±2.5865XNFBS-SCP-尸肌/迈"1.86±0.152.03±0.312.35±0.737liposome5.58±0.754.83±0.315.33±1.06第i组与第2组比较P>0.05P〉0.05P<0.01第3组与第4组比较P〈0.05P〈0.01P>0.05第2组与第4组比较P〉0.05P>0.05P>0.05第1组与第5组比较P<0.01P>0.05P>0.05第2组内分别与CCC-ESF-1比较P<0.01P>0.05第4组内分别与CCC-ESF-1比较P<0.01P>0.05第5组内分别与CCC-ESF-1比较P〉0.05P〉0.05上述结果表明，由融合蛋白TSG与毒素基因的限制性表达重组体5XNFBS-SCP-/^7/7/wyt组装形成的新型复合药物TNFam2-S0N2-GRP/5XNFBS-SCP-Z^i7iM/t，对肿瘤细胞株MCF-7(GRPR+NF-kB+SCP+)的细胞杀伤作用处于较高水平；对肿瘤细胞株HeLa(GRPR—NF-kB+SCP+)和非肿瘤细胞株CCC-ESF-1(GRPR—NF-kB+SCP—)的作用则显著降低。其细胞杀伤活性与GRPR有关，参照5XNFBS-SCP引导基因表达的特征，该复合药物的细胞杀伤活性应呈GRPR+肿瘤细胞靶向性。该复合药物通过非病毒载体蛋白TSG的GRP结构域与GRPR的靶向结合，在GRPR+肿瘤细胞(此类腺癌普遍表现为GRPR过表达，且往往对化疗与放疗不敏感，有抗性)表面发生大量富集并经细胞的内吞作用进入细胞，实现毒素基因/^7/7M7t表达，从而杀伤此类肿瘤细胞。同时，载体蛋白中的TNFani2的信号转导可能增强此杀伤作用。对于GRPR+正常细胞，细胞表面GRPR数目远低于GRPR+肿瘤细胞(呈指数关系)，而且/^////z"t在5XNFBS-SCP的控制下在此正常细胞内不表达，因此不能杀伤正常细胞。考虑到体内实验与体外实验的不同情况，预期在体内实验所得到的对GRPR+TNFR+正常细胞的杀伤作用较体外实验将处于更低的水平。对于GRPR的机体绝大多数正常细胞，则不发生本复合药物同细胞表面GRPR的耙向结合及内吞作用，本复合物将不杀伤这些细胞。融合蛋白TSG的独立应用所产生的杀伤细胞作用，虽未表现显著的GRPR+肿瘤细胞特异性,但TNF咖2己成为常规药物应用于临床对恶性肿瘤的治疗，因此，其毒副作用应不超出临床允许的范围。本发明所得到的初步体外细胞水平的生物学活性检测结果及其分析表明，TNFam2-SON2-GRP/5XNFBS-SCP-Z^Zr/M^复合物与TNFam2-SON2-GRP的单独应用，均有实际应用前景。参考文献1.MorG，SinglaM，SteinbergAD，HoffmanSL，OkudaK,KlinmanDM.DoDNAvaccinesinduceautoimmunediseaseHumGeneTher.1997Feb10;8(3):293陽300.2.NakamuraS，KatoA，MasegiT，etal.Anovelrecombinanttumornecrosisfactor-alphamutantwithincreasedanti-tumoractivityandlowertoxicity,/""Cawc^r1991Jul9;48(5):744-8.3.SatoT,WatanabeN，YamauchiN,etal.Differentiationinductionbyatumor-necrosis-factormutant471inhumanmyelogenousleukemiccellsviatumor-necrosis-factorreceptor-p55.J1998Oct5;78(2):223-32.4.陈伟京，等，在大肠杆菌中以融合蛋白高效表达基因工程产品人心钠素，^^^"^^/^^烷学/y2001年第23巻第6期573-9.序列表<110>中国医学科学院基础医学研究所<120〉T型非病毒载体及包含其的复合药物<130><160>17<170>Patentlnversion3.1<210>1<211>151<212>PRT<213>人工序列<400>1MRKRKPVAHVVANPQAEGQLGWL服RANALLANGVELRDNGLVVPSEGLYL工YSGVLFKG6〇GGCPSTHVLLTHTISR工AVSYGTKVNLLSAIKSPCGRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFGL120EKGDRLSAE工NRPDYLDFAESG(2VYFG工IA151<210〉2<211>453<212>DNA<213>人工序列<400>2atgcgtaaacgcaagcctgtagcccatgttgtagcaaaccctcaagctgaggggcagctc60cagtggctgaaccgccgggccaatgccctcctggccaatggcgtggagctgagagataac120cagctggtggtgcc3tcsgagggcctgtacCtC3tCt3Ctcccaggtcctcttcsa_gggc180caaggctgccCCtCC3CCC3tgtgctcctc3CCC3C3CC3tcagccgcatcgccgtctcc240taccagaccaaggtcaacctcctctctgccatcaagagcccctgccagsgggagacccca300gagggggctgsggccaagccctggtatgagCCC3七Ct3tCtgggsggggtcttccagctg360gsgaagggtgsccgactcagcgctgsgatcaatcggcccgactatctcgactttgccgag420tctgggcaggtctactttgggatcsttgccctg453<210〉3<211>53<212>PRT<213>人工序列<400>3KHRSKSRERKRKRSSSRDNRKTVRARSRTPSRRSRSHTPSRRRRSRSVGRRRS53<210>4<211>159<212>DNA<213>人工序列<400>4ssgcacsgatccs3gtct3gC3sgctccagggataaccga60tcgsaccccssgtcgtcgg3gtcggsgtcatactccaagt120cgtcgscg33ggtctsgstctgtgggtagaagaaggagc159<210>5<21>159<212>DMA<213>人i:序列<400>5aaacatcgtagcaaatctcgcgaacgtaaacgcaaacgttcasgctcccgtgst33ccgc60aaaaccgttcgtgcacgcagtcgcaccccgtctcgtcgcagccgtsgtcstaccccgagt120cgtcggcgtcgcagccgctctgtgggtcgtcgccggagc159<210>6<211>27<212>PRT<213>人工序列<400>6VPLPAGGGTVLTKMYPRGNHWAVGHLM27<210>7<211>81<212>DNA<213>人工序列<400>7gtcccgctgcctgcgggcggsgggsccgtgctgaccaagatgtacccgcgcggca_accac60tgggcggtggggcacttaatg81<210>8<211>255<212>PRT<213>人工序列<400>8MRKRKPVAHVVANPQAEGQL，LNRRANAXLANGVELRDNGLVVPSEGLYL工YSQVLFKG60QGCPSTHVLLTHTISR工AVSYGTKVNLLSA工KSPCQRETPEGAEAKPWYEPIYLGGVFQL120EKGDRLSAE工NRPDY]LDFAESGQVYFG工IALGGGGSGGGGSEFKHRSKSRERKRKRSSSR180DNRKTVRARSRTPSRRSRSHTPSRRRRSRSVGRRRSPGGGGGSGGGGSVPLPAGGGTVLT24〇KMYPRGNHWAVGHLM255<210>9<211>765<212>DNA<213>人工序列<400>9atgcgtaaacgcaagcctgtsgcccstgttgtsgcaaaccctcaagctgaggggcsgctc60cagtggctgasccgccgggccsatgccctcctggccaatggcg亡ggagctgagagataac120C3gctggtggtgcc3tcagsgggcctgtacCtC3七Ct3Ctcccsggtcctcttcaagggc180caaggctgccCCtCC3CCC3tgtgctcctc3CCC3C3CC3tcsgccgcstcgccgtctcc240sggtcMcctcctctctgccatcaagagcccctgccag3gggagaccccs30〇gagggggctgaggccssgccctggtatgagCCC3tCt3tCtgggaggggtcttccagctg360gagaagggtgaccgsctcsgcgctgsgatcaatcggcccgsctatctcg3ctttgccgag420tctgggcaggtctactttgggatcattgccctgggtggcggsggttctggtggcggaggt480tctgaattc3aacatcgtagcswtctcgcgaacgtaaacgc33scgttcasgctcccgt540gatsaccgc3aaaccgttcgtgcscgcsgtcgcaccccgtctcgtcgcagccgtsgtcat600accccgagtcgtcggcgtcgcsgccgctctgtgggtcgtcgccggagccccgggggtggc660ggaggttctggtggcggaggttctgtcccgctgcctgcgggcggagggaccgtgctgacc720aagatgtacccgcgcggcaaccsctgggcggtggggcacttaatg765<210>10<211>213<212>PRT<213>人工序列<400>10FLGDGGDVSFSTRGTG丽TVERLLQAHRQLEERGYVFVGYHGTFLEAAQS工VFGGVRARS60QDLDA工WRGFYIAGDPALAYGYAQDQEPDARGRIRNGALLRVYVPRSSLPGFYRTSLTLA120APEAAGEVERL工GHPLPLRLDA工TGPEEEGGRLETILGWPLAERTVV工PSAIPTDPRIWG180GDLDPSS工PDYASGPGKPPKDEL213<210>11<211>639<212>DNA<213>人工序列<400>11ttcctcggcgacggcggcgacgtcagcttcagcacccgcggcacgcagaactggacggtg60gagcggctgctccaggcgcaccgccaactggsggagcgcggctatgtgttcgtcggctac120cacggcaccttcctcgaagcggcgcaasgcatcgtcttcggcggggtgcgcgcgcgcagc180caggacctcgacgcgatctggcgcggtttctatatcgccggcgatccggcgctggcctac240ggctacgcccaggaccaggaa_cccgscgc3cgcggccggatccgcaacggtgccctgctg300cgggtctatgtgccgcgctcgagcctgccgggcttctaccgcaccagcctgaccctggcc360gcgccgg己ggcggcgggcgaggtcgaacggctgatcggccatccgctgccgctgcgcctg420g3cgccatc3ccggccccg3ggaggaaggcgggcgcctggagsccsttctcggctggccg480ctggccgagcgcaccgtggtgattccctcggcgstcccc3ccgacccgcgcaacgtcggc540ggcgacctcgacccgtccagcatccccgacsaggaacaggcgatcagcgccctgccggac600tacgccagccsgcccggcaaaccgccgaaggacgagctg639<210>12<211>70<212>DNA<213>人工序列<400>12tggggactttccgctggggsctttccgctggggactttccgctggggactttccgctggg60gactttccgc70<210>13<211〉269<212〉DNA<213〉人1:序列<400>13cgcgttctttgagggggcgctaggtgtgggcagggscgsgctggcgcggc60gtcgctgggtgcaccgcgaccacgggcagagccacgcggccaactcccgg120cscsccccgcg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其中所述编码对细胞具有杀伤能力的蛋白质为绿脓杆菌外毒素，或者是其第二和第三功能结构域。12、如权利要求11所述的复合药物，其中所述编码对细胞具有杀伤能力的蛋白质绿脓杆菌外毒素第三功能结构域突变体的/^7//M/t，为编码SEQIDNO.10氨基酸序列的DNA序列，如SEQIDNO.11。13、如权利要求12所述的复合药物，其中所述的表达型重组体为应用pGL3载体而构建的限制性表达型重组体5XNFBS-SCP-/^////m/t。14、如权利要求13所述的复合药物，其中所述的限制性表达型重组体为受NF-KB和肿瘤特异性启动子survivincorepromoter(SCP)双重控制的表达型重组体5XNFBS-SCP-尸i57i7M7t;其中5XNFBS为包含5个重复克隆的NF-kB结合位点及其旁侧序列的DNA片段，其核苷酸序列如SEQIDNO.12所示，其中SCP的核苷酸序列如SEQIDNO.13所示。15、如权利要求9所述的复合药物，其优选为TSG/5XNFBS-SCP-/^///M7f。16、权利要求9-15任一项的复合药物，以及权利要求1-15的非病毒载体融合蛋白作为药物靶向杀伤恶性肿瘤的治疗用途。17、权利要求16所述的复合药物与单独非病毒载体融合蛋白作为药物的靶向杀伤恶性肿瘤的用途，其中所述的恶性肿瘤为GRP受体(GRPR)阳性的胃癌、结肠癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌等多种肿瘤。全文摘要本发明涉及非病毒载体融合蛋白TNFαm2-SON2-GRP与限制性表达绿脓杆菌外毒素基因杀伤功能域高效突变型重组体5×NFBS-SCP-PEIIImut的复合药物。非病毒载体中的TNFαm2是强效低毒的TNFα衍生物，SON2是一种DNA结合蛋白，GRP是胃泌素释放肽。毒素基因重组体上的5×NFBS是经5次重复克隆的NF-κB的结合位点，SCP是一种肿瘤特异性启动子，PEIIImut是绿脓杆菌外毒素基因杀伤功能域高效突变型。本非病毒载体可结合并携带上述毒素基因重组体进入GRP受体阳性的细胞，但毒素基因只能在NF-κB⁺SCP⁺GRP受体阳性的恶性肿瘤细胞内表达，进而强效杀灭此类对化疗与放疗不敏感的肿瘤细胞。本非病毒载体亦可独立地杀伤GRP受体阳性的恶性肿瘤细胞。本发明还涉及此复合药物及单独的非病毒载体在恶性肿瘤治疗中的用途。文档编号C12N15/62GK101429523SQ200710176920公开日2009年5月13日申请日期2007年11月7日优先权日2007年11月7日发明者卢圣栋,史艳晖,涛李,路金芝,陈伟京申请人:中国医学科学院基础医学研究所