专利名称：一种低频高幅叠加高频低幅加载的方法及生物反应器的制作方法
一种低频高幅叠加高频低幅加载的方法及生物反应器技术领域：
本发明涉及细胞工程和组织工程领域，特别是一种低频高幅叠加 高频低幅载荷应用于细胞、组织培养和保存的方法及相关的生物反应 器，属于生物工程技术领域。背景技术：
随着组织工程的发展，人们对移植物和培养物培养条件的生物力学(biomehanics)和力学生物学(mechanobiology)研究越来越重视。最 近几年相关研究者对不同的力学刺激，以优化培养物的结构和功能做了大 量研究。国内有研究者采用静张应力对大鼠髁突软骨细胞增殖效应进行研 究，实验表明细胞增殖数量随静张应力增高而升高[华西口腔医学杂志， 2003, 21 (1)， 57-60];也有研究空气压应力对体外培养软骨细胞分泌细 胞因子的影响[解剖学报，2001， 32 (4)， 385-387]，离心力在体外构建 组织工程软骨中的作用[中华实验外科杂志。2005， 22 (3)， 281-283], 周期性流体应力刺激对组织工程软骨分化影响的实验研究[骨与关节损伤 杂志，2003， 18 (9)， 620-622]。这些加载方法可以促进细胞增殖或功能 发挥，但和真正软骨受载是有差别的。Mauck等[J Biomech Eng， 2000; 122(3): 252-260]把软骨细胞接种在琼脂糖凝胶进行动态直接施压，载荷 大小是使复合体变形10%，频率为lHz，探索功能化软骨组织工程的培养， 4周后发现GAG (氨基葡聚糖)升高45%，胶原含量增加37%，明显高于未加 载组。Buschmann等施加lHz，应变3%的动态压载荷进行软骨构建，实验表 明硫酸软骨素增加15%-25%，脯氨酸增加10%-25%，同时，在这种力学条件 下研究不同培养时间培养物弹性模量的变化。力学环境在生物反应器的研制占有重要位置，力学因素影响生物 体的整体，器官、组织、细胞和分子水平等各层次的生物学过程[Guilak et al. Functional Tissue Engineering, 2003， Springer]。 力学条 件的优化十分重要。比如人体在行走等活动中骨组织等受到的是低频 高幅载荷，同时肌肉为保持身体形态对骨施加高频低幅载荷，因此从 仿生角度，这种低频高幅叠加高频低幅加载方式可能优化组织工程或 组织保存的力学环境。有些专利技术给出了压力和剪应力耦合作用的生物反应器，发明专利(申请号200480038317.9，公开号CN 1898375A)介绍了用于对具有三维 形状、活性和机械抗力的细胞移植体进行培养和刺激的方法和生物反应 器。以软骨组织工程为例，Schulz和Bader， Ivan Martin总结了组织培养 时的环境[TRENDS in Biotechnology Vol. 22 No. 2 ， 2004，卯80-86; Eur BiophysJ， DOI 10. 1007/s00249-007-0139-1, 2007]。包括(a)为电场； (b)锥形粘度计条件，细胞在旋转锥形体下方受到剪切力作用；(c)旋 转壁式生物反应器给细胞提供微重力环境，传质过程较好；(d)单项灌流 系统；(e)拉伸条件；(f)水压及灌流条件；(g)直接压縮。其后介绍了 各种培养条件的耦合系统；特别是各种力学条件的联合使用。但都没有涉 及低频高幅叠加高频低幅加载方式。
发明内容本发明的目的旨在提供一种低频高幅叠加高频低幅加载应用于培养 物培养的方法及生物反应器。本发明所述的低频高幅叠加高频低幅载荷用于培养物培养的方法， 是在生物反应器内进行，包括具备5% C02和37度温度调节的细胞培养培 养箱，及灌流等条件，将培养物固定于培养室底板，其具体过程如下 灌流系统保证培养室内培养液的更换，培养物处于细胞可生长的生物 环境下，由计算机控制，通过加载器件使培养物被施加压载荷，该载 荷具有低频高幅叠加高频低幅的特征，其低频范围为b. l-10Hz，高幅 应变范围为0.001-0.2;高频范围为5-80Hz，低幅应变范围为 0.000001-0.01。各载荷波形可为方波、正弦波、三角波等，加载时间 为每24h加载l-3次，每次10min-360 min，培养l-60天。这样培养物受 到的是低频高幅叠加高频低幅载荷作用，在此种力学环境使组织生长、 发育，完成培养物的培养。本发明所述的培养液是生物学细胞培养常规培养液，可从市场上购 买。所述的培养箱是生物学细胞培养常规使用的，可从市场上购买。本发明所述的培养物是细胞、组织、细胞与支架复合体或移植组 织，其中，组织及移植组织是指骨、软骨等。所说的通过加载器件使培 养物被施加压载荷，是指在培养物表面直接施加动态低频高幅叠加高 频低幅载荷或给培养物覆盖弹性硅胶膜及多孔刚性薄板后间接加载。本发明为低频高幅叠加高频低幅加载方法设计了一种生物反应器。 生物反应器包括培养箱、培养液灌流系统、加载机构、培养室和计算机；加载机构、培养液灌流系统和培养室都放在培养箱内。该加载机 构主要包括框架、力传感器、两个串联一起的压电陶瓷位移器和位移 传感器。该培养室是一个封闭的容器，上下面分别为上下压块，上压 块与培养室之间有滑动密封垫；上压块与培养室之间可有相对滑动， 封闭的培养室壁上有培养液灌流接头，培养物放在培养室的上下压块 之间。该灌流系统包括培养液储存瓶，通过硅胶管与培养室连接，由 蠕动泵提供流动动力，都可在市场购买。该计算机是装有压电陶瓷位 移器软件系统(其软件可按需要在市场购买)及蠕动泵控制系统，可 对压电陶瓷位移器及蠕动泵进行自动控制。生物反应器工作时，压电陶瓷位移器与培养室的上压块连接，培养 室内有培养物，压电陶瓷位移器上方连接力传感器，这样力传感器、 压电陶瓷位移器与培养室一起放在框架内，由预紧螺栓消除间隙。计 算机控制分别输入的两个压电陶瓷位移器的电压信号，不同电压信号 形成两个压电陶瓷位移器不同驱动位移，使培养物受到低频高幅叠加 高频低幅加载波形。载荷的大小和形状分别由力传感器、位移传感器 传输到计算机上显示。灌流系统保证培养液的更换。本发明的有益效果是低频高幅叠加高频低幅加载方式更接近某 些组织生长发育的力学环境，实验表明此种加载方式比静态培养促进 了细胞的增殖。
图l为本发明所述的方法总框图；图2为本发明生物反应器中的加载机构立体示意图；图3为图2的剖面示意图；图4为本发明生物反应器中的灌流系统示意图；图5为每种压电陶瓷驱动器可加载的四种波形示意图；图6为一种低频高幅叠加高频低幅加载波形示意图；图中l框架；2预紧螺杆；3导向管；4位移传感器；5加载头；6 上压块；7培养室；8培养平台；9灌流接头；IO压电陶瓷驱动器；11压电陶瓷驱动器；12加载下压块，13滑动密封垫，14培养物，15力 传感器，16培养箱。
具体实施方式本发明所述的低频高幅叠加高频低幅载荷用于培养物培养的方法， 是在生物反应器内进行，如图1所示，它包括具备5% C02和37度温度调 节的细胞培养培养箱，及灌流等条件，在无菌条件下把目标细胞和支 架材料复合体、离体组织或临床移植物转移到消毒过的培养室内，按细 胞、组织培养标准过程操作，将培养物固定于培养室底板，由蠕动泵 驱动培养液灌注，保持培养液新鲜，培养液中加入活性因子(如，骨形 态蛋白等)。由计算机控制，通过加载器件使培养物被施加载荷，该 载荷具有低频高幅叠加高频低幅的特征，其低频范围为O. l-10Hz，高 幅应变范围为O. 001-0.2;高频范围为5-80Hz，低幅应变范围为 0.000001-0.01，各载荷波形可为方波、正弦波、三角波等；加载时间 为每24h加载l-3次，每次10min-360 min，培养1-60天。例如，载荷波 形为方波，低频率为O. 5Hz，高幅应变为0.01;叠加载荷波形为正弦波， 频率为20Hz，低幅应变为O. 000001。这样培养物受到的是低频高幅叠 加高频低幅载荷作用，如图6所示，在此种力学环境下，使组织生长、 发育，完成培养物的培养。本发明所述的培养液是生物学细胞培养常规培养液，可从市场上购 买。所述的培养箱是生物学细胞培养常规使用的，可从市场上购买。本发明所述的培养物是细胞、组织、细胞与支架复合体或移植组 织。所说的给培养物施加载荷，是指在培养物表面直接施加动态低频 高幅叠加高频低幅载荷或给培养物覆盖弹性硅胶膜及多孔刚性薄板后 间接加载。本发明为低频高幅叠加高频低幅加载方法设计了一种生物反应器， 如图2-6所示。该生物反应器包括培养箱16、加载机构(图2、 3所示)、 培养液灌流系统(图4所示)、培养室7和计算机；加载机构、培养液 灌流系统和培养室7都放在培养箱内。该加载机构主要包括框架l、力 传感器15、两个串联一起的压电陶瓷位移器ll， 12和位移传感器4。力 传感器15、两个串联一起的压电陶瓷位移器ll， 12和位移传感器4和加 载头5放在导向管3内，该培养室7是一个封闭的容器，上、下面分别为 上、下压块6、 12,上压块6与培养室7之间有滑动密封垫13;上压块6与培养室7之间可有相对滑动，封闭的培养室7的容器壁上穿设有培养 液灌流接头9，培养物14放在培养室7的上、下压块6、 12之间。该灌流 系统(如图4所示)包括培养液储存瓶，通过硅胶管与培养室7连接， 由蠕动泵提供流动动力，都可在市场购买。该计算机是装有压电陶瓷 位移器软件系统及蠕动泵控制系统，可对压电陶瓷位移器及蠕动泵进 行自动控制。该生物反应器工作时，压电陶瓷位移器ll与加载头5连接，加载 头5与培养室7的上压块6连接，培养室7内有培养物14，压电陶瓷位移 器10上方连接力传感器15,这样力传感器15、压电陶瓷位移器IO、 11、 加载头5和培养室7—起放在框架1内的培养平台8上，由预紧螺栓2紧压 消除其间隙。其中培养平台8可上、下调节位置。计算机控制分别输入 的两个压电陶瓷位移器的电压信号，不同电压信号形成两个压电陶瓷 位移器不同驱动位移，压电陶瓷驱动器IO实现低频高幅加载，同时压 电陶瓷驱动器ll实现高频低幅加载，载荷波形由位移传感器4检测，载 荷大小由力传感器15检测，传输到计算机上显示。这样实现对培养物 的低频高幅叠加高频低幅加载。该生物反应器使用的实例用于细胞力学响应的研究以骨组织工程为例，培养物在生物反应器中培养，其受到低频高幅 叠加高频低幅载荷作用，剌激支架内细胞生物学活动。采用成骨细胞系定量种植在规则、多孔的松质骨支架上，然后移到 培养室内，固定到培养室底板，加培养液灌注培养。反应器放在培养箱内，培养箱内有02、 C02、温度自动控制，由蠕 动泵驱动培养液灌注，保持培养液新鲜，灌注速度为0.01ml/min。培 养液中加入标准浓度的生长因子BMPs。施加低频高幅叠加高频低幅载荷，低频为lHz，高幅应变为0.002， 高频为20Hz，低幅应变为O. 00002， 24小时加载1 h。培养4天，取出复 合体检测细胞总量的变化，低频高幅叠加高频低幅载荷组的细胞总量 远远高于静态培养组，达到1.2-2.3倍。低频高幅叠加高频低幅载荷条 件可能有利于细胞、组织的生长、发育。
权利要求
1、一种低频高幅叠加高频低幅载荷用于培养物培养的方法，是在生物反应器内进行，其特征在于包括具备5％CO2和37度温度调节的细胞培养培养箱及灌流等条件，将培养物固定于培养室底板，其具体过程如下灌流系统保证培养室内培养液的更换，培养物处于细胞可生长的生物环境下，由计算机控制，通过加载器件使培养物被施加压载荷，该载荷具有低频高幅叠加高频低幅的特征，其低频范围为0.1-10Hz，高幅应变范围为0.001-0.2；高频范围为5-80Hz，低幅应变范围为0.000001-0.01；各载荷波形为方波、正弦波、三角波；加载时间为每24小时加载1-3次，每次为10-360分钟，培养1-60天；这样培养物受到的是低频高幅叠加高频低幅载荷作用，在此种力学环境下使组织生长、发育，完成培养物的培养。
2、根据权利要求l所述的生物反应器，其特征在于该生物反应器包括培养箱、培养液灌流系统、加载机构、培养室和计算机；加载机 构、培养液灌流系统和培养室都放在培养箱内；该加载机构主要包括 框架、力传感器、两个串联一起的压电陶瓷位移器和位移传感器；该 培养室是一个封闭的容器，上、下面分别为上、下压块，上压块与培 养室之间有滑动密封垫；上压块与培养室之间可有相对滑动，封闭的 培养室壁上设有培养液灌流接头，培养物放在培养室的上、下压块之 间；该灌流系统包括培养液储存瓶，通过硅胶管与培养室连接，由蠕 动泵提供流动动力；该计算机装有压电陶瓷位移器软件系统及蠕动泵 控制系统，可对压电陶瓷位移器及蠕动泵进行自动控制。
3、根据权利要求1所述的低频高幅叠加高频低幅加载的方法，其特征 在于所述的培养物是细胞、组织、细胞与支架复合体或移植组织。
4、根据权利要求2所述的生物反应器，其特征在于所述的培养物 是细胞、组织、细胞与支架复合体或移植组织。
5、 根据权利要求l所述的低频高幅叠加高频低幅加载的方法，其特 征在于通过加载器件使培养物被施加压载荷，是指在培养物表面直 接施加动态低频高幅叠加高频低幅载荷。
6、 根据权利要求l所述的低频高幅叠加高频低幅加载的方法，其特 征在于通过加载器件使培养物被施加压载荷，是指给培养物表面覆 盖弹性硅胶膜后间接加载。
7、根据权利要求l所述的低频高幅叠加高频低幅加载的方法，其特 征在于通过加载器件使培养物被施加压载荷，是指给培养物表面覆 盖多孔刚性薄板后间接加载。
全文摘要
一种低频高幅叠加高频低幅加载的方法及生物反应器，它在包括具备O<sub>2</sub>、CO<sub>2</sub>和温度调节、细胞培养的培养箱，及培养液灌流系统等条件下，将培养物固定于培养室底板；在培养期间，对培养物表面施加不同低频高幅叠加高频低幅载荷，其中低频为0.1-10Hz，高幅应变为0.001-0.2；高频为5-80Hz，低幅应变为0.000001-0.01，每种载荷波形可为方波、正弦波、三角波等的波形都可实现。为该方法设计了一种生物反应器，它包括培养箱、培养液灌流系统、加载机构、培养室和计算机；加载机构、培养液灌流系统和培养室都放在培养箱内，实现对培养物的低频高幅叠加高频低幅加载，完成对培养物的培养。实验表明此种加载方式比静态培养促进了细胞的增殖。
文档编号C12N13/00GK101402952SQ20071030388
公开日2009年4月8日 申请日期2007年12月26日 优先权日2007年12月26日 公开号200710303886.发明者张春秋, 樊瑜波 申请人:北京航空航天大学