专利名称：一种利用细菌纤维素膜做载体固定化白腐真菌的方法
技术领域：
本发明属于应用微生物与细胞工程技术领域，涉及一种固定化载体制备的方法及利用此载体固定化细胞的方法。特别涉及一种利用细菌纤维素膜做载体固定化白腐真菌的方法。
背景技术：
白腐真菌(White rot fungi)是一类腐生的丝状真菌，由于其分泌的胞外木质素降解酶具有非特异性和无需底物诱导的独特性能，使得它对许多结构不同、高毒性、高分子难降解有机物具有广谱的降解能力，在造纸工业的生物制浆和纸浆生物漂白、水污染控制和土壤修复等方面具有重要的应用价值。
虽然白腐真菌被广泛地应用于降解各种环境污染物，但其在悬浮培养降解体系中，还存在诸多问题，如处理效率有待提高，酶系统稳定性差，抗逆性、抗毒性、抗高负荷能力差，对温度、pH和污染物浓度等运行参数要求较高，产泥量大，固液分离困难等。而大量国内外研究表明，将固定化细胞技术引入白腐真菌对环境污染物的降解过程能很好的克服以上问题。
固定化白腐真菌常用的方法有包埋法、吸附法等，常用的固定化载体有木屑、聚氨酯泡沫、活性炭、聚乙烯醇、海藻酸钙等。但上述载体在实际应用过程中还存在着一些问题，如制备过程较复杂、固定化效率低、对白腐真菌活性影响大、操作稳定性差、废弃后易对环境造成二次污染等。细菌纤维素膜是一种由微生物合成的超微纯纤维素薄膜，由毗喃葡萄糖单体以β-1，4糖苷键连接而成的直链多糖，相邻的毗喃葡萄糖的6个碳原子不在一个平面上，而是呈稳定的椅式立体结构，几个邻近的β-1，4葡聚糖链在分子内或分子间氢键的作用下形成不溶于水和有机溶剂的高分子聚合物。具有高的结晶度，超细纳米纤维网络，高的重合度，生物适应性强，可在自然界直接降解等独特的性质。目前有研究将细菌纤维素作为载体用于多种酶的固定化，其作为是一种新型纳米材料，已经成为国内外研究的热点。
发明内容
本发明的目的是通过对细菌纤维素膜进行改性处理，使其成为微生物固定化的优良载体，进而建立一种固定化白腐真菌的简单、有效的方法，固定化后的白腐真菌具有活性更加稳定，抗干扰能力更强，能够重复使用等特点。
上述目的是通过如下的技术方案来实现的 一种利用细菌纤维素膜做载体固定化白腐真菌的方法，是由如下的过程和步骤组成 一种利用细菌纤维素膜做载体固定化白腐真菌的方法，是由如下的过程和步骤组成 (1)白腐真菌White rot fungi的分离及孢子液的制备 A.白腐真菌的分离取腐木2g加入灭菌后的100mL液体培养基中，置于生化培养箱中30℃恒温培养，随时观察培养基中菌的生长状况；所述的液体培养基中各组分占液体培养基质量用量百分比分别为KH2PO4 0.02％，MgSO4·7H2O 0.005％，CaCl2 0.001％，葡萄糖1％，NH3Cl 0.02％，H2O2 0.05％，酒石酸钠0.028％，琥珀酸钠0.054％，马铃薯提取液为液体培养基体积的0.05％，其中马铃薯提取液为200g马铃薯在1L蒸馏水中煮沸30分钟后，用16层纱布过滤掉不溶物制得(以下同)，121℃灭菌30分钟；48小时后，取该培养液10mL重复进行富集培养，经3次富集培养后，取最终富集液在固定培养基平板上进行涂布培养；所述的固体培养基中各组分占固体培养基质量用量百分比分别为葡萄糖2％，KH2PO4 0.3％，MgSO4·7H2O 0.15％，维生素B1 0.0005％，琼脂1.2％，马铃薯提取液占固体培养基体积(指未加入琼脂前的体积，以下同)用量百分比为80％，121℃灭菌30分钟；24小时后，在平板上挑取白色绒形的菌种进行划线分离，待出现白色菌丝后，挑取单个菌落再划线分离，直至重复得到纯的单菌株，斜面保存，备用； B.白腐真菌孢子液的制备从上述步骤A.得到的白腐真菌保存斜面挑取少量菌丝，划线法接种于固体培养基上，所述的固体培养基的组成与步骤A中的固体培养基相同，30℃培养5天后，白腐真菌孢子大量扩增，用无菌水轻轻洗出平板表面上的分生孢子，并在无菌条件下用16层滤布滤除菌块，得到乳白色孢子悬浮液为白腐真菌孢子液，4℃冰箱保存备用； (2)细菌纤维素膜的制备 A.木醋杆菌Acetobacter xylinum的分离将醋醅稀释100倍后接种于50mL富集培养基中，富集培养基中各组分占富集培养基质量用量百分比分别为葡萄糖5％；酵母膏0.5％；乙酸钠0.2％；CaCO3 1％；用乙酸调节pH至5.0；121℃下灭菌30分钟后，加入占富集培养基体积用量百分比为2％的无水乙醇和质量用量百分比为0.5％的制霉菌素，再于28℃温度下培养5天，液面长有乳白色胶质菌膜者为阳性；揭去富集培养基表面的凝胶膜，将此膜仔细贴在第一块分离培养基平板上；所述的分离培养基中各组分占分离培养基质量用量百分比分别为葡萄糖5％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.5％；Na2HPO4·12H2O 0.2％；KH2PO4 0.1％；MgSO4·7H2O 0.025％；柠檬酸0.2％；琼脂2％；pH5.8；121℃灭菌30分钟；再取出贴在第二块平板，如此再重复6次；平板置于28℃培养48小时后挑取单个菌落接入斜面，再经连续三次划线分离得到灰白色纯菌种； B.细菌纤维素膜的产生将从步骤A的斜面挑取筛选到的木醋杆菌单菌落接种于50mL发酵培养基中，所述的发酵培养基中各组分用量占发酵培养基质量用量的百分比分别为葡萄糖5％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.5％；Na2HPO4·12H2O 0.2％；KH2PO4 0.1％；MgSO4·7H2O 0.025％；柠檬酸0.2％；pH5.8；于121℃灭菌30分钟，28℃静置培养5天后，在液面生成乳白色或淡黄色胶质菌膜；将膜取出，用蒸馏水反复冲洗，除去膜表面培养基及杂质；再将膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液，100℃煮沸20min，去除菌膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明；然后用蒸馏水和0.5％的重量百分含量的乙酸反复冲洗至中性，再于80℃干燥至恒重，得到细菌纤维素膜； (3)细菌纤维素膜的改性处理 在500mL带塞锥形瓶中，分别加入环氧氯丙烷20～30mL，无水乙醇5～10mL，高氯酸1～2mL，蒸馏水3～6mL，用甲苯稀释至100～200mL，摇匀后，加入2～4g上述步骤(2)得到的细菌纤维素膜，在60℃恒温水浴中加热4～6小时，待反应完毕后，取出膜用丙酮洗涤，以除掉膜上残留的小分子有机物，置于80℃条件下烘干；将烘干的膜置于另一500mL锥形瓶中加入乙二胺6～12mL，蒸馏水100～200mL，充分振摇后，在80℃恒温水浴中加热4～6小时，然后取出膜用蒸馏水洗至中性，再用1％的重量百分含量的盐酸洗涤后，仍用蒸馏水洗至中性，最后经丙酮润洗，自然风干，得到改性细菌纤维素膜； (4)固定化细胞的制备 向250mL锥形瓶中加入1～2g上述步骤(3)得到的改性细菌纤维素膜载体，再加入20～30mL 0.03mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液；以及10～15mL的25％重量百分含量的戊二醛溶液，在40℃水浴中反应1～2小时，取出膜依次用100mL蒸馏水和100mL 0.03mol/LpH＝7.0的磷酸缓冲溶液洗涤，然后自然风干；在另一250mL锥形瓶中加入上述戊二醛处理过的细菌纤维素载体、15～20mL0.03mol/L pH＝7.0的磷酸缓冲溶液、10～20mL上述步骤(1)得到的备用的白腐真菌孢子液，密封好，于4℃下放置12小时，取出膜依次用250mL 4℃的含0.5mol/L NaCl的0.03mol/L磷酸缓冲溶液，其pH＝7.0，以及50mL 4℃的0.03mol/L pH＝7.0的磷酸缓冲溶液洗涤，得到乳白色的细菌纤维素膜固定化白腐真菌。
上面步骤(1)提到的白腐真菌的分离与筛选中，所用的2g腐木取采自我国海南省海口市。
白腐真菌的鉴定在上述步骤(1)白腐真菌的分离鉴定及孢子液的制备中的步骤A.白腐真菌的分离鉴定中，从白腐真菌保存斜面挑取单菌落，接入产酶培养基中，所述的产酶培养基中各组分占产酶培养基质量用量百分比分别为葡萄糖1％，KH2PO40.2％，CaCl2 0.01％，NH3Cl 0.2％，MgSO4·7H2O 0.05％，FeSO4 0.01％，NaCl 0.0001％，MnSO4 0.00005％，维生素B1 0.0005％，pH6.0-7.0，121℃灭菌30分钟；于30℃下在150rpm摇床中培养12天，发酵液离心去除菌体，取上清液即为粗酶液用于白腐真菌特征酶活力的检测，结果如下表1所示
漆酶及锰过氧化物酶活力的测定均采用愈创木酚法，参照《白腐真菌生物学和生物技术》。一个酶活力单位定义为每分钟引起波长465nm处吸光度一个0.01单位变化所需要的酶液量。
通过以上特征酶活力检测结果，鉴定该菌株为白腐真菌。
在上述步骤(2)细菌纤维素膜的制备中的步骤A.木醋杆菌(Acetobacter xylinum)的分离鉴定中，经连续三次划线分离得到纯菌种，肉眼观察菌落呈灰白色，能形成皮革状菌膜，显微镜观察菌种呈杆状，其生理生化指标检测结果如下表2所示
通过以上表观特征及检测结果，鉴定该菌株为木醋杆菌，参照《伯杰氏细菌鉴定手册》(第八版)。
本发明与现有技术相比存在显著的进步和积极的效果 ①以细菌纤维素膜作为载体固定化白腐真菌，在细菌纤维素应用上提供了新的思路和途径。
②载体纯度高，生物稳定性强。
③传质性能好，受环境影响小，操作稳定性好。
④无毒无害，生物相容性好。
⑤抗张力强，韧性好。
⑥废弃后易被环境微生物降解，并成为植物生长的肥料。
为验证本发明细菌纤维素膜对白腐真菌的固定化效果，分别用两种载体，即细菌纤维素膜和木屑固定化白腐真菌，并分别处理了3批次木糖醇生产废水(原水CODcr为991mg/L，色度以340nm处吸光值计为0.801)；处理步骤为在两个250mL三角瓶中各加入1g不同载体固定化白腐真菌，50mL木糖醇生产废水，30℃恒温摇床150rpm处理7天，测定处理效果，弃掉处理后废水，保留固定化菌，再向此三角瓶中加入50mL木糖醇生产废水，30℃恒温摇床150rpm处理7天，测定处理效果，如此再重复1次，即用同1批固定化白腐真菌连续处理3批次木糖醇生产废水；处理效果如表3所示 表3 不同载体固定化白腐真菌对木糖醇生产废水处理效果
从表3中可以看出，细菌纤维素膜固定化的白腐真菌对3批次木糖醇生产废水处理效果没有出现明显下降，明显好于木屑固定化的白腐真菌，同时细菌纤维素膜固定化的白腐真菌与未固定化的白腐真菌对木糖醇生产废水的处理效果相当，证明细菌纤维素膜对白腐真菌的固定化效率高，对菌活性影响小，操作稳定性好。
上述木屑对白腐真菌的固定化步骤为取木屑1～2g，用2％的H2O2溶液浸泡30min后，用蒸馏水洗至中性，放入20～40mL基础培养基中浸泡24小时；所述的基础培养基中各组分占基础培养基用量百分比分别为葡萄糖1％、KH2PO4 0.04％、K2HPO4 0.16％、MgSO4·7H2O 0.02％、NH3NO3 0.05％、FeCl3·6H2O 0.005％、CaCl20.0025％，121℃灭菌15分钟；滤去浸液，将浸泡后的木屑121℃灭菌15min；加入10～20mL上述步骤(1)得到的备用的白腐真菌孢子液，密封好，30℃恒温培养箱中放置7天，即得木屑固定化白腐真菌。
具体实施例方式 实施例1 白腐真菌的分离鉴定及孢子液的制备 A.白腐真菌的分离鉴定取腐木2g加入灭菌后的100mL液体培养基中，置于生化培养箱中30℃恒温培养，随时观察培养基中菌的生长状况；所述的液体培养基中各组分占液体培养基质量用量百分比分别为KH2PO4 0.02％，MgSO4·7H2O 0.005％，CaCl20.001％，葡萄糖1％，NH3Cl 0.02％，H2O2 0.05％，酒石酸钠0.028％，琥珀酸钠0.054％，马铃薯提取液占液体培养基体积用量百分比为0.05％，121℃灭菌30分钟；48小时后，取该培养液10mL重复进行富集培养，经3次富集培养后，取最终富集液在固定培养基平板上进行涂布培养；所述的固体培养基中各组分占固体培养基质量用量百分比分别为葡萄糖2％，KH2PO4 0.3％，MgSO4·7H2O 0.15％，维生素B1 0.0005％，琼脂1.2％，马铃薯提取液占固体培养基体积用量百分比为80％，121℃灭菌30分钟；24小时后，在平板上挑取白色绒形的菌种进行划线分离，待出现白色菌丝后，挑取单个菌落再划线分离，直至重复得到单菌株，经鉴定为白腐真菌，斜面保存，备用。
B.白腐真菌孢子液的制备从白腐真菌保存斜面挑取少量菌丝，划线法接种于上述步骤A.提及的固体培养基上，30℃培养5天后，白腐真菌孢子大量扩增，用无菌水轻轻洗出平板表面上的分生孢子，并在无菌条件下用16层滤布滤除菌块，所得乳白色孢子悬浮液为白腐真菌孢子液，4℃冰箱保存备用。
实施例2 细菌纤维素膜的制备 A.木醋杆菌(Acetobacter xylinum)的分离鉴定将醋醅稀释100倍后接种于50mL富集培养基中，富集培养基中各组分占富集培养基质量用量百分比分别为葡萄糖5％；酵母膏0.5％；乙酸钠0.2％；CaCO3 1％；用乙酸调节pH至5.0；121℃下灭菌30分钟后，加入占富集培养基体积用量百分比为2％的无水乙醇和质量用量百分比为0.5％的制霉菌素，再于28℃温度下培养5天，液面长有乳白色胶质菌膜者为阳性。揭去富集培养基表面的凝胶膜，将此膜仔细贴在第一块分离培养基平板上；所述的分离培养基中各组分占分离培养基质量用量百分比分别为葡萄糖5％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.5％；Na2HPO4·12H2O 0.2％；KH2PO4 0.1％；MgSO4·7H2O0.025％；柠檬酸0.2％；琼脂2％；pH5.8；121℃灭菌30分钟；再取出贴在第二块平板，如此重复6次，即每张膜平均贴8块平板。平板置28℃培养48小时后挑取单个菌落接入斜面，再经连续三次划线分离，经鉴定为木醋杆菌菌种。
B.细菌纤维素膜的产生从上述步骤A.斜面挑取筛选到的木醋杆菌单菌落接种于50mL发酵培养基中，所述的发酵培养基中各组分用量占发酵培养基质量用量的百分比分别为葡萄糖5％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.5％；Na2HPO4·12H2O 0.2％；KH2PO4 0.1％；MgSO4·7H2O 0.025％；柠檬酸0.2％；pH5.8；于121℃灭菌30分钟，28℃静置培养5天后，在液面生成乳白色或淡黄色胶质菌膜。将膜取出，用蒸馏水反复冲洗，除去膜表面培养基及杂质。再将膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液，100℃煮沸20min，去除菌膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明。然后用蒸馏水和0.5wt％的乙酸反复冲洗至中性。80℃干燥至恒重，即得细菌纤维素膜。
实施例3 细菌纤维素膜的改性处理 在500mL带塞锥形瓶中，分别加入环氧氯丙烷20mL，无水乙醇5mL，高氯酸1mL，蒸馏水3mL，用甲苯稀释至100mL，摇匀后，加入实施例2得到的2g细菌纤维素膜，在60℃恒温水浴中加热4小时，待反应完毕后，取出膜用丙酮洗涤，以除掉膜上残留的小分子有机物，置于80℃条件下烘干。将烘干的膜置于另一500mL锥形瓶中，加入乙二胺6mL，蒸馏水100mL，充分振摇后，在80℃恒温水浴中加热4小时，然后取出膜用蒸馏水洗至中性，再用1wt％盐酸洗涤后，仍用蒸馏水洗至中性，最后经丙酮润洗，自然风干，即得改性细菌纤维素膜。
固定化细胞的制备 在250mL锥形瓶中加入1g上述得到的改性细菌纤维素膜载体，20mL磷酸缓冲液(0.03mol/L，pH＝7.0)，以及10mL的25％戊二醛溶液，在40℃水浴反应1小时，取出膜依次用100mL蒸馏水和100mL 0.03mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)洗涤，自然风干。在另一250mL锥形瓶中加入上述戊二醛处理过的细菌纤维素载体，15mL 0.03mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)，例1备用的白腐真菌孢子液10mL，密封好，于4℃下放置12小时，取出膜依次用250mL 4℃的0.03mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0，含0.5mol/L NaCl)和50mL 4℃的0.03mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)洗涤，即得乳白色的细菌纤维素膜固定化白腐真菌。
实施例4 细菌纤维素膜的改性处理 在500mL带塞锥形瓶中，分别加入环氧氯丙烷25mL，无水乙醇8mL，高氯酸1.5mL，蒸馏水5mL，用甲苯稀释至150mL，摇匀后，加入上述例2得到的3g细菌纤维素膜，在60℃恒温水浴中加热5小时，待反应完毕后，取出膜用丙酮洗涤，以除掉膜上残留的小分子有机物，置于80℃条件下烘干。将烘干的膜置于另一500mL锥形瓶中，加入乙二胺9mL，蒸馏水150mL，充分振摇后，在80℃恒温水浴中加热5小时，然后取出膜用蒸馏水洗至中性，再用1％盐酸洗涤后，仍用蒸馏水洗至中性，最后经丙酮润洗，自然风干，即得改性细菌纤维素膜。
固定化细胞的制备 在250mL锥形瓶中加入1.5g上述得到的改性细菌纤维素膜载体，25mL磷酸缓冲液(0.03mol/L，pH＝7.0)，以及13mL的25％戊二醛溶液，在40℃水浴反应1.5小时，取出膜依次用100mL蒸馏水和100mL 0.03mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)洗涤，自然风干。在另一250mL锥形瓶中加入上述戊二醛处理过的细菌纤维素载体，18mL 0.03mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)，例1备用的白腐真菌孢子液15mL，密封好，于4℃下放置12小时，取出膜依次用250mL 4℃的0.03mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0，含0.5mol/L NaCl)和50mL 4℃的0.03mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)洗涤，即得乳白色的细菌纤维素膜固定化白腐真菌。
实施例5 细菌纤维素膜的改性处理 在500mL带塞锥形瓶中，分别加入环氧氯丙烷30mL，无水乙醇10mL，高氯酸2mL，蒸馏水6mL，用甲苯稀释至200mL，摇匀后，加入例2得到的4g细菌纤维素膜，在60℃恒温水浴中加热6小时，待反应完毕后，取出膜用丙酮洗涤，以除掉膜上残留的小分子有机物，置于80℃条件下烘干。将烘干的膜置于另一500mL锥形瓶中，加入乙二胺12mL，蒸馏水200mL，充分振摇后，在80℃恒温水浴中加热6小时，然后取出膜用蒸馏水洗至中性，再用1％盐酸洗涤后，仍用蒸馏水洗至中性，最后经丙酮润洗，自然风干，即得改性细菌纤维素膜。
固定化细胞的制备 在250mL锥形瓶中加入2g上述得到的改性细菌纤维素膜载体，30mL磷酸缓冲液(0.03mol/L，pH＝7.0)，以及15mL的25％戊二醛溶液，在40℃水浴反应2小时，取出膜依次用100mL蒸馏水和100mL 0.03mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)洗涤，自然风干。在另一250mL锥形瓶中加入上述戊二醛处理过的细菌纤维素载体，20mL 0.03mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)，例1备用的白腐真菌孢子液20mL，密封好，于4℃下放置12小时，取出膜依次用250mL 4℃的0.03mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0，含0.5mol/L NaCl)和50mL 4℃的0.03mol/L磷酸缓冲溶液(pH＝7.0)洗涤，即得乳白色的细菌纤维素膜固定化白腐真菌。
权利要求
1、一种利用细菌纤维素膜做载体固定化白腐真菌的方法，是
由如下的过程和步骤组成
(1)白腐真菌White rot fungi的分离及孢子液的制备
A.白腐真菌的分离取腐木2g加入灭菌后的100mL液体培养基中，置于生化培养箱中30℃恒温培养，随时观察培养基中菌的生长状况；所述的液体培养基中各组分占液体培养基质量用量百分比分别为KH2PO4 0.02％，MgSO4·7H2O 0.005％，CaCl2 0.001％，葡萄糖1％，NH3Cl 0.02％，H2O2 0.05％，酒石酸钠0.028％，琥珀酸钠0.054％，马铃薯提取液为液体培养基体积的0.05％，其中马铃薯提取液为200g马铃薯在1L蒸馏水中煮沸30分钟后，用16层纱布过滤掉不溶物制得；121℃灭菌30分钟；48小时后，取该培养液10mL重复进行富集培养，经3次富集培养后，取最终富集液在固定培养基平板上进行涂布培养；所述的固体培养基中各组分占固体培养基质量用量百分比分别为葡萄糖2％，KH2PO4 0.3％，MgSO4·7H2O 0.15％，维生素B1 0.0005％，琼脂1.2％，马铃薯提取液占固体培养基体积用量百分比为80％；121℃灭菌30分钟；24小时后，在平板上挑取白色绒形的菌种进行划线分离，待出现白色菌丝后，挑取单个菌落再划线分离，直至重复得到纯的单菌株，斜面保存，备用；
B.白腐真菌孢子液的制备从上述步骤A.得到的白腐真菌保存斜面挑取少量菌丝，划线法接种于固体培养基上，所述的固体培养基的组成与步骤A中的固体培养基相同，30℃培养5天后，白腐真菌孢子大量扩增，用无菌水轻轻洗出平板表面上的分生孢子，并在无菌条件下用16层滤布滤除菌块，得到乳白色孢子悬浮液为白腐真菌孢子液，4℃冰箱保存备用；
(2)细菌纤维素膜的制备
A.木醋杆菌Acetobacter xylinum的分离将醋醅稀释100倍后接种于50mL富集培养基中，富集培养基中各组分占富集培养基质量用量百分比分别为葡萄糖5％；酵母膏0.5％；乙酸钠0.2％；CaCO3 1％；用乙酸调节pH至5.0；121℃下灭菌30分钟后，加入占富集培养基体积用量百分比为2％的无水乙醇和质量用量百分比为0.5％的制霉菌素，再于28℃温度下培养5天，液面长有乳白色胶质菌膜者为阳性；揭去富集培养基表面的凝胶膜，将此膜仔细贴在第一块分离培养基平板上；所述的分离培养基中各组分占分离培养基质量用量百分比分别为葡萄糖5％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.5％；Na2HPO4·12H2O 0.2％；KH2PO4 0.1％；MgSO4·7H2O 0.025％；柠檬酸0.2％；琼脂2％；pH5.8；121℃灭菌30分钟；再取出贴在第二块平板，如此再重复6次；平板置于28℃培养48小时后挑取单个菌落接入斜面，再经连续三次划线分离得到灰白色纯菌种；
B.细菌纤维素膜的产生从步骤A的斜面挑取筛选到的木醋杆菌单菌落接种于50mL发酵培养基中，所述的发酵培养基中各组分用量占发酵培养基质量用量的百分比分别为葡萄糖5％；蛋白胨0.5％；酵母膏0.5％；Na2HPO4·12H2O 0.2％；KH2PO4 0.1％；MgSO4·7H2O0.025％；柠檬酸0.2％；pH5.8；于121℃灭菌30分钟，28℃静置培养5天后，在液面生成乳白色或淡黄色胶质菌膜；将膜取出，用蒸馏水反复冲洗，除去膜表面培养基及杂质；再将膜浸泡于0.1mol/L的NaOH溶液，100℃煮沸20min，去除菌膜中的菌体和残留培养基，膜呈乳白色半透明；然后用蒸馏水和0.5％的重量百分含量的乙酸反复冲洗至中性，再于80℃干燥至恒重，得到细菌纤维素膜；
(3)细菌纤维素膜的改性处理
在500mL带塞锥形瓶中，分别加入环氧氯丙烷20～30mL，无水乙醇5～10mL，高氯酸1～2mL，蒸馏水3～6mL，用甲苯稀释至100～200mL，摇匀后，加入2～4g上述步骤(2)得到的细菌纤维素膜，在60℃恒温水浴中加热4～6小时，待反应完毕后，取出膜用丙酮洗涤，以除掉膜上残留的小分子有机物，置于80℃条件下烘干；将烘干的膜置于另一500mL锥形瓶中加入乙二胺6～12mL，蒸馏水100～200mL，充分振摇后，在80℃恒温水浴中加热4～6小时，然后取出膜用蒸馏水洗至中性，再用1％的重量百分含量的盐酸洗涤后，仍用蒸馏水洗至中性，最后经丙酮润洗，自然风干，得到改性细菌纤维素膜；
(4)固定化细胞的制备
向250mL锥形瓶中加入1～2g上述步骤(3)得到的改性细菌纤维素膜载体，再加入20～30mL 0.03mol/L，pH＝7.0的磷酸缓冲液；以及10～15mL的25％重量百分含量的戊二醛溶液，在40℃水浴中反应1～2小时，取出膜依次用100mL蒸馏水和100mL0.03mol/LpH＝7.0的磷酸缓冲溶液洗涤，然后自然风干；在另一250mL锥形瓶中加入上述戊二醛处理过的细菌纤维素载体、15～20mL0.03mol/L pH＝7.0的磷酸缓冲溶液、10～20mL上述步骤(1)得到的备用的白腐真菌孢子液，密封好，于4℃下放置12小时，取出膜依次用250mL4℃的含0.5mol/L NaCl的0.03mol/L磷酸缓冲溶液，其pH＝7.0，以及50mL4℃的0.03mol/L pH＝7.0的磷酸缓冲溶液洗涤，得到乳白色的细菌纤维素膜固定化白腐真菌。
全文摘要
一种利用细菌纤维素膜做载体固定化白腐真菌的方法，由以下步骤组成白腐真菌的分离及其孢子液的制备、细菌纤维素膜的制备、细菌纤维素膜的改性处理和固定化细胞的制备。细菌纤维素膜用环氧氯丙烷、无水乙醇和高氯酸等处理后，以得到的改性细菌纤维素膜为载体与25％戊二醛溶液反应，经反复洗涤等处理，与白腐真菌孢子液混合，密封，4℃过夜，再反复洗涤，即得细菌纤维素膜固定化白腐真菌，经对木糖醇生产废水中有机物及色度连续3批处理试验表明，其处理效果未见明显下降，具有显著的稳定性。
文档编号C12N11/12GK101392246SQ200810051379
公开日2009年3月25日 申请日期2008年10月29日 优先权日2008年10月29日
发明者于大禹, 张金榜, 徐富超, 关晓辉, 刘文超, 崔长龙, 沈凌宏, 娟 林 申请人:东北电力大学