专利名称：线性聚n-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法
技术领域：
本发明涉及一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法。
背景技术：
基因工程蛋白质产业化过程中往往面临这样一个难题重组表达产物通常 是以没有生物活性的聚集体形式即包涵体存在的。如何使蛋白质高效地重折叠 成为具有天然构象和天然活性的蛋白质，是决定该基因工程蛋白质能否产业化 和为人类所利用的关键，这就使得对于蛋白质体外复性技术的开发成为近年来 的研究热点之一。但由于蛋白质的多样性、结构和折叠过程的复杂性，使得人 们不能对一种复性方法进行简单的移植，也很难找到具有普适性而又低成本的 高效复性方法。因此实际操作过程中必须针对每种目标蛋白质的特点，对影响 复性的各个因素逐一优化，才能最终确定适用于该种蛋白质的复性方法。
至今，蛋白质复性方法中的许多问题依然困扰着我们，如蛋白质活性回收 率低、复性起始和终了的蛋白质浓度偏低等。目前出现的一些能够对高浓度蛋 白质进行高效复性的方法如色谱复性等，往往因为设备及材料投入成本高而影 响了大规模应用；分子伴侣和折叠酶介导的蛋白质复性过程是受体内复性过程
的启发，能够在一定程度上提高复性收率，但分子伴侣和折叠酶易失活， 一般
仅用于复性机理的研究。常规的能够协助蛋白质复性的添加剂如聚乙二醇、L-精氨酸、去污剂和表面活性剂以及人工分子伴侣等，虽然对设备要求不高，但 协助复性效果有限。在这种情况下，开发出一种新型、高效、易于分离回收而 又低成本的蛋白质体外复性添加剂就显得尤为重要。近年来功能高聚物作为一 种新型的协助蛋白质体外复性的添加剂越来越引起人们的重视，其主要优点在 于影响复性的参数较少、操作方便、仪器设备简单且生产成本较低。
Roy等(参见尸rate/"五"g/"een'"g, Des7gn <fe 2003， 16, 1153-1157 )
采用了商品化的聚合物Eudragit S-100来复性a-胰凝乳蛋白酶。该聚合物是pH 敏感型聚合物，由甲基丙烯酸与甲基丙烯酸甲酯以l :2的摩尔比共聚而成。当 溶液pH呈弱酸性时(pH4.8)， EudmgitS-100就从溶液中沉淀出来，而当pH升 高到6.0左右时，该聚合物又再次溶解。用EudragitS-100来复性a-胰凝乳蛋白 酶时，复性缓冲液pH8.2，聚合物处于溶解状态，通过它的羧酸酯基与变性(X-胰凝乳蛋白酶疏水基团之间的疏水相互作用会阻止蛋白质聚集，从而协助蛋白 复性，除了可以提高复性活力回收率之外，EudragitS-100还大大提高了复性速率，变性a-胰凝乳蛋白酶在10min便可完全恢复酶活力。但该聚合物是pH敏感 型的，而不同的蛋白质保持活力的环境pH差异较大，因此，该聚合物所能复性 的蛋白质种类很有限。Shimizu等(参见Co〃ozVZs Swr/ac"及'历o^fer/aces, 2002， 18， 137-144)采用反相悬浮法合成了 Poly (styrene- co-glycidyl metharrylate) (SG)微球，再通过化学反应在微球体表面接枝上巯基或二硫键等功能基团，可 以使处于去折叠态疏水基团大量外露的变性目标蛋白质方便地吸附到微球体表 面，在抑制蛋白质相互聚集沉淀的同时，随着二硫键的正确配对而缓慢折叠。 通过该方法可以使溶菌酶的复性收率在稀释复性的基础上提高40%。但是该法 制备步骤较繁琐，且得到的微球仅限于协助含有较多巯基或二硫键的蛋白质体 外复性。本课题组曾合成粒状聚N-异丙基丙烯酰胺并考察了其协助溶菌酶复性 的效果(参见温敏型聚N-异丙基丙烯酰胺凝胶协助溶菌酶复性的方法，发明专 利申请号ZL2004 1 0073406.9，授权日2006年8月2日)，该聚合物是一种 交联网络状凝胶，在水中可以显著溶胀，但不能溶解，由于粒状凝胶表面会吸 附部分蛋白，从而造成蛋白损失。本发明采用的聚N-异丙基丙烯酰胺是一种线 性温敏型聚合物，其低临界溶解温度在32'C附近。 一方面，线性聚N-异丙基丙 烯酰胺具有疏水基团异丙基，可以通过疏水相互作用来协助蛋白质复性；另一 方面，聚N-异丙基丙烯酰胺还含有亲水基团酰胺基团，能够在复性液中溶解， 分散性优于粒状聚合物凝胶，可以与变性蛋白质更好地接触。线性聚N-异丙基 丙烯酰胺疏水作用的强弱可以通过控制温度来方便地调节，以满足不同的目标 蛋白的复性要求。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺 协助溶菌酶体外复性的方法。
方法的步骤如下
1) 将摩尔浓度比为10 : 1~20 : 1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于 无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为lmol/L，在50 7(TC和氮气保护下反 应12~24h，减压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶 液缓慢滴入不断搅拌的正己垸中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复 2~3次，得到线性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重；
2) 将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制成浓度为10mg/mL的溶液，将溶液 置于37'C、 100rpm摇床中处理60 90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液， 取0.02 0.1mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性体系的终体积为lmL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的质量浓度为变性 溶菌酶浓度的0.1~10倍，溶液于20 40°C、 100~180 rpm摇床中复性12~24h。
所述的N-异丙基丙烯酰胺采用正己烷重结晶。偶氮二异丁腈采用无水乙醇 重结晶。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、lmmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L 二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。复性缓冲液 为含有lmmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和 lmmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。
本发明在制备工艺上采取"乙醇溶液中的自由基聚合法"，制备得到的聚 N-异丙基丙烯酰胺为单链线性均聚物，该聚合物具有合适的低临界溶解温度(32 °C)，且对温度的响应极为敏感。在协助溶菌酶复性时，去折叠态溶菌酶可以自 由而快速地与聚N-异丙基丙烯酰胺侧链上的疏水基团异丙基发生疏水相互作 用，从而抑制蛋白质之间的相互聚集，在处理浓度为600pg/mL时，使溶菌酶的 活力回收率从稀释复性的10%提高到80%左右。因此，所开发的线性聚N-异丙 基丙烯酰胺可以作为蛋白质体外复性的添加剂。本发明的优点在于1)制备工 艺简单，易于控制和放大；2)制备的线性聚N-异丙基丙烯酰胺具有一定的疏水 性能，从而可以抑制蛋白质复性过程中的聚集趋势。线性聚N-异丙基丙烯酰胺 协助溶菌酶复性时，可使溶菌酶的比活及活力回收率均比稀释复性有较大的提 高；3)该法复性操作简单，对仪器及设备的要求低，可降低生产成本；4)影 响复性的参数少，易于操作；5)与粒状聚合物凝胶相比，能够在复性液中溶解， 分散均匀，与变性蛋白质接触良好。
图1是本发明线性聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)在不同加入量下协助 溶菌酶体外复性效果图，图中初始溶菌酶浓度400pg/mL，复性温度30"C;
图2是本发明线性聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)在不同温度下协助溶 菌酶体外复性效果图，图中溶菌酶复性初始浓度20(^g/mL，复性液中PNIPAM 浓度为溶菌酶浓度的8倍(w/w);
图3是在不同溶菌酶初始浓度下，本发明线性聚N-异丙基丙烯酰胺(PMPA M)协助溶菌酶体外复性与溶菌酶稀释复性效果比较图，图中复性液中PNIPAM 浓度为溶菌酶浓度的8倍(w/w),复性温度3(TC。
具体实施例方式
本发明采用线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性。步骤包括线性 聚N-异丙基丙烯酰胺的制备和线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性过程。为实现该过程，首先，将N-异丙基丙烯酰胺、偶氮二异丁腈分别用正己烷 和无水乙醇重结晶；然后在无水乙醇溶液中，由偶氮二异丁腈引发自由基聚合 反应。反应结束后，减压蒸发除去大部分乙醇。所得产物用丙酮溶解，溶液缓 慢滴入不断搅拌的正己垸中，得白色沉淀，此即为线性聚N-异丙基丙烯酰胺， 重复该产物溶解和沉淀步骤，以除去未反应的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁 腈。将制得的线性聚N-异丙基丙烯酰胺置于真空干燥器中干燥至恒重；其次线 性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性，将溶菌酶溶于变性缓冲液中，获 得无活性的去折叠态的溶菌酶溶液，再将变性溶菌酶溶液按照不同的稀释倍数 加入到不同体积的复性缓冲液中，复性液中含有相应浓度的线性聚N-异丙基丙 烯酰胺，将溶液充分混匀，进行复性实验。本发明所采用的复性方法中，N-异 丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈的摩尔浓度比为10 : 1~20 : l，N-异丙基丙烯酰胺 的浓度为lmol/L，反应溶剂无水乙醇，反应温度50~70°C，氮气保护下反应 12 24h，产物溶解和沉淀重复2 3次。变性液浓度为10mg/mL，将溶液置于37'C、 100rpm摇床中处理60 90min。复性液中变性溶菌酶溶液的加入量为 0.02 0.1mL，复性体系的终体积为lmL，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的加入量为 溶菌酶浓度的0.1 10倍(w/w)，复性温度为20 40°C，摇床转速为10(M80rpm， 复性时间为12~24h。N-异丙基丙烯酰胺(99%,聚合级，Bdgium公司)，偶氮二异丁腈购自上 海四维化工有限公司；鸡蛋清溶菌酶，还原型谷胱甘肽，氧化型谷胱甘肽，二 硫苏糖醇，购于美国BBI公司；溶菌酶底物微球菌Aft'cracoccw /j^ocfe/fcM ATCC4698购于美国Sigma公司；乙二胺四乙酸钠，三(羟甲基)氨基甲烷购自 上海生工生物工程公司；考马斯亮蓝G-250购自上海化学试剂公司，其它试剂 均为市售分析纯。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、lmmol/L乙二胺四乙酸钠和 30mmol/L 二硫苏糖醇的5Ommol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5; 复性缓冲液为含有lmmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型 谷胱甘肽和lmmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲垸-盐酸 溶液，pH8.5。溶菌酶比活测定采用标准的F.I.P.法，溶菌酶的浓度采用考马斯亮 蓝法测定，溶菌酶的活力回收率为复性后溶液中溶菌酶的活力与变性前溶菌酶 活力之比。以下通过实施例对本发明作进一步的描述 实施例1l)将摩尔浓度比为10 : 1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为lmol/L，在6(TC和氮气保护下反应12h，减 压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不 断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复3次，得到线 性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙 基丙烯酰胺的数均分子量为i^^20.4kDa，重均分子量为I^:30.8kDa，多分散性 =1.51。2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置 于37°C、 100rpm摇床中处理90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取 0.04mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性 体系的终体积为lmL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓 度的0.1倍(w/w)，溶液于30。C、 120rpm摇床中复性16h，结果如图1所示。 复性后溶菌酶活力回收率达56.2%。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、lmmol/L 乙二胺四乙酸钠和30mmol/L 二硫苏糖醇的5Ommol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有lmmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、 10mmol/L还原型谷胱甘肽和lmmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲 基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。实施例21) 将摩尔浓度比为10 : l的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为lmol/L,在6(TC和氮气保护下反应12h，减 压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不 断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复3次，得到线 性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙 基丙烯酰胺的数均分子量为]^^20.4kDa，重均分子量为冗-30.8kDa，多分散性 =1.51。2) 将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置 于37°C、 100rpm摇床中处理60min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取 0.04mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性 体系的终体积为lmL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓 度的8倍(w/w)，溶液于30。C、 120rpm摇床中复性16h，结果如图1所示。复 性后溶菌酶活力回收率达82.7%。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、lmmol/L乙 二胺四乙酸钠和30mmol/L 二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸 溶液，pH8.5。复性缓冲液为含有lmmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和lmmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲 基)氨基甲垸-盐酸溶液，pH8.5。 实施例31) 将摩尔浓度比为10 : 1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙 醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为lmol/L，在6(TC和氮气保护下反应12h，减 压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不 断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复3次，得到线 性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙 基丙烯酰胺的数均分子量为^^20.4kDa，重均分子量为冗-30.8kDa，多分散性 =1.51。2) 将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置 于37°C、 100rpm摇床中处理60min,得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取 0.04mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性 体系的终体积为lmL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓 度的10倍(w/w)，溶液于3(TC、 120rpm摇床中复性16h，结果如图1所示。 复性后溶菌酶活力回收率达75.4%。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、lmmol/L 乙二胺四乙酸钠和30mmol/L 二硫苏糖醇的5Ommol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。复性缓冲液为含有lmmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、 10mmol/L还原型谷胱甘肽和lmmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲 基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。实施例41) 将摩尔浓度比为20 : 1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙 醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为lmol/L，在50'C和氮气保护下反应24h，减 压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不 断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复3次，得到线 性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙 基丙烯酰胺的数均分子量为J^^14.1kDa，重均分子量为^:-25.0kDa，多分散性 =1.77。2) 将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置 于37°C、 100ipm摇床中处理90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取 0.02mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性 体系的终体积为lmL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓度的8倍(w/w)，溶液于20。C、 100rpm摇床中复性24h，结果如图2所示。复 性后溶菌酶活力回收率达87.1%。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、lmmol/L乙 二胺四乙酸钠和30mmol/L 二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸 溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有lmmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L尿素、 10mmol/L还原型谷胱甘肽和lmmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲 基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。 实施例51) 将摩尔浓度比为20 : 1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙 醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为lmol/L，在5(TC和氮气保护下反应24h，减 压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不 断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复3次，得到线 性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙 基丙烯酰胺的数均分子量为^^14.1kDa，重均分子量为J^:-25.0kDa，多分散性 =1.77。2) 将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置 于37°C、 100rpm摇床中处理90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取 0.02mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性 体系的终体积为lmL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓 度的8倍(w/w)，溶液于37'C、 100rpm摇床中复性24h，结果如图2所示。复 性后溶菌酶活力回收率达89.5%。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、lmmol/L乙 二胺四乙酸钠和30mmol/L 二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸 溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有lmmol/L乙二胺四乙酸钠、L8mol/L尿素、 10mmol/L还原型谷胱甘肽和lmmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三(羟甲 基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。实施例61)将摩尔浓度比为20 : 1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙 醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为lmol/L，在7(TC和氮气保护下反应24h，减 压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不 断搅拌的正己垸中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复2次，得到线 性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙 基丙烯酰胺的数均分子量为J^^8.84kDa，重均分子量为冗-22.9kDa，多分散性 =2.59。2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置 于37°C、 lOOrpm摇床中处理60min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取 0.02mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性 体系的终体积为lmL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓 度的8倍(w/w)，溶液于3(TC、 180rpm摇床中复性24h，结果如图3所示。复 性后溶菌酶活力回收率达94.1%，而相同条件下未用线性聚N-异丙基丙烯酰胺 的复性即稀释复性仅能得到44.5%的活力回收率。变性缓冲液为含有8mol/L尿 素、lmmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L 二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基) 氨基甲垸-盐酸溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有lmmol/L乙二胺四乙酸钠、 1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和lmmol/L氧化型谷胱甘肽的 50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。实施例71) 将摩尔浓度比为20 : 1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙 醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为lmol/L，在7(TC和氮气保护下反应24h，减 压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不 断搅拌的正己垸中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复2次，得到线 性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙 基丙烯酰胺的数均分子量为Ji7^8.84kDa，重均分子量为^:-22.9kDa，多分散性 =2.59。2) 将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置 于37°C、 100rpm摇床中处理90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取 0.06mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性 体系的终体积为lmL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓 度的8倍(w/w)，溶液于3(TC、 180rpm摇床中复性24h，结果如图3所示。复 性后溶菌酶活力回收率达79.8%,而相同条件下未用线性聚N-异丙基丙烯酰胺 的复性即稀释复性仅能得到11.9%的活力回收率。变性缓冲液为含有8mol/L尿 素、lmmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L 二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基) 氨基甲烷-盐酸溶液，pH 8.5。复性缓冲液为含有lmmol/L乙二胺四乙酸钠、 1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和lmmol/L氧化型谷胱甘肽的 50mmol/L三(羟甲基)氨基甲垸-盐酸溶液，pH8.5。实施例81)将摩尔浓度比为20 : 1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为lmol/L，在7(TC和氮气保护下反应24h，减 压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不 断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复2次，得到线 性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重。所得的线性聚N-异丙 基丙烯酰胺的数均分子量为i^^8.84kDa，重均分子量为^^22.9kDa，多分散性 =2.59。2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置 于37°C、 100rpm摇床中处理90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取 0.08mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性 体系的终体积为lmL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的浓度为变性溶菌酶浓 度的8倍(wAv)，溶液于30'C、 180rpm摇床中复性24h，结果如图3所示。复 性后溶菌酶活力回收率达9.4%,而相同条件下未用线性聚N-异丙基丙烯酰胺的 复性即稀释复性仅能得到0.6%的活力回收率。变性缓冲液为含有8mol/L尿素、 lmmol/L乙二胺四乙酸钠和30mmol/L二硫苏糖醇的50mmol/L三(羟甲基)氨 基甲垸-盐酸溶液，pH8.5。复性缓冲液为含有lmmol/L乙二胺四乙酸钠、1.8mol/L 尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和lmmol/L氧化型谷胱甘肽的50mmol/L三 (羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。
权利要求
1.一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性的方法，其特征在于方法的步骤如下1)将摩尔浓度比为10∶1～20∶1的N-异丙基丙烯酰胺和偶氮二异丁腈溶于无水乙醇中，N-异丙基丙烯酰胺的浓度为1mol/L，在50～70℃和氮气保护下反应12～24h，减压蒸发除去大部分乙醇，所得反应产物用丙酮溶解，溶解后的溶液缓慢滴入不断搅拌的正己烷中，得白色沉淀，反应产物溶解和沉淀步骤重复2～3次，得到线性聚N-异丙基丙烯酰胺，置于真空干燥器中干燥至恒重；2)将溶菌酶溶于变性缓冲液中，配制成浓度为10mg/mL的溶液，将溶液置于37℃、100rpm摇床中处理60～90min，得到无活性的去折叠态溶菌酶溶液，取0.02～0.1mL无活性的去折叠态溶菌酶溶液，缓慢加入到复性缓冲液中，混匀，复性体系的终体积为1mL，其中，线性聚N-异丙基丙烯酰胺的质量浓度为变性溶菌酶浓度的0.1～10倍，溶液于20～40℃、100～180rpm摇床中复性12～24h。
2. 根据权利要求1所述的一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复 性的方法，其特征在于所述的N-异丙基丙烯酰胺采用正己烷重结晶。
3. 根据权利要求1所述的一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复 性的方法，其特征在于所述的偶氮二异丁腈采用无水乙醇重结晶。
4. 根据权利要求1所述的一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复 性的方法，其特征在于所述的变性缓冲液为含有8mol/L尿素、lmmol/L乙二胺 四乙酸钠和3Ommol/L 二硫苏糖醇的5Ommol/L三(羟甲基)氨基甲垸-盐酸溶液， pH8.5。
5. 根据权利要求1所述的一种线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复 性的方法，其特征在于所述的复性缓冲液为含有lmmol/L乙二胺四乙酸钠、 1.8mol/L尿素、10mmol/L还原型谷胱甘肽和lmmol/L氧化型谷胱甘肽的 50mmol/L三(羟甲基)氨基甲烷-盐酸溶液，pH8.5。
全文摘要
本发明公开了一种用线性聚N-异丙基丙烯酰胺胶协助溶菌酶体外复性的方法，具体步骤如下1)自由基聚合法制备线性聚N-异丙基丙烯酰胺；2)线性聚N-异丙基丙烯酰胺协助溶菌酶体外复性。本发明所开发的线性聚N-异丙基丙烯酰胺，作为一种新型的蛋白质体外复性添加剂，可提高复性溶菌酶的处理浓度，降低生产成本，在处理浓度为600μg/mL时，使溶菌酶的活力回收率提高到80％左右，而相同条件下稀释复性的活力回收率仅为10％。该凝胶具有高效、操作方便、工艺简单等优点，因而在蛋白质体外复性领域具有较好的应用前景。
文档编号C12N9/36GK101298610SQ200810062428
公开日2008年11月5日 申请日期2008年6月6日 优先权日2008年6月6日
发明者关怡新, 姚善泾, 翔 葛, 陈莹莹 申请人:浙江大学