专利名称：一种改进的农杆菌介导浸花法转化禾本科作物的方法
技术领域：
本发明涉及一种改进的由农杆菌介导的浸花法转化禾本科作物的方法与应用，特别是 涉及转化甜高粱、谷子和玉米的方法与应用。
背景技术：
粮食生产主要可分为两种， 一种是提供食用的粮食， 一种是为生物能源提供原料的粮 食。甜高粱是一种重要的能源植物。上世纪70年代的石油危机引发了人类对生物燃料代 替石油的研究，美国和巴西用玉米和甘蔗生产燃料乙醇获得成功。现在，由于化石能源的 渐趋枯竭和环保的需要，发展生物质产业成为许多国家的重要发展战略。我国的粮食还不 那么富裕。生产液体生物燃料还得找其他途径。甜高粱有很高的光合效率，有"高能作物" 之称，是目前世界上生物学产量最高的作物。甜高粱茎秆中含糖丰富，是粮食生产酒精最 好的替代物。每亩甜高粱的酒精产量约为玉米、甜菜和小麦的2倍；比甘蔗还高1/4;籽 粒既可食用，又可作饲料和工业原料。我国有1亿多公顷贫瘠的边际性土地，如果种上能 源植物，产出的燃油会相当可观。我国的汽车保有量2020年将达到2.2亿辆，每年汽车 就将消耗汽油2.2亿吨，国内目前的石油产量远远不够用。种植利用甜高粱可以极大地缓 解我国能源危机。
谷子起源于我国，我国的种植面积占世界的80%。谷子是粮草兼用型作物，它具有耐 旱、耐瘠薄、抗逆性强、产量平稳、营养价值高等特征。
玉米原产于南美洲，适合旱地种植。玉米是三大粮食品种之一，为解决人类的温饱问 题起到很大作用。此外饲料消费也是玉米最重要的消费渠道，约占消费总量的70%左右。 作为工业原料使用也是玉米消费的主要渠道。玉米可开发产品众多，是粮食作物中用量最 大的工业原料。玉米广泛用于生产淀粉、造纸、食品、纺织、医药等行业。以玉米淀粉为 原料生产的酒精是一种清洁的"绿色"燃料，有可能在21世纪取代传统燃料而被广泛使 用。
以上三种作物在我国的粮食生产中占重要地位，但目前对其研究还停留在常规育种 上。因其难于进行组织培养及转化再生能力差等问题，要应用基因技术改良性状，还比较 困难。
目前的转基因技术可分为物理法、化学法及生物学法。无论那一种方法，都要依靠
转化细胞的脱分化和再分化这一组织培养植株再生过程，实现外源基因的转移，获得转基 因植株。但是该途径有其局限性，如组织培养及转化再生能力的基因型依赖性比较强，而 且有些物种难于进行组织培养，以及逃逸体、嵌合体、转化率低下、过敏反应导致感染部 位的褐化坏死、细胞脱分化和再分化中产生的体细胞变异以及转基因株的育性降低或丧失 都有可能干扰转基因植株的分析及应用。植物原位转基因方法是一种不需要组织或细胞培 养手段而达到植物在活体而非离体手段状态下的转化。浸花法转化是植物原位转基因方法 中的一种，是利用材料花序与农杆菌接触，在活体条件下，完成可遗传细胞的转化，并通 过对后代的筛选，获得转化株。目前浸花法转化已应用于双子叶植物十字花科的芸薹属作 物中并获得成功，利用浸化花法转化未本科作物未见报道。
发明内容
针对上述现有技术的不足，本发明的目的是提供一种改进的浸花法转化禾本科作物的 方法。
本发明所提供的浸花法转化禾本科作物的方法包括以下步骤
1) 将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有SilwetL-77、曲 拉通X-100 (TritonX-100)和赤霉素(GA);
2) 在活体条件下进行浸花法转化将待转化的目的植株的全部花序或雌蕊部分浸泡 于上述渗透培养基中，或者将上述渗透培养基喷洒于花序或雌蕊上，利用农杆菌将目的基 因整合到目的植株基因组中。
浸花法转化可在外界的强压下进行，也可在常温常压下进行。目前应用较多的浸花法 转化要进行抽真空处理，但是对于株型较大的植物品种进行抽真空处理则不太可行。在常 温常压下进行转化时，渗透培养基中需要添加能够帮助提高渗透能力的表面活性剂，通常 添加的是有机硅表面活性剂Silwet L-77。在本发明的研究中，除了 Silwet L-77外，还 首次添加了另外两种成分Triton X-100(曲拉通X-100)和GA。 Triton X-100是一种非离 子表面活性剂，可作为润湿剂、乳化剂、清洁剂使用，它能够溶解脂质，增强细胞膜的通 透性，使农杆菌更容易进入植物体内。GA即赤霉素，能促进细胞的伸长和分裂，促进植物 发芽，刺激植物生长，特别是促进开花器官的发育。渗透培养基中一些成分的毒性，往往 会影响早期尚未发育成熟花的生长，降低结实率，而研究表明这部分花更容易被转化。向 渗透培养基中添加GA，可以使转化后的花器官更好的发育，从而提高转化效率。
本发明方法中，上述渗透培养基中Silwet L-77的用量优选50-500lU/L;Triton X-100
的用量优选50-500 Hl/L;赤霉素的用量优选1-10ug/L。
上述含有目的基因的农杆菌的获得，是将目的基因插入到表达载体中，再将该载体导 入农杆菌中。常用的载体包括但不限于pBin系列载体(如pBin 19等)、pBI系列载体(如 pBI 101等)、Gateway系列载体(如pH2GW7等)、pCAMBIA系列载体(如pCAMBIA3301 等)；常用的农杆菌菌株包括但不限于LBA4404、 GV3101、 EHA105等。
本发明利用改进的浸花法转化方法，已成功获得未本科作物转基因植株。利用这种转 基因方法，本发明解决了一些难于进行常规转化的禾本科作物的转化问题，具有较大的实 际应用价值。
下面结合附图，通过具体实施例对本发明做进一步说明，但不以任何方式限制本发明 的范围。
图1是质粒pKATl-AsRed的图谱。
图2是实施例中PCR检测Tl转化株如t基因的电泳结果图。
图3是实施例中转基因谷子TO代种子红色荧光蛋白表达情况检测结果图。
图4是实施例中转基因甜高粱TO代种子红色荧光蛋白表达情况检测结果图。
具体实施例方式
下述实施例中所用方法如无特别说明，均为常规方法，所用试剂购自上海生工生物 工程有限公司，引物均由上海英骏生物技术有限公司合成，PCR试剂盒来自Invitrogen公 司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。作为目的基因的红色荧光蛋白报告基因AsRed2 购自美国Clontech Laboratories Inc。实验中所用的菌种为常用的菌株，载体由本实验 室从常用载体出发而构建。
实施例、浸花法转化获得甜高粱、谷子、玉米转基因植株 一、浸花法转化甜高粱、谷子、玉米植株 1.实验材料
农杆菌菌株农杆菌菌株为LBA4404。含有质粒载体pKATl-AsRed。 质粒pKATl-AsRed,含有来源于水母的红色荧光蛋白报告基因AsRed2，带有力pt筛选 标记基因，可抗Hygmycin抗生素。该载体为本实验室构建，是将目的基因AsRed2 (购自美国Clontech Laboratories Inc)，插入到表达载体pCAMBIA1301中，将克隆自水稻的种子特异表达启动子GluA3插入到AsRed2基因上游，得到 pKAT-AsRed表达载体。其图谱如图1所示，图中T-DNA left border为T-DNA 插入左边界；力pt为植物筛选标记基因，具有Hygmycin抗性；P-GluA3为来源 于水稻的植物种子特异表达启动子；AsRed2为水母的红色荧光蛋白报告基因； T-NospolyA为终止子；/7/^//为细菌筛选标记基因，具有卡那霉素抗性；T-DNA right border为T-DNA插入右边界。 供转化甜高粱、谷子和玉米品种由河北省农林科学院谷子研究所提供。甜高粱品种
为M81-E、考力；谷子品种为冀丰22;玉米品种为 K36、 K12。
2. 根癌农杆菌的培养
挑取甘油冻存的含有质粒pKATl-AsRed的农杆菌，于YEB培养基(含卡那霉素50mg/L、 利福平25mg/L)平板上画线，28。C黑暗培养2天。挑取单菌落接种于50ml YEB (含卡那 霉素50mg/L、利福平25mg/L)液体培养基中，28°C 200rpm摇过夜。吸取上述培养物接种 于1L同样的YEB液体培养基中28。C 150卬m摇过夜，直至006。。
=2。将上述0D6Mnm=2的 农杆菌悬浮液在6000rpm离心15min，沉淀后的农杆菌悬浮于渗透培养基中，用于植物转 化。
3. 转化菌液准备
(1 )配制转化用渗透培养基。渗透培养基组成成分每1升体积MS培养基中加入6-BA (6-苄氨基嘌呤)20ug、 GA (赤霉素)5ug、 AS (乙酰丁香酮)20 mg、 Silwet L—77 50 ul、 Triton X-100 (曲拉通X-100) 200 u 1， pH=5.8。
(2)将培养好的农杆菌用渗透培养基重悬，稀释到ODe。^-1.0左右备用。
4. 植株选择准备
选取露天生长处于初花期，生长健壮的植株，作为待转化植株。对其进行编号、挂牌。
5. 农杆菌菌液浸染植物花序
*采用两种方法对甜高粱和谷子进行农杆菌浸染
(1) 将主枝弯曲，直接使整个花序完全浸于菌液中，浸染90sec左右。
(2) 使用喷雾器，将悬浮于渗透培养基的农杆菌菌液均匀地喷洒于供转化植株花 序上。
*对于玉米转化，采用了四种方法进行浸染
(1) 将雌花序中伸出的雌蕊部分浸泡于菌液中，浸染90sec左右。
(2) 使用喷雾器，将悬浮于渗透培养基的农杆菌菌液均匀地喷洒于供转化植株
花序上。
(3) 将雌花序的顶端切去，用一塑料袋套住整个花序，塑料袋底部用橡皮筋扎 紧，将菌液灌注于塑料袋中浸染90sec左右。
(4) 使用注射器，将菌液从玉米雌花序顶端注射到苞皮中，直到菌液从花序顶 端溢出。
浸染过程结束，所有花或雌蕊都已被浸润后，用硫酸钠纸袋将处理过的花序套住，以 保持一定的湿度。
6. 重复
整个转化过程每天进行一次，共重复三次。每次浸染后都需要套袋，纸袋可于最后一 次转化后的24hr后去掉。
7. 收获
转化后其他管理按照常规技术进行，直至种子成熟收获。每个转化植株都采取单株收 种(TO代种子)，对T1代进行筛选及其它检测。
二、 Tl代转化株的筛选及检测
1. Tl代转化株的抗生素筛选
将收获的TO代种子，用Hygmycin筛选。转化株由于带有力/ t抗性基因而对Hygmycin不 敏感。具体筛选浓度为甜高粱100mg/L，谷子50mg/L，玉米20mg/L。两周后选取抗性植株， 做进一步的分子检测验证。
2. T1代转化株的PCR检测
对表现Hygtnycin抗性的植株，PCR检测如￡基因。植物基因组DNA的提取采用CTAB法。 根据力pt基因的序列，设计PCR扩增引物序列如下-
引物l (上游引物)5' TCGGCGAGTACTTCTACACAGC 3' 引物2 (下游引物)5' CTGGCAAACTGTGATGGACGAC 3' 禾拥引物1和引物2以抗性植株基因组DNA模板，扩增/^基因,扩增体系为
IOX缓冲液2
10 mM dNTP: 0.5
10 -引物1: 0.4 10 pM引物2: 0.4
基因组DNA (genomic DNA): 10 pg ; Taq ■ Polymerase (5U/V1): 0.5 (al;ddH20:补足20 pl。 PCR反应条件为
预变性95°C, 5分钟; 变性94°C， 20秒; 退火55°C， 30秒； 延伸72°C， l分钟;
30个循环后72。C, IO分钟。 反应结束后，对PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳检测，如果转化成功可以检测到 500bp的目的片段。实验结果呈阳性，证明基因已经整合到水稻基因组中，即得到T1代转 基因植株。部分检测结果如图2所示，图中ck+为质粒pKATl-AsRed阳性对照；ck-为野生 型植株阴性对照；H20为未加模板阴性对照；M为DNA分子量标准；玉米植株编号为ml m7,其中m2和m4为阳性；甜高粱植株编号为sl s7，其中sl、 s2、 s5和s6为阳性；谷 子植株编号为1 5，其中l、 4和5为阳性。
3. Tl代转化株的报告基因检测
pKAT1-AsRed载体中使用的报告基因是红色荧光蛋白AsRed。由于报告基因选用的是胚 乳特异的启动子，当种子的种皮较厚时，比较难观察到种子内部发出的荧光。所以本实验 选择将种子破碎后，观察红色荧光的表达情况。从每种转化处理中选择1000粒T0代种子， 用钳子夹碎后观察红色荧光。部分观察结果如图3和图4所示，其中
图3是对转基因谷子的观察结果，其中A为在正常光照条件下，破碎后的谷子种子照片， 左侧为转基因种子，右侧为野生型种子；B为同样的谷子种子在558nm的激发光下，左侧的 转基因种子发出583nm的红色荧光，右侧的野生型种子检测不到红色荧光；
图4是对转基因甜高粱的观察结果，其中C为在正常光照条件下，破碎后的甜高粱种子 照片，左侧为转基因种子，右侧为野生型种子；D为同样的甜高粱种子在558nm的激发光 下，左侧的转基因种子发出583nm的的红色荧光，右侧的野生型种子检测不到红色荧光。
以上实验证明，利用我们改进的方法可以对甜高粱、谷子、玉米等禾本科作物进行转 化，对这类作物的分子育种具有重要意义。
权利要求
1.一种转化禾本科作物的方法，包括以下步骤1)将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有SilwetL-77、曲拉通X-100和赤霉素；2)在活体条件下进行浸花法转化将待转化的禾本科作物目的植株的全部花序或雌蕊部分浸泡于所述渗透培养基中，或者将所述渗透培养基喷洒于花序或雌蕊上，利用农杆菌将目的基因整合到目的植株基因组中。
2. 根据权利要求1所述的转化禾本科作物的方法，其特征在于所述渗透培养基中Silwet L-77的用量为50-500ul/L。
3. 根据权利要求1所述的转化禾本科作物的方法，其特征在于所述渗透培养基中曲拉通X-100的用量为50-500 u 1/L。
4. 根据权利要求1所述的转化禾本科作物的方法，其特征在于所述渗透培养基 中赤霉素的用量为l-10ug/L。
5. 根据权利要求1所述的转化禾本科作物的方法，其特征在于所述含有目的基因的农杆菌的获得是将目的基因插入到表达载体中，再将该表达载体导入农杆 菌中。
6. 根据权利要求5所述的转化未本科作物的方法，其特征在于所述表达载体选 自pBin系列载体、pBI系列载体、Gateway系列载体、pCAMBIA系列载体。
7. 根据权利要求1所述的转化禾本科作物的方法，其特征在于所述农杆菌选自 下列菌株LBA4404、 GV3皿、EHA105。
8. 根据权利要求1所述的转化禾本科作物的方法，其特征在于所述步骤2)的转 化过程每天进行一次，共重复三次，每次浸染后用硫酸钠纸袋将处理过的花序 套住，纸袋于最后一次转化后的24hr后去掉。
9. 根据权利要求1 8中任一权利要求所述的转化禾本科作物的方法，其特征在于 所述禾本科作物为甜高粱、谷子或玉米。
全文摘要
本发明提供了一种改进的浸花法转化禾本科作物的方法，包括以下步骤1)将含有目的基因的农杆菌用渗透培养基悬浮，所述渗透培养基含有Silwet L-77、TritonX-100和GA；2)在活体条件下，将待转化的目的植株的全部花序或雌蕊部分浸泡于上述渗透培养基中，或者将上述渗透培养基喷洒于花序或雌蕊上，利用农杆菌将目的基因整合到目的植株基因组中。利用这种转基因方法，本发明解决了一些难于进行常规转化的禾本科作物的转化问题，具有较大的实际应用价值。
文档编号C12N15/82GK101186926SQ200710178499
公开日2008年5月28日 申请日期2007年11月30日 优先权日2007年11月30日
发明者莉 凌, 勉 夏, 张会新 申请人:北京未名凯拓农业生物技术有限公司