专利名称：多羟基链烷酸的制备方法
多羟基链垸酸的制备方法
相关申请本发明一般涉及多羟基链垸酸的制备，特别涉及由杀菌且 不能被用作生长或者PHA制备用碳源的底物，微生物制备多羟基链烷 酸酯(PHA)。
背景技术：
挥发性有机化合物(VOC)是这样的化合物，其在标准 大气压和温度下形成气态蒸气并参加光化学反应以形成氧化的光化学 物。VOC严重地促成对流层污染物比如臭氧和烟雾的形成，并且人类 暴露于空中挥发性有机化合物己知引起各种不利的健康影响，其包括 肝脏损伤、脑损伤以及癌症。在美国，VOC被认为代表土壤、空气和 地下水污染物的最重要种类之一。VOC通过许多工业处理排放，包括 涂料制造、化学合成以及废水氯化。VOC——如文中所用，在一些实 施方式中不包括甲垸——不能被氧化成无毒化合物或者被大多数天然 产生的微生物用作生长底物，并且因此作为高度顽固的污染物持久存 留在环境中。
发明内容
在申请人的发明之前，申请人不知道使用VOC产生PHA 的任何方法，并且，特别地，不知道通过使用不能使用VOC作为生长 或者PHA制备用碳源的微生物来使用VOC以产生PHA的任何方法。 考虑到使用包含在VOC内的碳制备PHA的经济和环境优势，对于使 用VOC作为可行碳底物制备PHA的方法存在显著需求，特别是在VOC 是杀菌的并且不能被用作生长和/或PHA制备用碳源的系统中。此外， 对于同时使用两种或者多种VOC制备PHA的方法存在显著需求。甲垸-氧化微生物或者好氧性甲垸氧化微生物 (methantrophic microorganism)由于它们使用甲烷作为它们唯一的碳源 用于生长的能力被熟知。为了催化甲烷的氧化和随后的代谢，好氧性 甲烷氧化微生物典型地使用称作甲烷单加氧酶(MMO)的酶，其以粒 状或者可溶性形式(分别为pMMO或者sMMO)在细胞内产生。虽然 sMMO能够比pMMO催化氧化更多的非甲烷挥发性有机化合物，但 pMMO也能够催化氧化许多挥发性有机化合物。好氧性甲垸氧化微生 物不能使用挥发性有机化合物作为碳或者能量的来源，并且因此被好 氧性甲垸氧化微生物氧化的挥发性有机化合物通过使好氧性甲烷氧化 微生物继续生存所必需的MMO分子临时地或者永久地丧失能力而造 成生长抑制作用。在申请人的发明之前，申请人不知道在控制的生物系统中 ——其中VOC不能被用作生长或PHA制备用碳源——使用VOC制备 PHA的任何方法，并且申请人不知道使用好氧性甲烷氧化微生物以使 毒性挥发性有机化合物内的碳结合进入PHA的任何方法。因此，VOC 仍是环境退化和废弃碳的重要来源。
0017本发明的几个实施方式涉及通过使用杀菌的VOC作为碳 源制备PHA的新方法。在另一种实施方式中，VOC通过展现杀菌活性或者抑菌 活性，比如减缓或者停止繁殖的能力、破坏或者杀死的能力，或者妨 碍或者阻止微生物生长的能力，来抑制甲烷-氧化微生物的生长。在一种实施方式中，甲烷-氧化微生物包括能够氧化VOC 的天然产生的微生物或者基因工程微生物。在另一种实施方式中，操纵生长-培养基以导致或者允许 PHA-合成微生物制备PHA物质的步骤包括耗尽必需的生长养分。在又一种实施方式中，操纵生长-培养基以导致或者允许 PHA-合成微生物制备PHA物质的步骤包括降低以下化合物的浓度，该 化合物选自铁、氧、氮、镁、钾、磷酸盐、磷或者铜。在一种实施方式中，所产生的PHA物质的质量是用于制 备PHA物质的PHA-合成微生物的质量的大约5-80%。在一些实施方 式中，所产生的PHA物质的质量是PHA-合成微生物的质量的大约 20-60%、 30-50%或者大约40%。在一种实施方式中，所产生的PHA 物质的质量大于用于制备PHA物质的PHA-合成微生物的质量的50M。在一种实施方式中，本发明包括改变生长培养基内铜的浓 度，因此改变甲烷单加氧酶的底物特异性。在一些实施方式中，底物 特异性通过使甲烷-氧化微生物产生粒状或者可溶的甲垸单加氧酶而改 变。在一种实施方式中，本发明包括提高甲烷-氧化微生物对铜的利用 率，因此导致甲垸-氧化微生物产生粒状甲垸单加氧酶。在可选实施方 式中，本发明包括降低甲烷-氧化微生物对铜的利用率，因此导致甲烷-氧化微生物产生可溶性甲烷单加氧酶。在本发明的一个实施方式中，提供由VOC制备PHA的方 法。在一种实施方式中，该方法包括使包括甲垸单加氧酶的好氧性甲 烷氧化微生物与VOC结合，其中该好氧性甲垸氧化微生物使用甲烷单 加氧酶代谢VOC以制备代谢VOC。该方法进一步包括使代谢VOC与 PHA-生成微生物结合，其中该PHA-生成微生物使用代谢VOC中至少 一个碳分子以制备PHA。在一种实施方式中，该方法包括通过降低来 自包括PHA-生成微生物的生长培养基的至少一种养分的利用率诱导 PHA-生成微生物以制备PHA。在一种实施方式中，提供制备PHA的系统，其中该系统 包括好氧性甲烷氧化微生物或者工程MMO、 PHA-生成微生物以及一 种或者多种生长培养基。该系统任选地可以包括一个或者多个生物反 应器。在一种实施方式中，本发明包括文中所述任何系统或者 方法制备的PHA。在另一种实施方式中，本发明包括PHA，其中该PHA 包括来自氧化的非甲垸VOC的碳，并且其中该氧化的非甲垸VOC是 甲烷氧化微生物的氧化产物。在一种实施方式中，PHA中至少一个碳 分子是相同的、基本相同的或者衍生自非甲烷VOC中碳分子和非甲垸voc氧化形式。在本发明的又一实施方式中，提供包括来自非甲垸 VOC的碳分子的PHA物质。在一种实施方式中，使用甲烷-氧化微生物和PHA-生成微 生物。在另一种实施方式中，使用酶代替甲烷-氧化微生物。在又一种 实施方式中，使用酶代替PHA-生成微生物。在另一种实施方式中，除 了甲烷-氧化微生物和/或PHA-生成微生物之外，还使用合成的、工程 的或者分离的酶或催化剂(或者结构性或者功能性等同物)。在进一 步的实施方式中，该系统基本没有甲垸-氧化微生物和PHA-生成微生 物，并且根据文中所述的任何实施方式的方法通过合成的、工程的或 者分离的酶或者催化剂(或者结构性或者功能性等同物)进行。根据文中所述的任何实施方式，VOC可以包括以下一种 或者多种氯乙烯、苯、丁垸、三氯乙烯、甲苯、乙苯、二氯甲垸、 三氯甲垸、乙垸、1-2-二氯乙垸、l，l-二氯乙烯、氯二氟甲垸、二甲苯 以及其他挥发性有机化合物。在一种实施方式中，VOC是甲垸VOC。
0043根据文中所述的任何实施方式，甲垸-氧化微生物包括， 但不限于，芽孢杆菌(Ba"7/w)、分支杆菌(M少co6acterz'w附)、放 线菌"W"o哼c&s)、诺卡菌(A^ocaWa)、假单胞菌(尸se^fomowos)、 甲烷单胞菌(MeAawomowas)、 精脘杆菌(iVoto脂'"o6acfer)、甲基 5求菌(Afe/Z^/ococcws )、节杆菌(爿W/^o6"cter )、失旦杆菌(5reWZ acZerZwm )、 醋酸杆菌"c"o6ac敏)、甲基单胞菌(Me^y/omo"os)、醋酸杆菌 ()、微球菌 (M/crococ面)、红假单胞菌 (i /2octo;wewdo附owas1)、棒状杆菌(Cb7^77e6a"er/wm)、会工假单胞菌 (i /20cto/wewcfomowas )、 微杆菌 (M/'cro6acfen'wm )、 无色菌 (^c/2ramo6a"er )、 甲基杆菌(^Me^y/o6ac&r )、 甲基弯曲菌 (A/^/z;z/o57'"ws)以及甲基孢囊菌(Afe^y/oc;^/s
甲烷VOC——其可以
在在一些实施方式中使用——将包括包含甲烷化学基团的voc。在一些实施方式中，本发明包括将另外的碳源加入生长培 养基以影响微生物的代谢，比如己知引起一些微生物改变PHA分子的 分子结构的化学物质，如戊酸。
0083]在其他实施方式中，本发明包括使用包含在工业气体比如 垃圾气体、天然气、农业沼气、农业排放气体和/或污水处理气体中的 VOC作为PHA制备用碳源。因此，读者将明白，本发明通过提供挥发性有机化合物作 为PHA制备用碳源的新用途的方法，提供以下方法i)将生长-限制底 物转化成有用的PHA制备用碳源，ii)将环境毒素转化成无毒的和有 用的物品，iii)从此前废弃的和环境破坏性工业副产物产生生物可降解 热塑性形式的环境友好物品，iv)使用以前被认为是无用的材料进行 PHA制备，v)降低PHA制备的成本同时改进环境，以及vi)相对于 石化基塑料提高PHA塑料的经济可行性。
[0087下面的实施例描述本发明的一个非限制性实施方式。
实施例l
[00881在根据本发明的一个实施方式执行过程的方法的一个实 施方式中，如
图1中所示，生物反应器1部分充有液态矿物质水生长 培养基2，其包括，每升水，0.7-1.5g KH2P04、 0.7-1.5gK2HP04、 0.7-1.5gKNO3、 0.7-1.5gNaCl、 0.1-0.3 g MgS04、 24-28mgCaCl2*2H20、 5.0-5.4mgEDTA Na(H20)2 、 1.3画1.7mg FeCl2*4H20 、 0.10國0.14mg CoCl2*6H20 、 0.08-1.12mg MnCl2*2H20 、 0.06-0.08mg ZnCl2 、0.05-0.07mg H3B03 、 0.023画0.027mg NiCl2*6H20 、 0.023-0.027mg NaMo04*2H20、以及0.011-0.019 mg CuCl2*2H20。接下来，包括50% 甲烷和50%氧(按体积计)的空气3被注入到生物反应器l的液体部 分。接下来，MMO微生物4被引入到生物反应器1中并通过使用空 气3中的甲烷作为生长用碳源使其繁殖。然后挥发性有机化合物5被 注入到生物反应器1中，由此生物反应器1中的MMO微生物4使用 甲烷单加氧酶将化合物5催化氧化成一种或者多种MMO-氧化形式的 化合物5，其随后被转移进入培养基2中。接下来，PHA微生物6，即 能够使用MMO-氧化形式的化合物5作为生长和PHA合成用碳源的微 生物被引入到生物反应器1中，由此MMO-氧化形式的化合物5被 PHA微生物6用作细胞生长用碳源。生物反应器1中PHA微生物6 的浓度到达期望浓度后，导致培养基2中至少一种必需的生长养分比 如铁、氧、氮、镁、钾或者磷酸盐基本耗尽而使所有其他条件基本保 持不变，由此引起PHA微生物6将包含在MMO-氧化形式化合物5 中的碳转化成PHA。
[0089虽然根据本发明进行过程的方法的上面描述包含许多特征，但 这些不应被解释为限制本发明的范围。如所述，存在许多方法以进行 根据本发明的方法。因此，本发明的范围应当不由所述的优选方法确 定，而由所附权利要求和它们的法定等同物确定。
权利要求
1.一种由一种或者多种代谢毒性的和生长-抑制性的挥发性有机化合物(VOC)制备多羟基链烷酸酯(PHA)的方法，包括提供一种或者多种非甲烷VOC；提供一种或者多种甲烷-氧化微生物，其能够氧化所述一种或者多种VOC以制备氧化的化合物；其中所述一种或者多种甲烷-氧化微生物不使用所述一种或者多种VOC作为碳源或者能量源，以及其中所述一种或者多种VOC抑制所述一种或者多种甲烷-氧化微生物的生长，并且因此是代谢毒性的；提供一种或者多种PHA-合成微生物，其能够将包含在所述氧化的化合物中的碳结合进入PHA物质；提供生长-培养基，其调节所述一种或者多种甲烷-氧化微生物和所述一种或者多种PHA-合成微生物的代谢；相互暴露所述一种或者多种VOC、所述一种或者多种甲烷-氧化微生物以及所述生长-培养基，因此引起或者允许所述一种或者多种甲烷-氧化微生物将所述一种或者多种VOC转化成所述氧化的化合物；使所述氧化的化合物与所述PHA-合成微生物接触；以及操纵所述生长-培养基以引起或者允许所述一种或者多种PHA-合成微生物使用包含在所述氧化的化合物中的所述碳，用于制备所述PHA物质，由此使用代谢毒性的、生长-抑制的VOC制备所述PHA物质。
2. 根据权利要求1的方法，进一步包括在将所述一种或者多种甲 垸-氧化微生物暴露于所述VOC之前将所述一种或者多种甲垸-氧化微 生物暴露于甲垸以促进所述甲烷-氧化微生物的生长。
3. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中所述一种或者多种 VOC从一种或者多种以下来源获得垃圾场、污水处理系统、煤矿、 天然气系统、农业废弃物处理系统以及反刍动物操作。
4. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中所述一种或者多种VOC选自一种或者多种以下化合物氯乙烯、苯、丁烷、三氯乙烯、甲苯、乙苯、二氯甲烷、三氯甲烷、乙烷、1，2-二氯乙烷、l，l-二氯乙 烯、氯代二氟甲烷以及二甲苯。
5. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中所述一种或者多种 VOC通过暂时或者永久使酶——其包括代谢甲烷所需的甲烷单加氧酶 ——失活抑制甲烷-氧化微生物的生长。
6. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中所述一种或者多种 VOC通过展现杀菌或者抑菌活性抑制甲烷-氧化微生物的生长。
7. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中所述一种或者多种甲 烷-氧化微生物包括能够氧化所述一种或者多种VOC的天然产生微生 物或者基因工程微生物。
8. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中所述一种或者多种甲 烷-氧化微生物使用甲垸单加氧酶氧化所述一种或者多种VOC。
9. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中所述一种或者多种甲 烷-氧化微生物选自下列属的一种或者多种芽孢杆菌、分支杆菌、放 线菌、诺卡氏菌、假单胞菌、甲垸单胞菌、精脘杆菌、甲基球菌、节 杆菌、甲基单胞菌、短杆菌、醋酸杆菌、甲基单胞菌、短杆菌、醋酸 杆菌、微球菌、红假单胞菌、棒状杆菌、红假单胞菌、微杆菌、无色 菌、甲基细菌、甲基弯曲菌以及甲基孢囊菌。
10. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中所述一种或者多 种PHA-合成微生物包括能够使用来自所述氧化的化合物的碳制备所 述PHA物质的天然产生的微生物或者基因工程的微生物。
11. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中所述一种或者多种PHA-合成微生物选自在一种或者多种下列属中发现的微生物:产碱 杆菌、嗜酸菌、固氮菌、芽孢杆菌、芽胞短杆菌、假单胞菌、青枯菌、 根瘤菌和/或红细菌。
12. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中所述生长-培养基 包括一种或者多种以下化合物钾、磷、氮、镁、硫酸盐、铁、钴、 铜、溶解的氧、溶解的甲垸、溶解的VOC、锌、钠、镍、锰、硼、水、 微生物以及有机代谢物。
13. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中操纵所述生长-培 养基以引起或者允许所述一种或者多种PHA-合成微生物制备所述 PHA物质包括耗尽一种必需的生长养分。
14. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中操纵所述生长-培 养基以引起或者允许所述一种或者多种PHA-合成微生物制备所述 PHA物质包括降低一种或者多种选自以下的化合物的浓度铁、氧、 氮、镁、钾或者磷酸盐。
15. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中所述PHA物质包 括源自所述氧化的化合物的至少一种碳分子，其中所述氧化的化合物 是所述一种或者多种VOC的氧化形式。
16. 根据任何一项在前权利要求的方法，进一步包括收获所述 PHA物质。
17. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中产生的PHA物质 的质量是用于产生所述PHA物质的PHA-合成微生物的质量的大约 5-80%。
18. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中产生的PHA物质 的质量大于用于产生所述PHA物质的PHA-合成微生物的的质量的 50%。
19. 根据任何一项在前权利要求的方法，进一步包括改变所述 生长培养基内一种或者多种化合物的浓度以改变甲垸单加氧酶的底物 特异性。
20. 根据任何一项在前权利要求的方法，其中所述一种或者多 种化合物包括铜或者铁。
21. 根据任何一项在前权利要求的方法，进一步包括提高所述 甲烷-氧化微生物对铜的利用率，由此导致所述甲烷-氧化微生物产生粒 状甲烷单加氧酶。
22. 根据任何一项在前权利要求的方法，进一步包括降低所述 甲垸-氧化微生物对铜的利用率，由此导致所述甲垸-氧化微生物产生可 溶性甲烷单加氧酶。
23. 根据任何一项在前权利要求的方法，进一步包括改变铜浓 度以导致大多数所述甲垸-氧化微生物产生粒状甲垸单加氧酶，由此使 可以被所述甲烷-氧化微 生物氧化的所述一种或者多种VOC的范围变窄。
24. 根据任何一项在前权利要求的方法，进一步包括改变铜浓 度以导致大多数所述甲垸-氧化微生物产生可溶性甲垸单加氧酶，由此 扩大可以被所述甲烷-氧化微生物氧化的所述一种或者多种VOC的范 围。
25. 根据任何一项在前权利要求的方法制备的多羟基链垸酸酯 (PHA)，其中所述PHA包括来自氧化的非甲烷挥发性有机化合物(VOC)的碳，并且其中所述氧化的voc是甲烷氧化微生物的氧化产物。
26. —种由挥发性有机化合物(VOC)制备多羟基链烷酸酯 (PHA)的方法，包括结合包含甲垸单加氧酶的好氧性甲垸氧化微生物和非甲烷VOC， 其中所述好氧性甲烷氧化微生物使用所述甲垸单加氧酶代谢所述 VOC以产生代谢的VOC;以及结合所述代谢的VOC和PHA-生成微生物，其中所述PHA-生成微生物使用所述代谢的VOC中至少一种碳分 子以制备PHA。
27. 根据权利要求26的方法，进一步包括通过降低包括所述 PHA-生成微生物的生长培养基的至少一种养分的利用率诱导所述 PHA-生成微生物以制备PHA。
28. 用于从挥发性有机化合物(VOC)制备多羟基链烷酸酯 (PHA)的试剂盒，其包括好氧性甲垸氧化微生物； PHA-生成微生物；第一生长培养基；第二生长培养基，其中所述第二生长培养基缺乏一种或者多种选 自下面的化合物铁、氧、氮、镁、钾或者磷酸盐，以及，使所述好氧性甲垸氧化微生物与所述VOC接触以产生氧化的 VOC的说明，其中在引入所述第二生长培养基之后所述氧化的VOC 随后被用作碳源用于所述PHA-生成微生物产生PHA。
29. —种由挥发性有机化合物(VOC)制备多羟基链烷酸酯 (PHA)的方法，包括结合甲垸氧化酶与非甲垸VOC，其中所述甲烷氧化酶氧化所述VOC以产生氧化的VOC，以及使所述氧化的VOC与PHA酶结合，其中所述PHA酶使用所述氧化的VOC中至少一种碳分子以制备 PHA。
30. 根据权利要求29的方法，其中所述甲烷氧化酶包括由任何 甲垸-氧化微生物制备的任何酶，所述甲垸-氧化微生物具有氧化——全 部或者部分地——所述甲垸和所述一种或者多种VOC的能力。
31. 根据权利要求29的方法，其中所述PHA酶源自PHA-生成 微生物或者是PHA-生成微生物的部分。
32. 根据权利要求29的方法，其中所述甲烷氧化酶包括甲烷单 加氧酶。
33. 多羟基链垸酸酯(PHA)，其包括 来自氧化的非甲垸挥发性有机化合物(VOC)的碳， 其中所述氧化的VOC包括甲烷氧化微生物的氧化产物，并且 其中所述碳源自预-氧化的VOC中的碳分子。
全文摘要
本发明的实施方式涉及由不能用作微生物生长或PHA合成用碳源和/或能量源并且具有微生物和环境毒性的底物，微生物制备多羟基链烷酸或多羟基链烷酸酯(PHA)。根据本发明的一种实施方式，提供制备PHA的方法，其中通过使用不能使用挥发性有机化合物作为生长或者PHA制备用碳源的微生物，酶比如甲烷单加氧酶被用于将挥发性有机化合物转化成PHA。
文档编号C12P7/02GK101646778SQ200780052515
公开日2010年2月10日 申请日期2007年2月21日 优先权日2007年2月20日
发明者K·金麦尔, M·D·赫里玛 申请人:纽莱特科技公司