一种利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Q₁₀的方法

专利名称：：一种利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Q₁₀的方法一种利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Q1Q的方法(一)4支术领域本发明涉及一种利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Q1()的方法，尤其是一种利用鞘氨醇单胞菌ZUTE03(CCTCCNO:M207084)发酵萃取耦合制备辅酶Q1G的方法。
背景技术：
：辅酶Qio(CoenzymeQn),CoQ1G)广泛存在于动物、才直物及孩t生物体内，是生物细胞呼吸链中重要的递氢体，也是一种良好的生化药物(NazzalS，NutanM，Palamakulaa，W<a/.Optiimizationofaself-nanoemulsifiedtabletdosageformofUbiquinoneusingresponsesurfacemethodology,/wferwa"'owa/Jbw/77"/o/jP/zarwacewf/cs,2002,240:103-114.)。它具有4瓦氧4b性、消除自由基、提高机体免疫力等功能(ErnsterL.FactsandideasaboutthefiinctionofcoenzymeQi。intheMitochondria.五/serw.er^4wWeniam.1977,23:15-18.),，已广泛应用于各类心脏病、糖尿病、癌症、急慢性肝炎、帕金才籴症等疾病的治疗。(Jin-HoChoi,Yeon-WooRyu，Jin-HoSeo，dBiotechnologicalproductionandapplicationsofCoenzymeQi。'M/craWo/5z'ofec/z"o/,2005,68:9-15.)最近，研究者发现辅酶Q!。具有抗衰老作用，从而将其应用扩展到化妆品和保健品领域，使其在国内外的需求进一步扩大。(张延静，袁其朋，梁浩,等.产辅酶QK)酵母的发酵条件研究.微生物学通报,2003,30(2):65-69.)另外，近年来科学研究表明，辅酶Qu)对感染fflV的病人亦有辅助治疗的功效，目前这方面的应用正处于II期临床阶段(姜传福.辅酶QK)的制备及其药物功能.石油化工高等学校学报.2005，18(4):52—81.)。制备辅酶Qw的方法主要有动物细胞提取法、烟叶茄呢醇半合成法、完全合成法、微生物发酵法或植物细胞培养法(王青云,王发祥,钟士清，等.微生物发酵生产辅酶Qt。的研究进展.化学与生物工程，2006,23(8):11-13.)。与其他方法相比，微生物发酵法具有产物活性高、原料成本低、易控制及可实现大规模生产等特点(MeganathanR.Ubiquinonebiosynthesisinmicroorganisms.F五MSM/cra6/o/c^丄e股ra，2001，203:131—139.)。通过发酵收集到菌体后大致通过下面两种方法来提取辅酶Qn)。(1)不经皂化的提取分离方法将菌体破碎后直接用丙酮或沸腾酒精抽提，后用石油醚萃取多次，再用水或曱醇洗去极性物质，经硅胶柱纯化。(2)醇碱或碱急化提取法用醇碱先皂化后用石油醚或正已烷回流提取，水洗后同样经硅胶柱纯化(韩少英，窦洁，周长林.发酵法生产辅酶Qn)的研究进展.药物生物技术，2006,13(3):227-232.)。同直接提取法相比，皂化后提取法得到的提取物量较多，但辅酶Q,o容易被破坏且步骤烦瑣，费时费力，且提取溶剂损耗较大。
发明内容本发明即是为了对现有发酵提取工艺进行简化和优化,提供一种萃取溶剂回收率高、方法简便、辅酶Qu)收率高的利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Qw的方法。本发明采用的技术方案是一种利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Qk)的方法，所述方法包括以鞘氨醇单胞菌种接种于适用于鞘氨醇属菌种的液体培养基，所述液体培养基添加有体积为液体培养基体积1~5%的大豆油，于25~28。C下培养24~36h后，加入体积为液体培养基体积0.20.5倍的正己烷，于2528。C下发酵萃取耦合6~12h,反应结束后，反应液分层取有机层，有机层经分离纯化得到所述的辅酶Q1Q。这里在液体培养基加入大豆油作为细胞通透剂，提高细胞膜的通透性，加正己烷作为发酵萃取试剂，在发酵开始的同时加入发酵培养基，提高辅酶Qh)提取效率。优选的，所述鞘氨醇单胞菌种为CCTCCNO:M207084，菌种保藏在中国典型培养物保藏中心，地址中国武汉武汉大学，保藏日期是2007年6月18日，已在在先申请200710070806.8中作为新菌种予以保护。所述大豆油体积用量优选为液体培养基体积的1.53°/。，更优选2%。所述正己烷体积用量优选为液体培养基体积的7/15。所述有机层分离纯化方法可按常规方法进行，优选的，本发明中有机层分离纯化方法如下有机层于旋转蒸发仪5(TC下浓缩，冷冻析出胆固醇，过滤，取滤液，即为辅酶Qio溶液。所述液体培养基为本领域常规适用于鞘氨醇属菌种的液体培养基，本发明中所述液体培养基优选按如下组成配制每1000mL水中加入葡萄糖1020g、(NH4)2S04515g、KH2P040.5g、Na2HP041.5g、MgSO40.5g，pH6.08.0。优选的，所述方法如下以鞘氨醇单胞菌ZUTE03菌种接种于适用于鞘氨醇属菌种的液体培养基,所述液体培养基添加有体积为液体培养基体积2%的大豆油，于25。C下培养30h后，加入体积为液体培养基体积7/15的正己烷，于25。C下发酵萃取耦合8h，反应结束后，反应液分层取有机层，有机层于旋转蒸发仪50。C下浓缩至体积为原体积的1/10-1/5，冷冻析出胆固醇，过滤，取滤液，即为辅酶Qu)溶液；所述适用于鞘氨醇属菌种的液体培养基按如下组成配制葡萄糖15g,(NH4)2S0410g,KH2P040.5g,Na2HP041.5g，MgS040.5g,水1000mlpH7.0。以发酵萃取耦合法提取菌体中的辅酶Qio,首先要证明此方法对菌体中辅酶Qw的提取不会造成损失，因此将菌体移入150ml圆底烧瓶内，分别以传统皂化提取法和发酵萃取耦合提取法提取发酵菌体中的辅酶Q10,每组设3组平行，所得产物溶液以HPLC进行检测分析。结果表明无论从发酵液产量指标还是从单位菌体的产量指标分析,发酵萃取耦合提取法相对于传统的皂化提取法，非但不会对发酵菌体中辅酶Q1G的提取造成损失，反而能达到更高的产量。在确定以上结果的条件下，进行发酵萃取耦合法最优条件的单因素研究。根据以上发酵萃取耦合的方法，对细胞通透剂的选择、通透剂添加浓度、通透剂添加时间、发酵萃取耦合溶剂选择、萃取溶剂添加量、添加时间及萃取时间等工艺条件分别进行了优化。最终确定以大豆油为细胞通透剂，发酵起始时加入大豆油作为细胞通透剂，添加体积为液体培养基体积的2%，以正己烷为萃取溶剂，发酵30h后加入液体培养基体积7/15的量，发酵萃取耦合8h,提取所得的辅酶QK)的产量最高能达到32.51mg/L。以上方法省去了辅酶QK)传统提取方法中辅酶Qw容易被破坏、步骤烦瑣、费时费力等缺陷，并且，经多次对照实验，最终证明此发酵萃取耦合法对发酵菌体中辅酶Qio的获取不会造成损失，且萃取溶剂回收率较高，减少了辅酶QK)提取过程中试剂的消耗。以上工艺参数经单因素实验、多次平行验证，为该方法最优条件，即以大豆油为细胞通透剂，发酵起始时加入培养液，添加浓度为2%,以正己烷为萃取溶剂，发酵30h后加入，加入体积为液体发酵液体积的7/15，发酵萃取8h。发酵萃取耦合法对发酵菌体辅酶QK)的发酵提取工艺进行了7简化与优化，节约人力与试剂，省时简便，在利于产物积累的勤出上，亦提高了辅酶Qu)生产效率。本发明的有益效果主要体现在1.选择大豆油为良好的细胞通透剂，将辅酶Qio从细胞内溶出，为发酵萃取耦合提取创造先决条件；2.选择合适的有机溶剂正己烷作为发酵萃取试剂，萃取胞外的辅酶Qi。，并确定了的最佳添加量、最佳时间与最佳萃取时间，提高辅酶Qu)提取效率。萃取溶剂经分层、真空浓缩后回收，回收率较高，可达70。/o以上，节约人力物力，方法简便省时、辅酶Qu)收率高，利于工业化生产。(四)图1发酵萃取耦合法的可行性验证；图2不同细胞通透剂对发酵萃取耦合效果的影响结果；图3大豆油添加浓度对发酵萃取耦合效果的影响结果；图4大豆油添加时间对发酵萃取耦合效果的影响结果；图5提取溶剂添加量对发酵萃取耦合效果的影响结果；图6提取溶剂添加时间对发酵萃取耦合效果的影响结果；图7提取溶剂萃取时间对发酵萃取耦合效果的影响结果。(五)具体实施例方式下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述,但本发明的保护范围并不仅限于此实施例l:对鞘氨醇单胞菌(Sp/w>7gomo"assp.)ZUTE03(CCTCCNo.M207084)发酵萃取耦合产辅酶QK)工艺的验证采用发酵萃取耦合法产辅酶Qio采用发酵萃取耦合法直接萃取微生物发酵生产的辅酶Qu)主要需解决两个问题1.辅酶Q^是微生物发酵所得细胞内产物，因此要选择良好的细胞通透剂，将其从细胞内溶出，为发酵萃取耦合提取创造先决条件；2.要选择合适的有机溶剂萃取胞外的辅酶QK),确定其添加的最佳量、最佳时间与最佳萃取时间，并且此溶剂的添加对菌的生长和辅酶Q^的产量不造成影响。因此，首先对该方法进行-验证。将鞘氨醇单胞菌(5^/n'wgowo"ossp.)ZUTE03菌悬液(细胞浓度1.94g/L)以4%(v/v)接种量，接种于发酵培养基(葡萄糖15g,(NH4)2S0410g,KH2P040.5g,Na2HP041.5g,MgS040.5g，水IOOOmlpH7.0)150mL，培养温度25。C,200r/min摇床培养。分别以传统皂化提:f又法(具体方法发酵30h^发酵液离心，得湿菌体，将湿菌体2g移入容器内，力口入0.7g焦性没食子酸，2.5gKOH,19ml曱醇，7ml蒸馏水，混匀。在90。C水浴锅中回流30min,用自来水迅速冷却至室温，倒入分液漏斗，加入正己烷40ml,剧烈振荡5min,萃取辅酶(^1()，连续萃取2次，合并萃取液。用旋转蒸发仪于50。C下将其浓缩。加入5ml无水乙醇，放入冰箱冷冻，析出胆固醇，过滤，取滤液，即得辅酶Qn)溶液，定容至100ml，待测)和发酵萃取耦合提取法(具体方法发酵培养基中添力口3mL的大豆油(上海嘉里食品工业有限公司产品)发酵培养30h后加入正己烷50mL,25°C、200r/min耦合发酵培养6h,培养结束后，耦合法发酵菌液静置分层取上层有机相，于旋转蒸发仪5(TC下将其浓缩至510ml，后放入冰箱冷冻，析出胆固醇，过滤，取滤液，即得辅酶Qu)溶液)获得发酵菌体中的辅酶Qu),每组设3组平行，所得产物溶液以HPLC进行检测分析，结果如图l,表明发酵萃取耦合法对发酵菌体中的辅酶(^o的产物不会造成损失。实施例2:对鞘氨醇单胞菌(5^/"gomo"ossp.)ZUTE03CCTCCNo.M207084发酵萃取耦合产辅酶QK)工艺条件的优化在确定实施例l结果的基础上，结合发酵萃取耦合的机理，对各项条件进行探索和优化。(1)、发酵萃取耦合提耳又溶剂的选择选取正己烷、丙酮、丙二醇、橄榄油作为发酵萃取试剂，并预先以大豆油为细胞通透剂(添加浓度1%，1.5mL),发酵开始的同时加入发酵培养基(葡萄糖15g，(NH4)2SO410g,KH2PO40.5g，Na2HPO41.5g,MgS040.5g,水1000mlpH7.0)150mL，将鞘氨醇单胞菌(5^/"gowowmsp.)ZUTE03(CCTCCNo.M207084)菌悬液(细胞浓度1.94g/L)以4%(v/v)接种量，接种于发酵培养基，培养温度25°C,200r/min摇床培养发酵30h后加入发酵萃取试剂(加入量设为50mL),25°C、200r/min耦合发酵培养6h,培养结束后，耦合法发酵菌液静置分层取上层有机相，于旋转蒸发仪50。C下将其浓缩至510ml，后放入水箱冷冻，析出胆固醇，过滤，取滤液，即得辅酶QK)溶液，以HPLC进行检测分析，分别考察萃取试剂在发酵过程中对发酵菌体中辅酶Qn)提取效果的影响。由于丙酮、丙二醇都能与水互溶，因此在发酵萃取的过程中，很难萃取分层，而辅酶Qu)作为有机物不溶于水相，因此，丙酮、丙二醇不适合作为发酵萃取耦合提取溶剂；而加入橄榄油的发酵液在萃取结束后，菌体显得很粘稠，不易分层，即使能分层，其形成的有机相难于过滤得到萃取液，所以也不适合；正己烷对辅酶Qu)具有良好的溶剂性，且发酵萃取后的菌体粘度适中，易于分层过滤取有机相。因此综合以上分析，最终选择正己烷作为发酵萃取耦合提取溶剂，但正己烷也有容易挥发，并且可能对菌体的生长造成一定的毒害作用等缺点，为了解决以上问题，我们还对发酵液中添加正己烷的挥发性作了多次实验分析，结果证明，150rnL发酵液中加入50mL正己烷，发酵36h(总时间)后，正己烷的回收率能达到80%以上，可能是由于在摇床高速振荡的过程中，正己烷能与发酵液较好地互溶，不易于挥发；另外，考虑到添加正己烷可能对5^/^gomo/7ossp.strainZUTE03菌抹的生长具有一定的毒害作用，结合该菌的生长曲线，选择在其进入生长指数期后添加正己烷，尽量减少添加的正己烷对菌体生长的负面影响，从而避免间接导致发酵液中辅酶Qu)的产量的下降，而具体的添加时间将在下面实-险中加以详细阐述。(2)、发酵萃取耦合细胞通透剂的选择辅酶QK)是微生物发酵所得细胞内产物，因此加入细胞通透剂，提高细胞膜的通透性，才能使辅酶QK)从细胞内溶出，为有机溶剂的发酵萃取耦合提取创造条件，因此选取大豆油、丙二醇、吐温-80等几种常见的细胞通透剂，在发酵开始时加入，以合适的有机试剂(正己烷)进行发酵萃取耦合提取菌体中的辅酶Q1(),其他参数同实验(1)，发酵36h(总时间)后测定辅酶Qw产量和细胞生物量，考察不同的细胞通透剂对发酵萃取耦合提取效果的影响。结果如图2所示，表明大豆油的效果最好。(3)、发酵萃取耦合细胞通透剂添加浓度的研究在实-验2结果的基础上，设定0、1%、2%、3%、5%的浓度梯度，其他参数同实验(l),，考察不同的大豆油添加浓度对发酵萃取耦合提取效果的影响。结果如图3所示，表明2%的效果最好。(4)、发酵萃取耦合细胞通透剂添加时间的研究在实验2、3结果的基础上，设定0、6、12、18h的时间梯度，其他参数同实验(1)，考察不同的细胞通透剂添加时间对发酵萃取耦合提取效果的影响。结果如图4所示，表明0h添加的效果最好。(5)、发酵萃取耦合提取溶剂添加量的研究选取合适的有机试剂(正己烷)，分别设30、40、50、70mL的有机溶剂加入量梯度，并结合发酵曲线，发酵30h后加入，总发酵时间定为36h，其他参数同实验(l),考察其对发酵菌体中辅酶Qh)提取效果的影响。结果如图5所示，表明70rnL的效果最好。(6)、发酵萃取耦合提取溶剂添加时间研究选取合适的有机试剂(正己烷)，考虑到有机试剂对菌生长有一定的毒害作用，结合Sp/7/"gowo"^sp.ZUTE03的生长曲线与发酵曲线，在菌生长完全并且辅酶Q,o的产量进入稳定期时，开始加入有机试剂进行发酵萃取，分别在发酵18、24、30、36h时加入，然后继续发酵萃取6h,其他参数同实验(l)，测定辅酶QK)的产量和细胞生长总量。结果如图6所示，表明30h添加的效果最好。(7)、发酵萃取耦合提取溶剂发酵萃取时间研究选取合适的有机试剂(正己烷)，发酵30h后添加，添加量为70mL,其他参数同实验(l)。发酵萃取耦合时间设为4、6、8、12h,测定辅酶Qu)产量和细胞生物量。结果如图7所示，表明8h的萃取效果最好。权利要求1.一种利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Q10的方法，所述方法包括以鞘氨醇单胞菌种接种于适用于鞘氨醇属菌种的液体培养基，所述液体培养基添加有体积为液体培养基体积1～5％的大豆油，于25～28℃下培养24～36h后，加入体积为液体培养基体积0.2～0.5倍的正己烷，于25～28℃下发酵萃取耦合6～12h，反应结束后，反应液分层取有机层，有机层经分离纯化得到所述的辅酶Q10。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述鞘氨醇单胞菌种为CCTCCNO:M207084。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述大豆油体积用量为液体培养基体积的1.5~3%。4.如权利要求3所述的方法，其特征在于所述大豆油体积用量为液体培养基体积的2%。5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述正己烷体积用量为液体培养基体积的7/15。6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述有机层分离纯化方法如下有机层于旋转蒸发仪50。C下浓缩，冷冻析出胆固醇，过滤，取滤液，即为辅酶Qu)溶液。7.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述液体培养基按如下组成配制每1000mL水中加入葡萄糖10~20g、(NH4)2SO4515g、KH2PO40.5g、Na2HP041.5g、MgS040.5g，pH6.0~8.0。8.如权利要求1所述的方法，所述方法如下以鞘氨醇单胞菌ZUTE03菌种接种于适用于鞘氨醇属菌种的液体培养基，所述液体培养基添加有体积为液体培养基体积2%的大豆油，于25。C下培养30h后，加入体积为液体培养基体积7/15的正己烷，于25。C下发酵萃取耦合8h，反应结束后，反应液分层取有机层，有机层于旋转蒸发仪50。C下浓缩至体积为原体积的1/10~1/5,冷冻析出胆固醇，过滤，取滤液，即为辅酶Qw溶液；所述适用于鞘氨醇属菌种的液体培养基按如下组成配制葡萄糖15g，(NH4)2S0410g,KH2PO40.5g,Na2HPO41.5g,MgS040.5g,水1000mlpH7.0。全文摘要本发明提供了一种利用鞘氨醇单胞菌发酵萃取耦合制备辅酶Q₁₀的方法，所述方法包括以鞘氨醇单胞菌种接种于适用于鞘氨醇属菌种的液体培养基，所述液体培养基添加有体积为液体培养基体积1～5％的大豆油，于25～28℃下培养24～36h后，加入体积为液体培养基体积0.2～0.5倍的正己烷，于25～28℃下发酵萃取耦合6～12h，反应结束后，反应液分层取有机层，有机层经分离纯化得到所述的辅酶Q₁₀。萃取溶剂回收率高，节约人力物力，方法简便省时、辅酶Q₁₀收率高，利于工业化生产。文档编号C12P7/26GK101307337SQ200810062350公开日2008年11月19日申请日期2008年5月9日优先权日2008年5月9日发明者张艾晓,方建军,李炎生,李艺潇,柳华贵,新汪,莉钟,钟卫鸿申请人:浙江工业大学