专利名称：：快速脱除百合三种病毒的方法
技术领域：
：本发明涉及生物
技术领域：
，特别是涉及快速脱除百合三种病毒的方法。
背景技术：
：百合三种病毒LSV、CMV、LMoV是造成百合经济作物减产的主要原因。现有的脱去上述三种病毒的主要方法有如下几种l)茎尖分生法茎尖分生区是病毒含量最少的区域。茎尖分生组织仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm进行的无菌培养。但，这么小的茎尖实际上很难取得，成活率很低，且培养成苗的时间也很长。因此，在实际培养中，多采用带有叶原基的生长锥来培养，通常0.20.4mm(毫米)的茎尖分生组织，但，带毒的几率增大。Kim对带LSV、CMV、LMoV的铁炮百合'Georgia'进行茎尖脱毒；席梦利也采用茎尖脱毒对宜兴百合进行脱毒，获得了组培苗，但未进行病毒检测。2)热处理是利用病毒和寄主植物对高温的忍耐性的差异,选择一定的温度和适当的处理时间，使寄主体内的病毒钝化失活，从而达到减轻病毒危害的目的。应用热处理与茎尖培养相结合方法能够更加有效脱除病毒。38±1°C，6h或25°C8h热空气和50±1°C，40min恒温水浴结合茎尖培养脱除了宜兴百合的CMV病毒。3)抗病毒药剂法其作用原理是抗病毒药剂在三磷酸状态下会阻止病毒RNA帽子结构形成,抑制病毒增殖或移动。Blom-Barnhoorn采用不同的病毒唑浓度(20和100mg/L)，分别获得了两个百合品种'Georgia'和'ConnecticutKing，的无毒苗；Xu-PinSan在鳞片诱导培养基中加5mg/L(毫克/升)的病毒唑和硫尿嘧啶，获得80%无毒百合植株。Dapkuniene将组培小籽球在加有5mg/L(毫克升)苄基腺嘌呤和0.1mg/LNAA的MS培养基中获得了4个品种的无毒百合籽球。但现有的检测方法中还存在如下问题茎(根)尖培养(stemorshoottipculture)是切取茎(根)的先端部分或茎(根)尖分生组织部分进行的无菌培养。严格地讲，茎尖分生组织仅限于顶端圆锥区，其长度不超过0.1mm。但这么小的茎尖实际上很难取得，且培养成苗的时间也很长。因此，在实际培养中，常采用带有叶原基的生长锥来培养。实际操作不可能得到不超过0.1mm的茎尖。较大茎尖脱毒率大为降低，甚至不能脱毒。应用热处理与茎尖培养相结合方法能够更加有效脱除病毒。但实际上38士rC，6h和50士rC40min恒温水浴下，茎尖培养不能成活，25。C8h热空气不能脱除LSV、LMoV。抗病毒药剂法中抗病毒剂的使用浓度越高,处理时间越长脱毒效果越加明显，但同时，高浓度抗病毒剂对植株的生长有明显伤害。获得无病毒植株的难易程度与品种和感染病毒的种类有直接关系。同时，与病毒检测技术方法相关，早期均采用指示植物和ELISA法检测，灵敏度较低，很多情况下并没有真正完全脱除病毒。
发明内容本发明针对上述三种方法的缺陷，提供一种快速脱除百合三种病毒的方法，并结合灵敏的病毒检测方法，解决成活率低，脱毒率低，再生速率低等技术问题，从而达到高效快速脱毒的目的。快速脱除百合三种病毒的方法，其特征在于将茎尖分生组织接种于含有病毒唑的培养基上，所述茎尖大小为0.5mm0.8mm，病毒唑浓度为4mg/L6mg/L。培养基成分为MS+IBA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，蔗糖3%，琼脂6g/L。培养条件200030001x，光照时间14h/d，培养温度2025'C。本申请组合茎尖脱病法及抗病毒药剂法，将切取的茎尖分生组织增大，这样可以縮短了其培养的时间，但其所含病毒量增加了，采用一定浓度的病毒唑对其进行脱毒，由于病毒含量提高，其病毒唑的浓度应控制在一定的范围内，浓度太高，易造成死亡，浓度太低起不到脱毒的效果，本发明经过反复实验得出，茎尖大小为0.5mm0.8mm，病毒唑浓度为4mg/L6mg/L，脱毒效果最好，且脱毒组织经过3个月，18个月和栽培成花全过程检测，证明本发明方法脱毒率达92%。本发明方法采用茎尖大小为0.5mm0.8mm作为脱毒培养组织，容易切取，而且成活率和再生速率都大大提高了，由于茎尖增大了，其耐病毒唑浓度也提高了，所以可以在较高病毒唑浓度(4mg/L6mg/L)下脱除病毒，脱毒率大大提高。图l:部分处理组合生长4周状况其中A:0.50.7茎尖和2mg/L病毒唑形成愈伤组织，B:0.50.7茎尖和8mg/L病毒唑愈伤组织死亡，C:0.20.4茎尖和2mg/L病毒唑形成愈伤组织，D:1.01.2茎尖和4mg/L病毒唑形成的植株图2:东方百合<元帅'LSV跟踪检测电泳图第1泳道接种3周的茎尖和愈伤组织；第2泳道生长9周的脱毒苗；第3泳道生长12周形成的脱毒苗；第4泳道茎尖直接形成的脱毒子球；第5泳道脱毒子球形成的开花植株；第6泳道阳性对照(脱毒前的病毒条带)；第7泳道阴性对照。图3:原始材料、脱毒组织在培养阶段、瓶中成球和成花栽培后的状态其中l:东方百合'元帅'3种病毒复合侵染表现出花瓣斑驳，花柱发育不良，2:OT杂交系'动人'3种病毒复合侵染表现出叶巻曲，3:百合种球的茎尖，4:接种2周的茎尖，5:生长7周的茎尖，6:生长9周形成的脱毒苗，7:茎尖直接形成的脱毒子球，8:脱毒开花植株。具体实施方式1)脱毒方法取经低温处理已抽芽36cm的鳞茎，从茎节处切下，去掉外部鳞片。用自来水冲洗lh，蒸馏水浸泡10min，再用0.1%氯化汞消毒10min(加几滴吐温80)，最后无菌水冲洗35次。在带有测微尺的体视显微镜(Olympus,SZX10)无菌条件下切取带有1一2个叶原基的，不同大小的茎尖分生组织，迅速接种于添加不同浓度病毒唑的培养基上，进行茎尖培养。培养基成分为MS+IBA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，蔗糖3%，琼脂6g/L。培养条件20003000k，光照时间14h/d，培养温度2025°C。根据均匀试验设计，茎尖大小设为4个水平0.2-0.4mm、0.5-0.7mm、0.8-1.0mm、1.0-1.2mm;病毒唑浓度设为5个水平，Omg/L、2mg/L、4mg/L、8mg/L、10mg/L，共20个处理，每个处理30个茎尖。注意观察茎尖的生长情况，统计茎尖成活率。(见表l、表2)接种茎尖到添加不同病毒唑浓度的分化培养基上，7d左右，观察到有的茎尖开始膨大变绿，有的因为失水而变褐，死亡。20d左右，存活的茎尖有的分化成芽，有的膨大形成愈伤组织。每隔25d更换一次培养基，保证茎尖生长所需营养。随着茎尖不断的吸收作用，当病毒唑浓度大于6mg/L，部分茎尖慢慢失绿，变褐或成为白化苗死亡。当病毒唑浓度达到10mg/L时，茎尖的成活率只有30%。(见图l)表l因素水平表Table1Thecombinationoftheexperiment_水平因素A病毒唑浓度ConcentrationofVirazole(mg/L)10B茎尖大小Sizeoftipmeristem(mm)0.20.40.50.70.81.01.01.2表2正交试验结果分析表Table2Analyzeoftheexperiment<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>从成活的组培苗中，每个处理随机选取3个进行多重RT-PCR检测。试验结果表明感病百合中CMV和LMoV被全部脱除，而LSV在部分组培苗中还存在。在没有添加病毒唑的处理中，茎尖大小在0.2-0.4mm范围时，可以脱除全部病毒。但从上表结果显示，此范围内茎尖的成活率只有40%，而且由于操作困难，茎尖太小极易失水而失活，茎尖生长也很缓慢。当茎尖大于1.0mm时，病毒唑浓度即使达到10mg/L也不能完全脱除病毒。病毒唑浓度小于4mg/L时，检测到CMV+LSV两种病毒同时存在的现象。当病毒唑浓度大于4mg/L时，未脱除的只有LSV,而CMV和LMoV均无。病毒唑浓度大于6mg/L，茎尖大小小于1.0mm时，LSV也被脱除。当病毒唑浓度达到4mg/L时，茎尖大小在0.8mm以上，有部分病毒不能脱除；病毒唑浓度在6mg/L以上时，大部分病毒均可被脱除。在10mg/L，茎尖大小小于1.0mm时，病毒脱除率可达98%，但是该浓度时茎尖的成活率却只有30%。综合茎尖成活率和脱毒率两因素，当病毒唑浓度在4mg/L6mg/L之间，茎尖大小在0.5mm0.8mm，效果最好，病毒脱除率可达92%。2)检测本发明方法的效果应用本实验室建立的RT-PCR方法进行病毒检测，并分别在脱毒原始材料、脱毒组织培养3个月、18个月和栽培成花全过程(见图3)检测病毒。针对CMV、LMoV和LSV三种病毒外壳蛋白CP基因保守序列设计了三对引物，利用该方法扩增不同的目的片段。引物序列分别是CMV:上游引物5，-ATGGACAAATCTGAATCAACCAG及下游引物5'-TCAGACTGGGAGCACTCCG..。LMoV:上游引物5'隱GCAAATGAGACACTTAACGCT及下游引物5'-CATAGAAATTCCAAGTAAGGGG。LSV:上游引物5'-ATGCAATCAAGACCAGCACAAG及下游引物5'-TTTGTGTATCGATGATTTCGG。1.植物总RNA提取与cDNA第一链的合成称取新鲜病叶50mg,在1.5mL的eppendorf管中，加入少量液氮，用干净灭菌的玻璃棒迅速磨碎，力Q500nL病毒抽提液0.5MpH8.0的Tris-HCl，2%PVP-40,1%PEG6000,0.8%NaCI和0.05%Tween20。继续研磨混匀，从中取10yL用抽提液再稀释50~100倍后即为工作液(RT-PCR的模板)。2多重RT-PCR扩增PCR程序PCR程序42°C反转录30min，95。C4min，94。C20s,52°C30s，72°C40s,72。C5min，30个循环。反应在PCR扩增仪(PTC-100programmablethermalcontroller,MJ.reseachInc)上进行，30个循环，72'C延伸5min，最后于4'C结束。2)反应产物的电泳检测扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，电泳缓冲液为0.5XTBE，电压100V，PCR产物上样量为6pL，用凝胶成像仪GdDoc1000凝胶分析仪(Bio-Rad)扫描并产生TIFF图象，经图象分析软件(QUANTYONE)进行分析。(见图2)结论经本发明方法处理过的脱毒级组织经再培养后没有发现有病毒，说明本发明方法脱毒反应体系:总RNA提取物5攀0.5nL0.2nL0.5nL2.5|xL1.6nL0阜0.5nL0.5mL0.5nL13|oL25pLOligodTPrimer(0.5ng/|iL)SSII反转录酶(20U/pL)Rnaseinhibitor(40U/nL)TaqPCRbuffer(内含1.5mmol/LMgCl2)dNTP(200,l/L)Taq酶(5U/jiL)引物CMV,/CMV2(5pmol)引物LSV,/LSV2(5pmol)引物LMoVi/LMoV2(5ptno1)ddH20Total效果非常好权利要求1、快速脱除百合三种病毒的方法，其特征在于将茎尖分生组织接种于含有病毒唑的培养基上，所述茎尖大小为0.5mm～0.8mm，病毒唑浓度为4mg/L～6mg/L。2、根据权利要求1所述的方法，所述培养基成分为MS+IBA1.0mg/L+NAA0.1mg/L，蔗糖3%，琼脂6g/L。3、根据权利要求1或2所述的方法，所述培养条件为200030001x，光照时间14h/d，培养温度2025X:。全文摘要本发明涉及“快速脱除百合三种病毒的方法”，属于生物
技术领域：
。快速脱除百合三种病毒的方法，其特征在于将茎尖分生组织接种于含有病毒唑的培养基上，所述茎尖大小为0.5mm～0.8mm，病毒唑浓度为4mg/L～6mg/L。本发明脱除百合病毒的方法，脱毒组织具有脱毒率高，成活率高，再生速率快的优点。文档编号C12N7/00GK101173251SQ20071017869公开日2008年5月7日申请日期2007年12月4日优先权日2007年12月4日发明者博刘,春刘,徐榕雪,军明,汤庚国,王晓武,鼎穆申请人:中国农业科学院蔬菜花卉研究所