专利名称：：一种松材线虫检测试剂盒及其检测方法
技术领域：
：本发明属于植物保护和质检领域，涉及一种松材线虫检测试剂盒及其检测方法，尤其涉及一种松材线虫实时荧光PCR检测试剂盒及其检测方法。
背景技术：
：松材线虫病[5w犯;^e/e"c/m;^/op/H7i(Sleiner&Buhrer)Nickle],又称为松树萎蔫病，由松墨天牛(Mmoduwi";ya/敏"a加Hope)传播，主要造成松树萎蔫，可在短时间内导致松树死亡，是松树的一种毁灭性病害。寄主包括黑松(Aw"sA""6e^7)、赤松(Pcfe"w:/7oM)和马尾松(户mawom'朋fl)在内的数十种松属植物，也危害少数非松属针叶树。日本1905年首次报道了该病，目前己分布于美国、加拿大、墨西哥、葡萄牙、韩国、日本及中国等多个国家，其中在日本、中国和韩国发生最为严重。我国自1982年在南京中山陵首次发现该病，短短的20年时间里，疫情已扩大到江苏、安徽、广东、浙江、山东、福建、江西、广西、四川、云南、上海、台湾和香港等16个省区，发生面积达10万hm2，累计致死松树3500多万株，直接经济损失25亿元，间接损失250亿元。近年来疫情扩散蔓延呈加剧之势，目前已逼近黄山等著名风景名胜区、世界自然文化遗产和重点生态区域，并己对我国大面积松林构成了严重威胁，是我国最具危险性的头号森林病虫害。但到目前为止，针对该病还没有一种确实有效的防控措施。造成该病远距离、大面积、快速传播的主要因素系人为传播，即人为运输疫木及木制品造成的。因此，加强对松材线虫病的检验检疫，防止其远距离传播是治理松材线虫病工作的主要任务之一。准确诊断松材线虫病具有重要意义。目前，松材线虫的主要检疫技术是形态学观察，但形态学观察存在以下不足第一，松材线虫与其同属的其他几种伞滑刃线虫之间非常相似。比如，松材线虫与其近缘种拟松材线虫(及腦cro加加)的主要形态学区别在于拟松材线虫的雌成虫有一大约3.5um左右的尾尖突。由于类似的在形态特征上，松材线虫与其他线虫的重叠现象，给准确鉴定带来很大难度。第二，由于自然界的线虫种类丰富多样、线虫虫体微小，要准确鉴定某种线虫需要专业的技术知识和技能，因此在实际检测过程种，经常存在错检、漏检情况。第三，各检疫检査站、检疫口岸截获的一些松木原木、木质包装材料等，由于含水量较少，线虫含量较少，且大多为幼虫，形态学上很难准确鉴定。而为了获得可用于形态鉴定的成虫，一般需培养7-10d，满足不了检疫部门快速检疫的要求。由于形态鉴定的不足，现已有不少学者从遗传学、免疫学、病理学和生理生化等方面试图建立针对该病的快速检测技术，这些技术方法都在一定程度上丰富了松材线虫的检测手段。但这些方法在检测过程中，由于受到线虫的发育阶段、寄主、立地条件以及实验条件等方面造成的差异和限制，在应用的过程中都有一定的局限性。因此，开展松材线虫的分子检测技术，特别是准确、快速、易于掌握的检测技术，对有效控制该病的进一步蔓延和扩散具有重要意义。目前在松材线虫的分子检测方面，主要可分为两大类，一类是传统PCR的方法，譬如，南京农业大学的专利"松材线虫检测试剂盒及其检测方法"(申请号200310106109.5)、云南农业大学的专利"一种松树萎蔫病病原线虫的快速的检测方法"(申请号200510048722.5)和叶建仁等的专利"松材线虫PCR检测特异引物对"(申请号200610039049.3)，以上方法都具有所需仪器设备较多，样品处理复杂，实验环节偏多，不易掌握，容易带入人为误差等特点。另一类是实时荧光PCR的方法，如中国科学院微生物研究所的专利"一种检测松材线虫的方法及其专用引物和探针"(申请号200310109374.9)，以及上海市林业病虫防治检疫站和南京农业大学植物保护学院的专利"松材线虫检测试剂盒及其检测方法"(申请号200510026710.2)，由于以上检测方法所用的引物和探针都来自核糖体rDNA和微卫星DNA，这些DNA序列都极度保守，因而可能导致引物的特异性、稳定性不足。
发明内容本发明所要解决的技术问题是提供一种能准确、快速、灵敏、结果易于判读的松材线虫检测试剂盒。本发明还要解决的一个技术问题是提供采用上述试剂盒检测松材线虫的方法。为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案如下一种松材线虫检测试剂盒，它包括如下成分(1)松材线虫DNA模板和拟松材线虫对照DNA模板；(2)松材线虫特异性引物对和探针正向引物(F):5'ACCATTCGGTTGGCTCTGTT3，反向引物(R):5，CCCTAAGGCGTCGGTGAAC3，荧光探针(P):5'FAM-TAGCTGAGCATCTTTT-TAMRA3，(3)5nLTaqman2xPCRMasterMix;(4)线虫裂解液50mMKCl，10mMTris.Cl，pH8.3，2.5mMMgCl2，0.45%(v/v)NP40，0.45%(v/v)Tween20，80ng/mLProteinaseK。采用上述的试剂盒检测松材线虫的方法，包括如下步骤(1)取线虫样本于20uL的线虫裂解液中，65°0处理lh，95'C处理10min，16,000g离心lmin，取2.5pL上清用于实时PCR检测；(2)PCR反应体系为5nLTaqman2xPCRMasterMix、0.5pL正向引物(F)、0.5pL反向引物(R)、0.5pL荧光探针(P)、2.5nL上清液模板、luL去离子水；(3)上述PCR反应体系于7500PCR仪(AppliedBiosystems)上按以下程序进行PCR反应50。C2min,95°C10min，进入循环95。C15s，55'C33s，72°C33s，共40个循环；设定在72'C延伸步骤收集荧光信号；(4)判断结果待测样品产生荧光增长曲线，说明该样品为松材线虫；反之则不是松材线虫。有益效果由于本发明用的引物和探针来自不同物种中高度保守的Topoisomerase基因的内含子区域，采用该引物对和探针能准确、快速、方便的判别线虫样本、病疫木中是否含有松材线虫，灵敏度达O.Olng模板DNA;该方法能检测包括线虫卵在内的松材线虫所有发育阶段的松材线虫；同时克服了形态学鉴定中对线虫发育阶段的限制；同时也克服了传统上利用松材线虫的rDNA设计引物进行常规PCR和实时PCR检测，可能造成由于引物、探针的极度保守性而出现的检测特异性不足的问题；同时还克服了由传统PCR检测手段带来的操作复杂、技术性强、耗时长、造成环境污染等方面的不足。图1利用引物对TOPO-F/R和探针TOPO-P检测不同线虫结果。图2利用引物对TOPO-F/R和探针TOPO-P灵敏度检测结果。其中，100ng，10ng，lng，0.1ng，0.01ng分别表示不同浓度的松材线虫提纯DNA;NTC表示空白对照。图3利用引物对TOPO-F/R和探针TOPO-PB检测不同发育阶段单条线虫结果。其中，100ng表示100ng松材线虫提纯DNA;Egg，L-2，L-3，L-4表示卵，2龄，3龄，4龄松材线虫幼虫；F表示松材线虫雌成虫；M表示松材线虫雄成虫；A/mYCTOna加S表示拟松材线虫对照。具体实施例方式实施例l:引物和探针的设计本发明在构建松材线虫和拟松材线虫抑制消减杂交的基础上，获得了松材线虫中特异表达的Topoisomerase基因片段。ACAAATCGCTCTCGGCACCTCCAAACTCAACT根据以上序列设计引物XC64F(5TGGCCCTATATTTCATCGACAA3，)和XC64R(5'TCCTTGAGCCTGTCCACTTTT3，)，并用该引物对松材线虫的基因组DNA进行扩增，获得该基因的内含子，序列如下GACGAAGCGGCCGATACTGTGGGTTGTTGCTCGCTGAGATGCGAACATGTCACTTTTATTGATTTAGGCATATGTTTTTGATATAAAAAATTTTTTTTTTCAGATATGTCGTGGATCTTTTCGATCGATTGGATGTAAGTTTTTGGGGAAAAATGTGGTTTTTAGGGGCTGAAATGGGATTCGTACTGCTTATAAGGGCCTAAAGTGGAATTATTTTTGATCTGGAGAGTATTAAATGGGATTAAATGAGATATGTTGATCCTGAAACAGGCTAAAATAAGGTTGATTTTGCTTGAAATTACATAAAATAAGGGTTTTGGAGCTTGGAACAGTCTAAAATAGGGTGAATTGTTTTAAAAACGACCTAAAATAAGGTCAGTTTGCTAGAAATTACGTAACACTCTGAACTCACATCTCCGCTCACTGATGCCCGGCCTCACGGCCAAGGTGTTCCGGCTCAAGGA根据内含子序列设计用于实时荧光PCR的引物对TOPO-F(5'ACCATTCGGTTGGCTCTGTT3，)/TOPO-R(5，CCCTAAGGCGTCGGTGAAC3，)和探针TOPO-P(5，FAM-TAGCTGAGCATCTTTT-TAMRA3，)。将以上引物对和探针用于松材线虫的实时荧光PCR检测。实施例2:松材线虫的检测1、线虫DNA提取分别收集的线虫样本(见表1)于20uL的线虫裂解液中(50mMKCl，10mMTris.Cl，pH8.3，2.5mMMgCl2，0.45%(v/v)NP40，0.45%(v/v)Tween20，80pg/mLProteinaseK)，65°C处理lh，95。C处理lOmin后，16,000g离心lmin，取2.5pL上清用于实时PCR检测。2、实时PCR检测在实时荧光PCR反应管中，加入5pLTaqman2xPCRMasterMix(AppliedBiosystems)、0.5jiLTOPO-F(lOnmol)、0.5pLTOPO-R(lOnmol)、0.5pLTOPO-PB(l(Hunol)、2.5nL上清液模板、luL去离子水。将反应混合液置于实时荧光7500PCR仪(AppliedBiosystems)反应孔上，按以下程序进行PCR反应50。C2min，95。C10min,进入循环95。C15s,55°C33s，72°C33s，共40个循环。设定在72""C延伸步骤收集荧光信号。3、结果判读反应结束后，待测样品产生荧光增长曲线，说明该样品为松材线虫；反之则不是松材线虫。编号16为松材线虫；79为拟松材线虫；10-11为其他线虫；由图1可见只有松材线虫有阳性扩增信号，其他线虫和空白对照均无阳性扩增信号。本发明方法灵敏度检测结果见图2。本发明方法对不同发育阶段单条线虫的检测结果见图3。由图1、图2和图3可知，本发明方法特异性好，灵敏度高，且对不同发育阶段单条线虫都具有较好的检测效果。表l供试中国松材线虫线虫来源<table>tableseeoriginaldocumentpage7</column></row><table>权利要求1、一种松材线虫检测试剂盒，其特征在于，它包括如下成分(1)松材线虫DNA模板和拟松材线虫对照DNA模板；(2)松材线虫特异性引物对和探针正向引物(F)5’ACCATTCGGTTGGCTCTGTT3’反向引物(R)5’CCCTAAGGCGTCGGTGAAC3’荧光探针(P)5’FAM-TAGCTGAGCATCTTTT-TAMRA3’(3)5μLTaqman2×PCRMasterMix(4)线虫裂解液50mMKCl，10mMTris.Cl，pH8.3，2.5mMMgCl2，0.45％(v/v)NP40，0.45％(v/v)Tween20，80μg/mLProteinaseK。2、采用权利要求1所述的试剂盒检测松材线虫的方法，其特征在于它包括如下步骤(1)将线虫放入20uL的线虫裂解液中，65°C处理lh，95。C处理lOmin，16，000g离心lmin，取2.5pL上清用于实时PCR检测；(2)PCR反应体系为5^LTaqman2xPCRMasterMix、0.5^L正向引物(F)、0.5jiL反向引物(R)、0.5nL荧光探针(P)、2.5&上清液模板、luL去离子水；(3)上述PCR反应体系于7500PCR仪上按以下程序进行PCR反应50'C2min，95°C10min，进入循环95。C15s，55'C33s，72°C33s，共40个循环；设定在72。C延伸步骤收集荧光信号；(4)判断结果待测样品产生荧光增长曲线，说明该样品为松材线虫；反之则不含有松材线虫。全文摘要本发明公开了一种松材线虫检测试剂盒，它是以5’ACCATTCGGTTGGCTCTGTT3’为正向引物(F)，5’CCCTAAGGCGTCGGTGAAC3’为反向引物(R)，5’FAM-TAGCTGAGCATCTTTT-TAMRA3’为荧光探针(P)。本发明还公开了采用该试剂盒检测松材线虫的方法。本发明的松材线虫检测试剂盒中的引物和探针具较强的特异性、灵敏性及稳定性，为松材线虫的检测提供了快速、灵敏、特异的方法。文档编号C12Q1/68GK101338342SQ20081012438公开日2009年1月7日申请日期2008年6月30日优先权日2008年6月30日发明者叶建仁,吴小芹,麟黄申请人:南京林业大学