专利名称：一种禽传染性支气管炎病毒M基因与禽IL-2基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL2的制作方法
一种禽传染性支气管炎病毒M基因与禽IL-2基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL2[技术领域]本发明涉及动物医药生物工程领域，是一种禽传染性支气管炎病毒M基因与禽 IL-2基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL2 。[背景技术]禽传染性支气管炎(Avian Infectious Bronchitis, IB)是冠状病毒科冠状病 毒属的禽传染性支气管炎病毒引起鸡的一种急性、高度接触性的传染病，其特征为病鸡出现 呼吸道症状、产蛋数量和品质下降以及肾脏病变等。禽传染性支气管炎病毒可感染所有曰龄 的鸡，导致生长迟缓、死亡、增重和饲料报酬降低；还常常引起霉形体混合感染以及大肠杆 菌病等继发感染而提高鸡群的死亡率，给养鸡生产带来巨大损失。目前，该病呈世界广泛流 行，是严重危害世界养禽业的重大传染病之一。禽传染性支气管炎病毒是冠状病毒科冠状病毒属的代表种，其抗原性异常复杂，目前世 界上分离的临床毒株已超过100多株，分属30种以上血清型。禽传染性支气管炎病毒属于单 股正链的RNA病毒，基因组全长27.6kb,主要编码三种结构蛋白纤突蛋白(S)、膜蛋白(M)、 核蛋白(N)。许多研究表明，S蛋白裂解为S1和S2两个亚单位，其中S1蛋白可诱导产生中 和抗体和血凝抑制抗体，为IBV的主要免疫原。N蛋白携带着T细胞表位，在免疫和保护上可 能发挥作用。M蛋白的免疫原性较低，也有报道M蛋白上可能存在着具有重要免疫作用的抗 原决定簇，能诱导细胞介导的免疫反应(参见殷震，刘景华等.动物病毒学(第二版).北 京科学出版社，1997)。禽传染性支气管炎病毒不同毒株在毒力、致病性和组织嗜性上存在着很大差异，不同血 清型毒株之间交叉保护力弱。在防制上，常规单一毒株疫苗常有免疫失败的报道，多价疫苗 可较好解决防治问题。灭活疫苗安全性好，不存在散播病原和毒力返3虽的问题，且能激发良 好的体液免疫反应。其不足之处是使用剂量大，需要配合佐剂，制备比较复杂，因而成本较 高。加之灭活疫苗不能诱发机体产生细胞免疫，而一系列的研究证实在IBV的免疫保护中，体液免疫和细胞免疫占有重要地位(参见王红宁主编.禽呼吸系统疾病.北京农业科技出版社，2002; BW卡尔尼克主编.禽病学(第九版).北京北京农业大学出版社，1991， 407-418; KustersJG， Niesters， H G M， et al. Virology, 1989， 169:217-221; Avellaneda G E， Villeges P, Jackwood M W' et al. Avian Dis, 1994， 38: 589-597)。随着禽传染性 支气管炎病毒流行病学调査、分子生物学研究、免疫机制等研究的逐步深入，构建该病毒的 主要结构蛋白基因的真核表达载体，研制DNA疫苗用于该病预防具有重要意义。近年来许多研究者试图研究禽传染性支气管炎病毒的DNA疫苗，并取得了一定的进展。 步志高等(参见步志高，江国托等.中国兽医学报，1998， 18 (6): 527-530)以国内类M41 地方流行株IBV纤突糖蛋白S1基因为免疫原基因，构建了DNA真核表达质粒，并对其免疫原 性进行了初步分析。结果表明该表达质粒可同时诱导机体形成针对IBV的细胞免疫和体液免 疫反应。陈洪岩等(参见陈洪岩，江国托，杨奇伟等.中国预防兽医学报，1999， 21 (4): 250-253)将鸡传染性支气管炎病毒肾型T株Sl基因cDNA连接于pcDNA3构建了真核表达质 粒，经肌肉注射免疫SPF鸡后血清IgG抗体逐渐升高，至35日龄左右达到高峰，但血清IgG 抗体升高幅度不及IB油苗。免疫攻毒后有40%的鸡可耐过强毒的攻击。刘思国等(参见刘 思国，康丽鹃，江国托等.中国兽医学报，2001， 21 (1): 14-16)将鸡传染性支气管炎HB 株的N基因亚克隆到pcDNA3，构建了真核表达质粒pcDNA-N。用该质粒两次免疫SPF雏鸡一 周后进行攻毒试验，结果保护率为40%，表明N蛋白介导的细胞免疫在抗感染中发挥了作用。 Kapczymki DR等(K邻czynski DR， HiltDA， Shapiro D, et al. Avian Dis, 2003, 47:272-285) 将构建的表达S1蛋白的DNA疫苗通过胚内接种或肌注，结果显示，18日龄的鸡胚先用此疫 苗免疫，在雏鸡孵出2周后再用弱毒苗加强免疫，可使鸡得到100%保护，而单用DNA疫苗 胚内接种或弱毒苗肌注雏鸡，保护率都小于80%。刘兆球等(刘兆球，姜世金，常维山等.中 国兽医学报，2005, 25(3) : 241-243)用IBV Sl基因构建了真核表达载体pcDNA—Sl，研究表明 构建的DNA疫苗能诱导鸡体产生特异性的免疫应答，抵抗强毒感染。DNA疫苗预防传染性支 气管炎的研究发现，单一抗原的DNA疫苗具有一定的免疫效果，但存在免疫原性差、诱导机 体产生的免疫保护率低等缺点。因此，如何提高机体免疫应答效率，增强DNA疫苗的免疫效 果成为当前疫苗研究的关键问题。随着对细胞因子研究的不断深入，许多细胞因子被发现具有明显的分子佐剂效应，能特 异性增强抗原的免疫原性或增强机体对抗原的免疫反应性，而且细胞因子的网络化作用能优 化宿主的特异性免疫反应，诱导机体产生有效的免疫保护力。细胞因子佐剂中IL-2应用最为 广泛，它可作用于多种效应细胞，包括T、 B淋巴细胞、巨噬细胞和NK细胞，能同时加强细 胞免疫和体液免疫。Henke等构建了表达甲型流感病毒基因与IL-2基因的共表达载体，免疫 小鼠后能够有效地阻止流感病毒的感染 (Henke A, Rohland N， et al. Interviology, 2006， 49:249-252)。 Barouch等比较了单独表达IL-2的质粒与HIV gpl20 DNA疫苗和表达IL-2/Ig融合蛋白的质粒对小鼠免疫效果，结果发现只有融合蛋白才能显著 增强特异性抗体产生和T细胞增殖，而单独表达IL-2的质粒无效果(Barouch DH， Santra S， et al. Immunol, 1998, 161:1875-1882)。研究发现，与DNA疫苗注射相关的编码细胞因子的质粒， 它的注射时间很重要。当编码GM-CSF质粒在DNA疫苗注射前3d或同时注射，且必须在同一位点注射，方能诱导最强的CTL应答。但如果将分别构建的DNA疫苗与GM-CSF编码质粒混合 注射，将会对基因免疫有干扰作用(Kamath AT， Hanke T， et al. I画uology, 1999， 96:511 ;洪小 武，窦骏等，实用肿瘤杂志，2003, 18: 154)。 Barouch等构建了 HIV gpl20与GM-CSF以双 顺反子形式的共表达质粒，仅用Wg双顺反子质粒PVlJ-gpl20/GM-CSF就能诱导产生与IOO化 仅表达外壳蛋白质粒相当的抗体滴度、TH细胞应答及T细胞增殖(BarouchDH，SantraS， et al. Immunology, 2002， 168:562-568)。 Wang等构建了 WHV抗原基因与IFN- Y共表达的核酸疫 苗质粒，免疫动物后，能够有效地干扰病毒的复制(Wang J， Gu jar SA， et al. J Virol,2007, 81:903-916)。[发明内容]本发明将pIBVM、 pIRES-EGFP/DsRed质粒用Nhel和XhoI双酶切后，胶回收M 基因和载体片段进行连接，构建真核表达质粒pIRES-M/DsRed。以pDNAIL-2质粒为模板，PCR 获取禽源IL-2基因。将IL-2、 pIRES-M/DsRed质粒用BamHI和Notl双酶切后，胶回收IL-2 基因和载体片段进行连接，构建了一种禽传染性支气管病毒中国分离株SAIBk株M基因与禽 IL-2基因共表达DNA疫苗。该疫苗可用于预防禽传染性支气管炎。 [具体实施方式1. 本发明所使用的真核表达质粒pIBVM、 pDNAIL-2和真核表达载体pIRES-EGFP/DsRed由本 实验室构建并提供；宿主大肠杆菌JM109由本实验室保存；禽传染性支气管炎病毒攻毒用毒 株SAIBk株由实验室鉴定并保存。2. 引物的设计及合成是根据国内外己在GenBank中登录的鸡白细胞介素2基因序列经多重比 较后设计。根据真核表达载体pIRES-EGFP/DsRed上的酶切位点，上游引物设计在起始密码子 处，并加上BamHI酶切位点；下游引物设计在基因末端，并加上NotI酶切位点。引物序列为上游引物5'-CCAGGATCCACCATGATGTGCAAAG - 3';下游 引物5'-GAAGCGGCCGCAGATTAGTTAGC -3'。3. 真核表达质粒pIRES-M/DsRed的构建，将pIBVM用Nhel和XhoI进行双酶切处理，胶回收O. 7kb 的条带，以同样的方法对pIRES-EGFP/DsRed质粒进行双酶切处理，胶回收5. 3kb左右DNA片段。分别取5 u L双酶切后胶回收的M基因片段，加入10xT4 DNA Ligase buffer 1 u L， T4DNA 连接酶1 u L，酶切处理载体pIRES-EGFP/DsRed 1 y L， ddH20 2 y L， 16。C连接18小时。将连 接产物转化JM109感受态细胞，在含有卡那霉素的LB平板上37。C培养。4. 真核表达质粒pIRES-M/DsRed的鉴定，在含有卡那霉素的LB平板上挑取单个菌落，抽提质粒 DNA进行双酶切鉴定。将pIRES-M/DsRed真核表达质粒用Nhel和XhoI进行双酶切，酶切产物在 0. 8%琼脂糖凝胶电泳观察，pIRES-M/DsRed双酶切后产生约0. 7kb和5. 3kb的两条条带，证明M 基因已经替换了pIRES-EGFP/DsRed质粒中的绿色荧光基因(EGFP)。5. 共表达质粒pIRES-M/IL2的构建，以pDNAIL-2质粒为模板，PCR获取禽源IL-2基因，将IL-2 基因的PCR产物用酚氯仿抽提纯化，乙醇沉淀，干燥后用TE溶解。IL-2基因的PCR纯化产物用 BamHI和NotI进行双酶切处理，胶回收O. 5kb的条带。以同样的方法对pIRES-M/DsRed质粒进行 酶切处理，胶回收5.3kb左右的条带。分别取5 ix L双酶切后胶回收的IL-2基因片段，加入10xT4 DNA Ligase buffer 1 u L， T4DNA 连接酶luL，酶切处理载体pIRES-M/DsRed 1 u L， ddH20 2uL， 16。C连接18小时。将连接产 物转化JM109感受态细胞，在含有卡那霉素的LB平板上37。C培养。6. 共表达质粒pIRES-M/IL2的鉴定，在含有卡那霉素的LB平板上挑取单个菌落，抽提质粒DNA 进行双酶切鉴定。将pIRES-M/IL2真核表达质粒用BamHI和Notl进行双酶切，酶切产物在O. 8% 琼脂糖凝胶电泳观察，pIRES-M/IL2双酶切后产生约0. 5kb和5. 3kb两条条带，证明己经成功构 建了真核表达质粒pIRES-M/IL2 。7. —种禽传染性支气管炎病毒M基因与禽IL-2基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL2的研制。 从LB固体培养基中挑取单菌落，接种于盛有10ml液体培养基的三角瓶中，37'C震荡过夜培 养。在1000ml的三角瓶中加入100ml的发酵培养基，接入5ml的菌种，37°C， 200rpm / min， 培养20h.。用常规提取质粒的碱裂解方法进行质粒的大量抽提，用硅藻土吸附方法进行纯化。 电泳鉴定质粒的纯度和含量。质粒用PBS缓冲液稀释到lmg/ml，即为一种禽传染性支气管炎 病毒M基因与禽IL-2基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL2。该DNA疫苗用肌肉注射的方法进行 预防接种。
权利要求
1.一种禽传染性支气管炎病毒M基因与禽IL-2基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL2，其特征在于用分子生物学方法将禽传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBk株M基因和禽IL-2基因插入真核表达载体pIRES-EGFP/DsRed中，构建能表达M基因和禽IL-2基因共表达质粒，研制DNA疫苗pIRES-M/IL2，该DNA疫苗pIRES-M/IL2能用于预防禽传染性支气管炎。
2. 权利要求l所述的禽传染性支气管炎DNA疫苗pIRES-M/IL2，其特征在于用禽 传染性支气管炎病毒中国分离株SAIBk株M基因经NheI和XhoI双酶切，禽IL-2 基因经BamHI和NotI双酶切后，插入真核表达载体pIRES-EGFP/DsRed中，构 建真核表达质粒，研制DNA疫苗pIRES-M/IL2。
3. 权利要求2所述的一种禽传染性支气管炎病毒M基因与禽IL-2基因共表达DNA 疫苗pIRES-M/IL2用于预防禽传染性支气管炎。
全文摘要
本发明涉及动物医药生物工程研究领域，是一种禽传染性支气管炎病毒M基因与禽IL-2基因共表达DNA疫苗pIRES-M/IL2。本发明将pIBVM、pIRES-EGFP/DsRed质粒用NheI和XhoI双酶切后，胶回收M基因和载体片段进行连接，构建真核表达质粒pTRES-M/DsRed。以pDNAIL-2质粒为模板，PCR获取禽源IL-2基因。将IL-2、pIRES-M/DsRed质粒用BamHI和NotI双酶切后，胶回收IL-2基因和载体片段进行连接，构建了一种禽传染性支气管病毒中国分离株SAIBk株M基因与禽IL-2基因共表达DNA疫苗pTRES-M/IL2，该疫苗可用于预防禽传染性支气管炎。
文档编号C12N15/79GK101235385SQ20081004494
公开日2008年8月6日 申请日期2008年3月11日 优先权日2008年3月11日 公开号200810044943.9
发明者唐梦君, 夏青青, 毅 张, 曾瑜虹, 李玉玲, 王红宁, 泰 阳 申请人:四川大学