专利名称：：一株克雷伯氏菌及其在微氧发酵产氢中的用途的制作方法
技术领域：
：本发明属于微生物发酵
技术领域：
，具体涉及一种克雷伯氏菌HPB及其在微氧条件下以甘露醇为碳源的微生物制氢方法中的用途。
背景技术：
：氢气作为一种应用范围广，无污染，热值高的替代能源，已经在世界上引起高度重视。而生物制氢技术具有不产生二次污染，消耗能量少等优点，正越来越受到人们的青睐。生物制氢技术主要包括利用光合方法制氢和发酵方法制氢。但因光合微生物利用光能产氢的效率十分有限，使得单独利用光合微生物实现商业化产氢有很大的难度。而微生物发酵法产氢具有无需光照，产氢量稳定，速率高等优点，其应用前景显得更为广阔。目前，国内外有大量的文献报道了利用微生物厌氧发酵产氢的方法，如Yokio等利用耐酸菌-气肠杆菌(五"fera^c^^erage"^)BY-29厌氧条件下发酵葡萄糖产氢，王凯军等利用产气肠杆菌HU-101，以及任南琪等筛选利用哈工大产乙醇杆菌B49(￡Aa"o/oge"6acfen'wmB49)进行了大量的厌氧产氢实验，他们都是在完全厌氧条件下通过改变PH、温度，充入其他不同气体等培养方法使其具有最大产氢效率。另外还有很多微生物发酵产氢方面的专利，如中国专利CN1488758A03126345.3、CN1088185A92114477.1以及美国发明专利US5464539等，这些专利同样都无一例外的利用完全厌氧的方式发酵农业秸秆或者有机废水产氢，通过改变菌种或者发酵工艺流程提高产氢效率，也同样面临发酵效率的问题，且都还不能实现商业化产氢。因而还需要进一步筛选产氢效率更高、适应能力更强的新菌种，改进发酵条件比如利用部分有氧发酵的方法使一部分有机物完全降解，为生物产氢提供更多的能量和还原力，从而进一步提高产氢效率，并最终实现商业化生产。对大多数产氢细菌来说氧气是不利因子，过高的氧气浓度会严重影响氢酶以及固氮酶的生物活性，严重影响产氢，故利用一般的细菌在有氧条件下产氢并不能达到较好的效果。但是很明显，如果产氢微生物能首先进行有氧呼吸，产生更多的能量和还原力，进而在微氧或者厌氧条件下进行发酵产氢，会明显提高微生物的产氢能力，然而以氧气作为重要影响因子研究对产氢影响的文献并不多见，其中龙敏南等筛选的《/eZm'e^o;c声ocaHP1可以在一定氧气浓度下产氢，但是这株细菌以葡萄糖为碳源，只有在完全厌氧下才能获得最高产氢效率，随着氧气浓度的增加(0-10%)，产氢率从1.0molH2/mol葡萄糖下降到0.06molH2/mol葡萄糖。
发明内容本发明的目的是提供一株克雷伯氏菌(K/AwW/asp.),该菌能在微氧条件下发酵产氢。本发明另一目的是提供一种以微量利用氧气，以甘露醇为碳源的产氢的实用方法，解决在非严格厌氧条件下微生物发酵产氢的问题，提高底物利用率进而提高氢气产量。本发明提供的利用微量氧气产氢的微生物HPB是一株克雷伯氏菌a:/ezww/。sp.)，已于2008年i月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物保藏中心(简称CGMCC)，保藏号为CGMCCNo.2317。克雷伯氏菌HPB菌落大，乳白色，半透明，光滑湿润，粘液状，该菌株经形态、生理生化特征和16SrRNA基因序列同源性分析，鉴定为克雷伯氏菌(K/e6wW/asp.)。该菌的生理生化特征如表l。其16SrRNA基因序列己提交美国NCBI数据库注册(AccessionNo:EU368116)。表l克雷伯氏菌(K/e6wW/fl.w)HPB的生理生化特征<table>tableseeoriginaldocumentpage4</column></row><table>克雷伯氏菌(X7dwW/flsp.)16SrRNA基因序列GAGCTTGCTCTCGGGTGACGAGCGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGTGGGGGACCTTCGGGCCTCATGCCATCAGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGCACTTTCAGCGGGGAGGAAGGCGTTGAGGTTAATAACCTCCTCGATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTCTGTCAAGTCGGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTCGAAACTGGCAGGCTAGAGTCTTGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACAAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGATTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAATCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTAGCAGAGATGCTTTGGTGCCTTCGGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTTTGTTGCCAGCGGTTAGGCCGGGAACTCAAAGGAGACTGCCAGTGATAAACTGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGACCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGCATATACAAAGAGAAGCGACCTCGCGAGAGCAAGCGGACCTCATAAAGTATGTCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATC本发明中HPB菌的筛选过程所采用的分离和筛选方法为常规方法，该菌群系从本实验室所藏的活性污泥中经长期分离培养，在兼性厌氧条件下不断驯化所得，其详细步骤如下1、筛选过程中所使用的培养基为KH2P04200mg;K2HP04800mg;MgS04.7H20200mg;CaSO4100mg;Na2Mo042H2020mg;FeCl310mg;甘露醇20g;酵母浸汁500mg;蒸馏水1000ml，pH7.0;2、将20ml长安垃圾场垃圾渗滤液接种到100ml经12rC灭菌15分钟的如1中所述的培养基中进行好氧培养，培养温度为33士rc;3、经5-7天后，取步骤2所得培养物3ml转接到新鲜的培养基中按步骤2的方法继续培养；4、不断重复以上步，同时每次所得的培养物取25ul平板涂布观察是否有细菌长出，经多次筛选最终得到一株可以在平板培养基上生长良好的菌株o以上步骤中平板培养基成分为KH2PO4200mg;K2HP04800mg;MgS047H20200mg;CaSO4100mg;Na2Mo04.2H2020mg;FeCl310mg;甘露醇5g;琼脂粉20g;蒸馏水1000ml，pH7.0，12rC灭菌15分钟。5、在平板上挑取培养两天的生长良好的菌落，接种到步骤l所述培养基中培养48小时作为产氢菌种。本发明提供的微生物发酵制氢的方法如下将菌种尺/eZw'e〃asp.HPB，CGMCCNo:2317按体积比为1:100的接种量接入经灭菌的发酵培养基中，在温度30-36°C，pH6-8，以高纯氮气排尽氧气，然后再注入少量氧气使反应器中初始氧气浓度约2.72±0.30%，保持在微氧环境中进行发酵，发酵50h，即可获得大量氢气。上述反应可在温度30-36°C,pH值6-8之间变化，初始氧气浓度也可以在较大范围变化，这只是对发酵产氢的效率产生影响。本发明中产氢发酵所使用的培养基成分如下KH2PO4200mg;K2HP04800mg;MgS04.7H20200mg;CaS04100mg;Na2Mo(V2H2020mg;FeCl310mg;甘露醇2-10g或葡萄糖5g或蔗糖5g或淀粉5g;酵母浸汁500mg;蒸馏水1000ml。本发明具有以下优点(1)首次发现适量的氧气存在可以促进微生物发酵产氢；(2)本发明中的《/e6wW/asp.HPB，CGMCCNo:2317可以在有氧条件下良好生长，其最大特点是微氧条件下可以高效产氢，并具有较高的耐氧产氢能力，以甘露醇为碳源初始氧浓度为2.72±0.30%,最大产氢量达324mlH2/g甘露醇(约合2.37molH2/mol葡萄糖)，产氢效率提高2倍以上；在反应器中完全充满氧气的条件下，仍然可以有大约五分之一的产氢能力。(4)本发明中的细菌同时还可以利用葡萄糖、蔗糖、淀粉等其他碳水化合物作为碳源快速高效产氢。(5)本发明方法简单，易于工业化。具体实施方式下面结合实施例对本发明作进一步说明。实施例l:1、配制发酵产氢培养基，其成分如下KH2PO4200mg;K2HPO4800mg;MgS04.7H20200mg;CaSO4100mg;Na2Mo04*2H2O20mg;FeCl310mg;甘露醇5g;酵母浸汁500mg;蒸馏水1000ml;pH7.0;将培养好的菌种按体积比浓度为1%(v/v)的接种量接入经12rC灭菌15分钟的上述培养基中，发酵所用反应器总容积为315ml，装液量为100ml，即反应器装液量约为反应器总容积的1/3。2、在上述反应器中充纯氮气约5分钟以赶尽其中的空气，然后用注射器抽出约6ml气体，然后再注入约6ml纯氧以保证反应器中初始氧气浓度约2.72±0.30%;将步骤1中所述反应器连接上带刻度标记的排水集气装置。放于33士rC的培养箱中恒温静止培养，经过50小时左右，获得最大产氢量1620mlH2。3、收集气体，利用气相色谱仪TCD检测器测定氢气的含量，得到每克甘露醇最大产氢效率为324ml;利用气相色谱仪氢氧焰离子检测器(FID)测定发酵液中有机酸以及乙醇的含量，发现发酵液中的主要发酵产物为乙醇，其余为乙酸和丁酸，其中乙醇占总产物的89%左右(质量比)。实施例2:将发酵培养基初始pH用lmol/LHCl和lmol/LNaOH分别调到5.5、6、6.5、7、7.5、8，其余步骤与实施例1相同，产氢效率分别为167.33mlH2/g甘露醇、236.43mlH2/g甘露醇、287.59mlH2/g甘露醇、299.73mlH2/g甘露醇、286.24mlH2/g甘露醇、236.7mlH2/g甘露醇。实施例3:按实施例l所述培养基中甘露醇的量分别是2g、3g、4g、5g、6g、8g、10g,其余步骤同实施例1，其产氢效率分别是278.38mlH2/g甘露醇，287.13mlH2/g甘露醇，298.12mlH2/g甘露醇，312.15mlH2/g甘露醇，301.14mlH2/g甘露醇，263.11mlH2/g甘露醇，243.37mlH2/g甘露醇。实施例4:按实施例1所述方法，改变各发酵瓶中的初始氧气浓度使呈梯度分布，分别为0.63%、1.02%、1.4%、2.72%、3.55%、5.44%、10.4%、15.44%,其余步骤与实施例1相同，其产氢效率分别为194.2mlH2/g甘露醇、227.07mlH2/g甘露醇、250.12mlH2/g甘露醇、324.4ml&/甘露醇、238.1mlH2/g甘露醇、198.2mlH2/g甘露醇、194.8mlH2/g甘露醇、172.2mlH2/g甘露醇。实施例5:将实施例1中的步骤2改为直接充纯氧约5分钟，以保证反应器中氧气的浓度达到最大，其余步骤与实施例1步骤相同，最终发现，在高初始氧气浓度下(纯氧气)，仍然有一定产氢能力，约为最高产率的20%左右(60-70mlH2/g甘露醇)。实施例6:将实施例l所述培养基中的甘露醇分别改为葡萄糖、蔗糖、以及淀粉，质量不变，其余步骤与实施例1完全相同，最终产氢率分别为161.8-182.6mlH2/g葡萄糖、170.5-186.3mlH2/g蔗糖、135.6-146.5mlH2/g淀粉。SEQUENCELISTING〈110〉中国科学院成都生物研究所〈120>—株克雷伯氏菌及其在微氧发酵产氢中的用途〈130〉说明书〈140>200810045058.2〈141>2008-03-26〈160>1<170〉Patentlnversion3.3〈210>1〈211〉1272〈212〉DNA<213>microorganism〈400〉1gagcttgctctcgggtgacgagcggcggacgggtgagtaatgtctgggaaactgcctgat60ggagggggataactactggaaacggtagctaataccgcataacgtcgcaagaccaaagtg120ggggaccttcgggcctcatgccatcagatgtgcccagatgggattagctagtaggtgggg180taacggctcacctaggcgacgatccctagctggtctgagaggatgaccagccacactgga240actgsgacacggtccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgc織3tgggCg300caagcctgatgcagccatgccgcgtgtgtgaagaaggccttcgggttgtaaagcactttc360agcggggaggaaggcgttgaggtt33taacctcctcgattgacgttacccgcagaagaag420caccggctaactccgtgccagcagccgcggtaatacggagggtgcaagcgttaatcggaa480ttactgggcgtaaagcgcacgcaggcggtctgtcaagtcggatgtgaaatccccgggctc540aacctgggaactgcattcgaaactggcaggctagagtcttgtagaggggggtagaattcc600aggtgtagcggtg,tgcgtagagatctggaggaataccggtggcgaaggcggccccct660gg3caa3g3ctgacgctcaggtgcg咖gcgtggggagcaaacaggattagataccctgg720tagtccacgccgtaaacgatgtcgatttggaggttgtgcccttgaggcgtggcttccgga780gctaacgcgttaaatcgaccgcctggggagtacggccgcaaggttaaaactcaaatgaat840tgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgatgcaacgcgaagaacc■ttacctggtcttgacatccacagaacttagcagagatgctttggtgccttcgggaactgt960gagacaggtgctgcatggctgtcgtcagctcgtgttgtgaaatgttgggttaagtcccgc1020aacgagcgcaacccttatcctttgttgccagcggttaggccgggaactcaa鄉卿ctg1080ccagtgataa3Ctgg3gg33ggtggggatgacgtcaagtcatcatggcccttacgaccag1140ggctacacacgtgctacaatggcatatacaa卿gaagcgacctcgcgagagcaagcgga1200cctcataaagtatgtcgtagtccggattggagtctgcaactcgactccatg卿tcggaa1260tcgctagtaatc127权利要求1、一种克雷伯氏菌，其特征是拉丁文为Klebsiella.spHPB，保藏号为CGMCCNo.2317，菌落大，乳白色，半透明，光滑湿润，粘液状，培养该细菌的培养基成分为KH2PO4200mg，K2HPO4800mg，MgSO4·7H2O200mg，CaSO4100mg，Na2MoO4·2H2O20mg，FeCl310mg，甘露醇2-10g或葡萄糖5g或蔗糖5g或淀粉5g，酵母浸汁500mg，蒸馏水1000ml。2、权利要求l所述克雷伯氏菌在微氧发酵产氢中的用途，其方法如下将菌种.spHPBCGMCCNo:2317按体积比为1:100的接种量接入经121'C灭菌15分钟的发酵培养基中，在温度30-36'C，pH6-8，以高纯氮气排尽氧气，然后再注入氧气，使反应器中初始氧气浓度为2.72±0.30%，发酵50小时，即可获得氢气；发酵培养基的成分为KH2PO4200mg;K2HPO4800mg;MgS04'7H20200mg;CaS04100mg;Na2Mo04'2H2020mg;FeCl310mg;甘露醇2-10g或葡萄糖5g或蔗糖5g或淀粉5g;酵母浸汁500mg;蒸馏水1000ml。全文摘要本发明属于微生物发酵
技术领域：
，具体涉及一种克雷伯氏菌HPB及其在微氧条件下以甘露醇为碳源的微生物制氢方法中的用途。本发明所克雷伯氏菌Klebsiella.spHPB，保藏号为CGMCCNo.2317，菌落大，乳白色，半透明，光滑湿润，粘液状。用该菌种在微氧条件下发酵产氢，其方法如下将菌种接种到培养基中，在温度30-36℃，pH6-8，以高纯氮气排尽氧气，然后再注入氧气，发酵50小时，即可获得氢气。本发明解决了在非完全厌氧条件下高效产氢的问题，产氢效率高，成本低，易于工业化。文档编号C12R1/22GK101544955SQ200810045058公开日2009年9月30日申请日期2008年3月26日优先权日2008年3月26日发明者何晓红,李大平,王晓梅,勇陶申请人:中国科学院成都生物研究所