专利名称：：检测磺脲类受体1基因多态性位点的引物、用途及试剂盒的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种用PCR方法检测磺脲类受体基因多态性位点基因型的特异性引物，尤其是磺脲类受体l基因T1369G(rs757110)多态性位点的特异性引物，以及该特异性引物在制备通过PCR扩增生物样品检测磺脲类受体1基因T1369G多态性位点的试剂中的用途、包含特异性引物的磺脲类受体1基因T1369G多态性位点检测试剂盒、试剂盒预测磺脲类药物作用效果的用途，属于医药生物
技术领域：
。
背景技术：
：磺脲类抗糖尿病药物是一种促胰岛素分泌剂，可以降低空腹和餐后血糖。对于大多数新诊断的2型糖尿病患者，磺脲类抗糖尿病药物可以使空腹血糖下降5080mg/dl，使糖化血红蛋白(HbAlc)下降1.0%2.5%。因为2型糖尿病患者的卩细胞功能随时间而衰减，磺脲类抗糖尿病药物降低临床新诊断的糖尿病患者的血糖水平十分有效。磺脲类抗糖尿病药物与KATP通道的亚单位——高亲和性磺脲类药物受体(sulfonylureareceptor1，SUR1)结合后关闭K+通道，使细胞膜上的部分区域去极化引起电压依赖性L一型Ca"通道开放，Ca"进入细胞内，胞浆中Ca^浓度升高，从而刺激胰岛素分泌。磺脲类抗糖尿病药物还可以通过胰岛外的作用，增强胰岛素作用于靶器官(肝、肌肉、脂肪细胞)。临床上广泛应用的磺脲类抗糖尿病药物包括甲苯磺丁脲(Tolbutamide)、氯磺丙脲(Chlorpropamide)、格列本脲(GUbenclamide)、格列波脲(Glibornuride)、格列环脲(Glycyclamide)、格列己脲(Glyhexamide)、格列沙脲(Glisamuride)、格列生脲(Glisentide)、格列索脲(Glisolamide)、格列辛脲(Glyoctamide)、格列齐特(Gliclazide)、格列吡嗪(Glipizide)、格列吡嗪缓释片(GlucotrolXL)、格列喹酮(Gliquidone)和格列美脲(Glimepiride)。磺脲类药物对于适用人群(非超重或非肥胖2型糖尿病患者)的总有效率为5080%，有部分适用人群存在磺脲类药物原发性失效和继发性失效。常见的副作用为低血糖、抽搐，偶见胃肠道反应、皮疹、头痛。遗传背景不仅可能影响疾病的发生，而且影响药物疗效的个体差异。随着药物遗传学研究的不断深入和发展，在未来糖尿病的药物治疗中，将可能利用遗传学筛查方法，实现因人而异的个体化临床用药目标，有效避免不合理用药、错误用药乃至滥用药物倾向，减少用于治疗药物不良反应的费用，避免无效用药造成的浪费。3申请号码为200610002633.1的发明专利申请公开了SUR1基因的多态性位点基因型和磺脲类药物降低血糖、改善和恢复胰岛(3细胞功能和/或增强胰岛素敏感性作用效果的关系(1)当所述的SUR1基因的多态性位点基因型为Alal369Ala(rs757110)纯合突变型时，预测磺脲类药物降低血糖、改善和恢复胰岛P细胞功能和/或增强胰岛素敏感性的作用效果强；所述的SUR1基因的多态性位点基因型为Serl369Ser(rs757110)纯合野生型吋，预测磺脲类药物降低血糖、改善和恢复胰岛p细胞功能和/或增强胰岛素敏感性的作用效果弱；(2)所述的SUR1基因的多态性位点基因型为Serl369Ser(rs757110)纯合野生型时，预测达到理想的降糖效果需要磺脲类药物的首次剂量较大，多次调整剂量后磺脲类药物的降糖效果较差；所述的SUR1基因的多态性位点基因型为Alal369Ala(rs757110)纯合突变型时，预测达到理想的降糖效果需要磺脲类药物的首次剂量较小，多次调整剂量后磺脲类药物的降糖效果较好。
发明内容本发明要解决的技术问题是在现有SUR1基因T1369G多态性位点(rs757110)基因型和磺脲类药物降低血糖、改善和恢复胰岛P细胞功能和/或增强胰岛素敏感性作用效果的关系的基础上，提供一种用PCR方法检测SUR1基因T1369G多态性位点(rs757110)的特异性引物、该特异性引物在制备通过PCR扩増生物样品检测SUR1基因T1369G多态性位点的试剂中的用途、包含特异性引物的SUR1基因T1369G多态性位点检测试剂盒以及该检测试剂盒预测磺脲类药物作用效果的用途。为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案一种用PCR方法检测SUR1基因T1369G多态性位点(Serl369Ala，rs757110)的特异性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT，GGGGAAGGCAATAGAAGGAG，CTGAAAACCGAGGCAGAGAG，CTGACCTTCTGTCCAGGTGC。本发明还提供了上述特异性引物在制备通过PCR扩增生物核酸样品检测SUR1基因T1369G多态性位点的试剂中的用途。在本发明提供的用途中，所述的试剂中含有检测SUR1基因T1369G多态性位点的特异性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT，GGGGAAGGCAATAGAAGGAG，CTGAAAACCGAGGCAGAGAG,CTGACCTTCTGTCCAGGTGC。在本发明提供的用途中，所述的试剂中还含有20-30mM的Mg2+、2-10U/ulTaq聚合酶和1-2.5mMdNTP。在本发明提供的用途中，PCR循环条件为94°C3分钟1个循环，94°C45分钟35个循环，57°C1分钟35个循环，72°C1分钟35个循环，72°C7分钟1个循环在本发明提供的用途中，生物核酸样品选自血液样品、体液样品、组织样品和培养细胞，优选的，所述样品为血液样品。其中血液样品包括外周血细胞、白细胞、血清等，体液祥品包括尿液、唾液、组织液、脑脊液、体腔渗出液等，组织样品包括口腔粘膜试子、毛发、皮肤、活检组织、组织样分泌物、排泄物样本等。生物核酸样品适用于来自正常人群、空腹血糖受损人群、糖耐量受损人群和糖尿病人群，也适用于存在患糖尿病高风险因素人群，特别适用于体重指数较高、超重、胰岛功能较差、胰岛素敏感性较差、病程长、合并高血压、或者合并高血脂的糖尿病人群。一种检测SUR1基因T1369G多态性位点的试剂盒，试剂盒包含特异性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT、特异性引物GGGGAAGGCAATAGAAGGAG、特异性引物CTGAAAACCGAGGCAGAGAG、特异性引物CTGACCTTCTGTCCAGGTGC、1-2.5mMdNTP、2-10U/(ilTaq聚合酶和20-30mM的Mg2+。作为一种优选，本发明实施例提供的试剂盒中含有特异性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT，特异性弓l物GGGGAAGGCAATAGAAGGAG，特异性弓l物CTGAAAACCGAGGCAGAGAG,特异性弓I物CTGACCTTCTGTCCAGGTGC,25mMMg2+、5U/ulTaq聚合酶和1.25mMdNTP。本发明提供的试剂盒除了包含测定SUR1基因T1369G多态性位点所需要的特定引物之外，还包含运用PCR扩增而进行检测的试剂盒的常规组件、试剂、缓冲液等，本领域技术人员熟悉这些常规组件和检测方法。本发明提供的检测试剂盒具有预测磺脲类药物作用效果的用途。本发明提供的检测试剂盒预测磺脲类药物作用效果的用途中，磺脲类药物选自格列本脲、格列波脲、格列环脲、格列己脲、格列美脲、格列平脲、格列沙脲、格列生脲、格列索脲、格列辛脲、格列齐特、格列吡嗪、和格列喹酮，优选为格列齐特或格列美脲。本发明提供的检测试剂盒预测磺脲类药物作用效果的用途中，(l)糖尿病患者SURl基因的多态性位点基因型为Alal369Ala(rs757U0)纯合突变型时，其服用磺脲类药物后，预测磺脲类药物降低血糖、改善和恢复胰岛[3细胞功能和/或增强胰岛素敏感性的作用效果强；当糖尿病患者SUR1基因的多态性位点基因型为Serl369Ser(rs757110)纯合野生型吋，其服用磺脲类药物后，预测磺脲类药物降低血糖、改善和恢复胰岛(3细胞功能和/或增强胰岛素敏感性的作用效果弱；(2)当糖尿病患者SUR1基因的多态性位点基因型为Serl369Ser(rs757110)纯合野生型时，其服用磺脲类药物后，预测达到理想的降糖效果需要磺脲类药物的首次剂量较大，多次调整剂量后磺脲类药物的降糖效果较差；当糖尿病患者SUR1基因的多态性位点基因型为Alal369Ala(rs757110)纯合突变型时，其服用磺脲类药物后，预测达到理想的降糖效果需要磺脲类药物的首次剂量较小，多次调整剂量后磺脲类药物的降糖效果较好。本发明中的理想降糖效果指治疗后空腹血浆血糖值(FPG)《7.0mmol/L或者治疗后空腹血桨血糖值(FPG)与治疗前相比下降220%。本发明的优点是以特异性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT、特异性引物GGGGAAGGCAATAGAAGGAG、特异'性弓l物CTGAAAACCGAGGCAGAGAG禾口特异性引物CTGACCTTCTGTCCAGGTGC为核心，制备通过PCR扩增生物核酸样品检测SUR1基因T1369G多态性位点的试剂，并提供一种检测SUR1基因T1369G多态性位点的试剂盒以及试剂盒预测磺脲类药物作用效果的用途。本发明PCR模板制备方法操作简单，无需特殊设备，PCR扩增后直接采用电泳方法检测PCR产物，无需其他特殊检测方法和检测仪器设备，即可以根据电泳结果确定磺脲类受体的多态性位点基因型。根据磺脲类受体的基因多态性结果，结合个体的其他生物学指标对于磺脲类药物的疗效和副作用进行预测。本发明克服了临床选择磺脲类药物的盲目性，在基因型分析的基础上可以预测患者使用磺脲类药物的有效性和安全性，指导临床用药，使患者能够进行个体化医疗，尽早有效地控制血糖，减少毒副作用，减少医疗成本。本发明特别针对SUR1T1369G(Serl369Ala，rs757110)多态性位点基因型设计了PCR扩增引物，与常规的扩增引物相比较，扩增效率高、特异性好、省时，能够直接根据PCR产物的片段大小鉴定该位点的基因型，无需后续的检测步骤和相应的试剂、设备，有更好的使用价值。图1SUR1Serl369Ala多态性基因型图示1为503bp;2为319bp;3为223bp图216份样本电泳结果图具体实施例方式实施例1用PCR方法检测SUR1基因T1369G多态性位点基因型一、样本准备分别取12份EDTA抗凝血做为样本来源，按照下述步骤制备样本。1.1.5ml离心管中，加入EDTA抗凝血标本100^12.加入30(^1红细胞裂解液，37'C孵育20分钟。3.离心，取沉淀4.加入lOOpl白细胞裂解液，将沉淀重悬，37'C孵育15分钟5.加入35pl蛋白沉淀液，高速振荡90秒。6.离心，取上清，将上清液全部移入装有100^1异丙醇的1.5ml离心管中，来回轻柔的摇匀IO次至有白色絮状物出现；15000g离心90秒，离心管底部可见白色沉淀。7.弃上清液，注意保留白色沉淀，毎管加入100^175%乙醇，15000g离心90秒，弃上清液，注意保留白色沉淀，轻轻在吸水纸上敲干残液，于空气中干燥3分钟；8.每管加入提前预热至65°C的TE缓冲液60|il，中速振荡5秒后低速离心2秒以收集液体于离心管底部。二、基因的PCR扩增检测用四引物双向PCR方法检测SUR1基因T1369G多态性位点基因型引物信息见表1。表l引物信息<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>相关的试剂和仪器设备情况如下TaqDNA聚合酶，本品购自上海生工公司。仪器设备微量移液器，PCR仪，高速离心机，微波炉，凝胶成像系统，电子天平，电泳槽，电泳仪、纯水器，灭菌锅，电热(隔水)培养箱。PCR反应体系配置见表2。PCR扩增程序见表3。PCR反应的模版量为2ul，不干燥。终止反应的方法所有循环结束后，设定的PCR程序会自动终止反应。三、扩增产物的电泳检测使用2%的琼脂糖凝胶电泳检测，PCR结果1.试剂配制2%琼脂糖凝胶琼脂糖(Agarose)2glxTBE电泳缓冲液100ml2.操作步骤向PCR反应产物中加入适量的上样缓冲液，混匀后加样在2%琼脂糖凝胶上，于200V电压下电泳11.5小时后，在紫外透射监测仪上读取胶图并进行基因型分析。根据表4分析基因型。表2PCR反应体系配置<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>表3PCR反应条件和循环数<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>表4多态性位点基因型的靶序列<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>电泳结果如图2。根据上述的基因分型表可得到如下结果l杂合突变型(TG);2纯合野生型(TT);3杂合突变型(TG);4纯合野生型(TT);5杂合突变型(TG);6纯合野生型(TT);7杂合突变型(TG);8纯合野生型(TT);9杂合突变型(TG);IO纯合突变型(GG);ll杂合突变型(TG);12纯合突变型(GG);13杂合突变型(TG);14纯合突变型(GG);15杂合突变型(TG);16纯合突变型(GG)<110〉北京华安佛医药研究中心有限公司深圳奥萨医药有限公司〈120〉检测磺脲类受体l基因多态性位点的引物、用途及试剂盒<160〉4<170>Patentlnversion3.3<210〉1〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列<400>1gcacgtcaatgccctcaact20<210〉2〈211〉20<212>腿<213>人工序列<400>2ggggaaggcaat卿aggag20〈210〉3〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈400〉3ctgaaaaccgaggcagagag20<210〉4<211〉20〈212〉DNA<213〉人工序列〈400〉4ctgaccttctgtccaggtgc20权利要求1.—种用PCR方法检测SUR1基因T1369G多态性位点(rs757110)基因型的特异性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT，GGGGAAGGCAATAGAAGGAG，CTGAAAACCGAGGCAGAGAG，CTGACCTTCTGTCCAGGTGC。2.权利要求1所述的特异性引物在制备通过PCR扩增生物核酸样品检测SUR1基因T1369G多态性位点(rs757110)基因型的试剂中的用途。3.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述的试剂中含有20-30mM的Mg"，优选25mM。4.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述的试剂中含有2-10UlTaq聚合酶。5.如权利要求4所述的用途，其特征在于所述的试剂中含有5UlTaq聚合酶。6.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述的试剂中含有1-2.5mMdNTP，优选1.25mM。7.如权利要求2所述的用途，其特征在于所述的PCR扩增中PCR循环条件为94°C3分钟1个循环，94°C45分钟35个循环，57°C1分钟35个循环，72°C1分钟35个循环，72°C7分钟1个循环。8.—种检测SUR1基因T1369G多态性位点(rs757110)基因型的试剂盒，包含特异性引物GCACGTCAATGCCCTCAACT，特异性弓l物GGGGAAGGCAATAGAAGGAG，特异性引物CTGAAAACCGAGGCAGAGAG，特异性引物CTGACCTTCTGTCCAGGTGC，l-2.5mMdNTP，2-10U/|ilTaq聚合酶和20-30mM的Mg2+。9.权利要求8所述的检测试剂盒预测磺脲类药物作用效果的用途。10.如权利要求9所述的用途，其特征在于所述的磺脲类药物选自格列本脲、格列波脲、格列环脲、格列己脲、格列美脲、格列平脲、格列沙脲、格列生脲、格列索脲、格列辛脲、格列齐特、格列吡嗪、和格列喹酮，优选为格列齐特或格列美脲。11.如权利要求9所述的用途，其特征在于(1)所述SUR1基因多态性位点基因型为Alal369Ala(rs757110)纯合突变型时，预测磺脲类药物降低血糖、改善和恢复胰岛P细胞功能和/或增强胰岛素敏感性的作用效果强；所述SUR1基因多态性位点基因型为Serl369Ser(rs757110)纯合野生型时，预测磺脲类药物降低血糖、改善和恢复胰岛P细胞功能和/或增强胰岛素敏感性的作用效果弱；(2)所述SUR1基因多态性位点基因型为Serl369Ser(rs757110)纯合野生型时，预测达到理想降糖效果需要磺脲类药物的首次剂量较大，多次调整剂量后磺脲类药物降糖效果较差；所述SUR1基因多态性位点基因型为Alal369Ala(rs757110)纯合突变型时，预测达到理想降糖效果需要磺脲类药物的首次剂量较小，多次调整剂量后磺脲类药物降糖效果较好。全文摘要本发明提供一种用PCR方法检测SUR1基因T1369G多态性位点(rs757110)基因型的特异性引物、该特异性引物在制备通过PCR扩增生物样品检测SUR1基因T1369G多态性位点的试剂中的用途、包含特异性引物的SUR1基因T1369G多态性位点检测试剂盒以及该检测试剂盒预测磺脲类药物作用效果的用途。磺脲类药物选自格列本脲、格列波脲、格列环脲、格列己脲、格列美脲、格列平脲、格列沙脲、格列生脲、格列索脲、格列辛脲、格列齐特、格列吡嗪和格列喹酮，优选为格列齐特或格列美脲。文档编号C12Q1/68GK101445824SQ20071017822公开日2009年6月3日申请日期2007年11月28日优先权日2007年11月28日发明者多于,张彦明,徐希平,燕王,玉王,谢爱武,邢厚恂申请人:北京华安佛医药研究中心有限公司;深圳奥萨医药有限公司