专利名称：：通过使用闭合吸管玻璃化方法低温贮藏人胚泡来源的干细胞的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于玻璃化生物学细胞，特别是胚泡来源的干细胞(BS细胞)的改进方法。所述方法对解冻后仍保持活性的细胞是非常温和的。
背景技术：
：干细胞是具有自我更新和产生特化或分化细胞之独特能力的细胞类型。尽管绝大部分体细胞，例如心脏细胞或皮肤细胞，负责行使特定功能，但干细胞在其接收到发育成特定细胞类型的信号之前功能未定。形成所述干细胞独特性的是其增殖能力以及其发生分化的能力。多年来，研究人员致力于寻找使用干细胞替代受损或病变的细胞和組织的方法。目前，大部分研究集中于两种类型的干细胞，胚胎干细胞和体细胞干细胞。胚胎干细胞来源于胚胎植入前的受精卵母细胞，即胚泡，而所述体细胞干细胞存在于成熟生物体中，例如骨髓、表皮和肠内。根据许多欧洲和其它国家的国家法律，受精卵在植入子宫前即受精后10-14天并不被认为是胚胎，因此当如本发明应用时，这类细胞在此处被称为胚泡来源的干细胞或hBS细胞。多能性检验已显示尽管所述胚胎或胚泡来源的干细胞可产生生物体内的所有细胞，包括生殖细胞，但体细胞千细胞具有更有限的衍生细胞类型集库。1998年，研究人员第一次能从人受精卵母细胞中分离出胚胎干细胞并将其培养在培养基中，参见例如美国专利5843780和美国专利66200806。在干细胞
技术领域：
中越来越多的研究和进展需要获得适合于保存所述细胞和细胞系的方法。细胞可通过玻璃化或冷冻贮藏。由于细胞外冰的形成具有破坏作用，因此使用常规方法的低温贮藏很难应用于复杂和敏感的生物学材料。经过玻璃化过程，含有所述细胞的样品被快速冷却至极低的温度，水容物不结晶而形成的玻璃样态。因此，玻璃化是在无冰晶形成的情况下快速冷冻液体介质的方法。无定形玻璃在直接将例如含有细胞的吸管放入液氮中的快速冷冻过程中形成。所述玻璃保持液体的正常分布但以过冷却的形式保存。所述玻璃避免了水晶并且所述细胞免受与冰晶形成相关的细胞损害。因此，将玻璃化定义为避免晶核形成和生长的无定形玻璃样态的固化。曾经对人胚胎干细胞低温贮藏进行研究并且Reubinoff等人(HumanReproduction,2001,16，2187-2194)描述了通过使用开口抽拉式吸管玻璃化方法进行低温贮藏这些细胞的方法。所述方法的缺点是其涉及到吸管的开口端与液氮接触，这可能会成为将要被玻璃化的生物材料的污染源。此外，由于抽拉吸管的大小，Reubinoff等人进行玻璃化的体积约为ljd。用于避免与氮直接接触的玻璃化方法已在Lopez-Bejar等人(Theriogenology，2002，58:1541-52)对兔胚胎和Chen等人(HumanReproduction,2001,16(11):2350-56)对小鼠卵母细胞的应用中得以描述。这些方法都使用了与已知的开口抽拉吸管相同的抽拉方式并因此而拥有与Reubinoff等人使用的抽拉吸管具有相同大小的封闭抽拉吸管。因此，在这些方法中，各吸管中玻璃化的体积约都为1-2^1。慢速冷冻和快速解冻方法曾用来低温贮藏细胞系。尽管这些方法适合用来低温贮藏例如小鼠胚胎干细胞，但对于未分化的人胚胎干细胞的存活率似乎很低，而且绝大部分所述细胞分化或死亡。通常，用这种慢速冷冻方法玻璃化较大体积的细胞会导致较低的恢复率(Reubinoff等人)。因此，仍就需要发展易于操作、涉及尽可能少的步骤而同时在所7化方法。特别地，需要发展用于细胞或细胞系(例如hBS或hBS细胞系)的较大体积玻璃化的有效方法。发明描述如上所述，有效的低温贮藏方法是胚泡来源的干细胞系产生和广泛应用、并在此之下建立人胚泡干细胞库所必须的。有效的冷冻和解冻技术能够有效地保存细胞和细胞系。为了一些目的，希望在每一根吸管中进行大体积玻璃化。例如当在给定的步骤(或应用)中需要大量况。本发明涉及用于细胞玻璃化的方法，包括i)将细胞转移至第一种溶液(溶液A)中，ii)任选地在第一种溶液中温育所述细胞，iii)将步骤i)或ii)中获得的细胞转移至第二种溶液(溶液B)中，iv)任选地在第二种溶液中温育所述细胞，v)将从步骤iii)或iv)中获得的细胞转移至一个或多个具有允许可在其中包含至少20jil体积大小的闭合吸管，vi)封闭所述一个或多个闭合吸管，和vii)玻璃化一个或多个闭合吸管。上述方法的一个非常重要的特征是每一吸管中可被玻璃化的大体积。本发明涉及用于玻璃化闭合吸管中的细胞的方法，所述闭合吸管具有允许在其中容纳从约20^1至约250^1，例如从约20^1至约225^1，从约25jil至约200^1，从约25nl至约175fil，从约25pl至约150ji1，从约30^1至约125^1，从约30^1至约100^1，从约35jil至约75^1，从约40^1至约50nl体积的大小。在本发明提供的实施例中使用的吸管长度约为13cm，直径约为2mm和约为O.lmm厚的非常薄的塑料管壁(闭合吸管，French迷你吸管，250^1，L，Aigle，IMVZA475。，133mm，SvenskMj61k)。然而，可以想象假设装液氮的容器的大小允许液氮淹没整个吸管的长度，只要吸管的直径和厚度几乎与此处所使用的吸管一样，那么使用更长的吸管就可成功地玻璃化甚至更大的体积。另一个上述方法中非常重要的步骤是使用所谓的闭合吸管。在本上下文中，术语"闭合吸管"用来指在装填位置具有能使例如在合适培养基中的生物学物质(例如细胞或细胞系)装入的开口端的吸管，但在装入后立即紧密封闭该末端以避免来自周围不想要的细胞污染并且也避免不想要的来自细胞的周边污染的风险。吸管两端的气密性封闭对防止样品和环境的污染非常重要。来自CryoBioSystem称为CBSSYMS的手工封闭单元是一种合适的系统。在所述吸管的一边开口而在另一边装有塞子是非常重要的。该塞子允许用注射器吸入空气以使吸管充入液体，但一旦其与液体直接接触则聚合化，在该端封闭毛细管。也可以使用封闭该端的其它合适方法。然后使用密封物(焊接、粘合等)封闭另一端。重要的是壁要薄并且直径要小，以使吸管中的内含物快速冷却。吸管长度并不是太关键，但为实际需要，其长度最好是标准长度，以适合液氮灌中的标准支架。所述吸管由塑料制得，但也可由任何合适的材料包括玻璃(尽管其可能更容易断裂)制得。重要的是所述材料要安全并且不吸收或释放物质，其是无孔、无毒和生物相容性的。在本发明应用中，术语"低温贮藏，，是指在极端低的温度下保存生物学材料。在本发明上下文中所使用的术语"直接接触，，或"直接暴露于，，是指如果生物学材料或所述材料所存在的培养基、溶液或材料的表面与冷冻材料接触时，称生物学材料"直接接触"或"直接暴露"于例如冷冻材料。本发明上下文中所使用的术语"冷冻材料"，是指任何能够造成生物学材料玻璃化的材料。因为样品不直接与冷冻材料接触，理论上可使用任何足够冷的冷冻介质。合适的材料包括但不限于液态气体例如液氮、液态丙烷、液氦、乙烷等。此处所使用的"生活力"是指在一段时间内生物学材料能够正常生9存、发育和增殖。根据本发明，将至少20fil体积的生物学材料(例如hBS细胞或hBS细胞系)置于闭合吸管中。然后将所述闭合吸管暴露于冷冻材料(合适地液氮)中。一旦暴露于冷冻材料，所述细胞开始玻璃化，随后可贮存一段时间并在以后的时期进行解冻。解冻的生物学材料仍保留生活力。如上面所显示，细胞与冷冻材料并没有直接接触或直接暴露。因此，避免了细胞(来自外源)污染以及细胞对环境的污染的风险。本发明的生物学材料是活细胞或细胞系，特别是BS细胞、从BS细胞衍生的BS细胞或细胞。所述细胞可以处在任何发育阶段。优选地，所述细胞来源于动物来源，包括哺乳动物来源，包含但不限于人、非人灵长类例如猴、实验室动物例如大鼠、小鼠和仓鼠、农业牲畜例如猪、羊、母牛、山羊和马。在本发明具有特定目的的实施方案中，所述细胞是包括人BS细胞的人干细胞。用于根据本发明方法的合适细胞是BS细胞或BS细胞系，特别是hBS细胞或hBS细胞系。通过使用此处描述的方法可获得所述细胞或细胞系o至少其中一种玻璃化溶液(第一种和第二种溶液)可含有一种或多种冷冻保护剂或冷冻保护剂混合物。当然非毒性冷冻保护剂是优选的。冷冻保护剂通过减少其它保留在非冻结水中的溶质之摩尔比例协助将收缩减小到最低程度。其抑制水晶的形成，并因此降低水的凝固点。其也可以通过氢与束缚水结合防止蛋白变性。当细胞冷却时，溶剂水转变成细胞外的冰，并且浓度不断增加的细胞外非渗透电解质或非电解质会破坏细胞。当用冷冻保护剂处理时，细胞不会在其达到低得多的温度之前达到非处理细胞的盐浓度。在如此低的温度下化学反应进行得十分緩慢并因此使得对细胞的破坏降到最低程度。通常最好使用冷冻保护剂组合因为不同种类之间可能存在不同。冷冻保护剂也可充当渗透压活性剂。合适的冷冻保护剂可选自1，2-亚乙基二醇、1，2-亚丙基二醇、二甲基亚砜、甘油、丙二醇、糖(包括蔗糖、海藻糖、麦芽糖、乳糖)和甲基戊二醇。包含于第一种和/或第二种溶液中的单个试剂的浓度通常在5-50%v/v范围内，例如，从约5%到约40%v/v,例如从约5%到约25%v/v(第一种溶液)和从约5%到约30%v/v(第二种溶液)。通常，在第二种溶液中冷冻保护剂的总浓度(即按v/v、w/v或M计算)比在第一种溶液中要高。第一种和第二种溶液可包含一种或多种相同或不同的冷冻保护剂。第一种和第二种溶液中的一种或多种冷冻保护剂的浓度可以相同或不同，并且通常在第二种溶液中冷冻保护剂的总浓度高于第一种溶液中的浓度。在本发明特定的实施方案中，所述冷冻保护剂是海藻糖。包含于第一种和/或第二种溶液中的海藻糖浓度通常在约0.02M至约lM的范围内，例如从约0.05M至约0.9M，从约0.1M至约0.8M，约0.2M至约0,7M，从约0.3M至约0，65M，从约0.4M至约0.6M,从约0.45M至约0.55M。通常，蔗糖用于类似的应用中。海藻糖是种独特的、天然产生的二糖，见于数百种植物和动物中。海藻糖是重要的能量来源并且已显示在冷冻期间是稳定生物体的首要因素。已证明海藻糖可降低膜的相变温度以使其甚至在干燥的条件下保持液晶状态。不受限于任何理论，假设这样防止了再水化过程中膜的渗漏，因而保存了细胞生活力。关于蛋白质，已显示海藻糖在细胞处于水合状态时通过从所述蛋白质表面将水逐出以抑制蛋白质变性。在本发明的另一个实施方案中，所述冷冻保护剂是蔗糖。第一种和/或第二种溶液所含的蔗糖浓度通常在从约0.02M至约1M的范围内，例如从约0.05M至约0.9M，从约0.1M至约0.8M,约0.2M至约0.7M，从约0.3M至约0.65M,从约0.4M至约0.6M，从约0.45M至约0.55M。而在本发明的另一个实施方案中，第一和第二种溶液中至少一种含有冷冻保护剂。第一和第二种溶液中至少一个可包含粘度调节剂。用于本文的合适的粘度调节剂可选自菲可(Ficoll)、珀可(Percoll)、透明质酸、清蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸、明胶和甘油。第一和第二种溶液可包含相同或不同的一种或多种粘度调节剂。在笫一和第二种溶液中的一种或多种粘度调节剂的浓度可相同或不同。在本发明特定的实施方案中，所述粘度调节剂是菲可。第一和/或第二种溶液所包含的菲可浓度最高约为150mg/ml，例如最高约为100mg/ml，最高约为50mg/ml,最高约为25mg/ml，最高约为15mg/ml或最高约为10mg/ml。在本发明的一个实施方案中，第一和第二种溶液中至少一种是水性溶液。在本发明特定的实施方案中，包括上述方法中的步骤ii)。由于该步骤旨在促进溶液平衡并确保冷冻保护剂充分扩散，所以可能的时间长度为10秒至20分钟，但如果存在DMSO,不应当将细胞暴露于略有毒性的DMSO中太长时间。通常在约37。C下进行从5秒至约20分钟之间的温育，例如，从约10秒至约15分钟，从约15秒至约10分钟，从约20秒至约7.5分钟，从约30秒至约5分钟，从约40秒至约4分钟，从约50秒至约3分钟，从约30秒至约2分钟，从约45秒至约1.5分钟或l分钟。在进一步实施方案中，也包括了步骤iv)，并且通常在约37。C下进行从5秒至约10分钟之间的温育，例如，从约10秒至约7.5分钟，从约10秒至约5分钟，从约15秒至约4分钟，从约15秒至约3分钟，从约15秒至约2分钟，从约20秒至约1分钟，从约5秒至约1分钟，从约5秒至约30秒或从约10秒至约30秒。在特定的实施方案中，包括步骤iv)，并且在37。C下进行温育约30秒或更短时间。玻璃化方法对细胞非常有效并且温和。通常，约50%或更多例如，约55°/。或更多，约60%或更多，约65%或更多，约70%或更多，约75%或更多，约80%或更多，约85%或更多，约90%或更多或约95%或更多的细胞在去玻璃化后和培养在合适的培养基上后有生活力。此处描迷了合适的去玻璃化方法。在另一方面，本发明也涉及已经历本发明的方法的玻璃化的细12胞。在本发明的进一步实施方案中或另一方面，涉及去玻璃化的方法。去玻璃化包括viii)将一个或多个玻璃化的闭合吸管放入具有从约室温至约40。C的环境中一段时间以使闭合吸管内的内容物解冻，ix)打开一个或多个闭合吸管，x)使用第三种溶液(溶液C)使包含于一个或多个打开的闭合吸管内的细胞接受洗涤，xi)任选地将获自步骤x)的经洗涤的细胞转移至第四种溶液(溶液D)中，和xii)任选地将细胞在第四种溶液中进行温育，xiii)任选地将来自xii)中第四种溶液中的细胞转移并接种在饲养细胞上，和xiv)任选地进一步培养所述细胞。经步骤x)后获得的细胞即可用于任何想要的目的，并且可使用任何步骤以对细胞进一步考察例如生活力。步骤viii)涉及细胞的解冻。此步骤仅仅是解冻吸管中的内容物并且应在对吸管的肉眼观察中进行，因此时间显得并不重要。温度不应超过40。C但可在室温至40°C之间。如果细胞在解冻后没有快速地从水浴中上取出，当解冻所述细胞时较高的温度会诱发热激作用。因此，作为强制步骤，所述方法也包括步骤xi),、xiii)和xiv);和进一步包括步骤xii)。去玻璃化溶液可包含冷冻保护剂，例如具有渗透压活性的冷冻保护剂(例如具有低毒性的渗透压活性剂)，通常避免例如DMSO，并优选地单独地或组合地使用海藻糖和蔗糖。在该溶液中高浓度的二糖防止细胞破裂，否则细胞因突然与不含DMSO的溶液接触会发生破裂。在细胞外所述二糖的存在可防止天然渗透压起作用并给细胞足够的时间排弃存在于细胞内的DMSO(或类似物)，并緩慢地通过水置换之。因此，第三和/或第四种(如果相关)溶液通常包含一种或多种冷冻保护剂。在特定的实施方案中，一种或多种冷冻保护剂选自甘油、海藻糖、蔗糖、1,2-亚乙基二醇、DMSO、丙二醇和/或其混合物，特别是甘油、海藻糖、蔗糖或其混合物适合使用。第三和/或第四种溶液中的冷冻保护剂浓度通常从约0.02M至1M例如从约0.05M至约0.9M，从约0.1M至约0.8M，从约0.1M至约0.7M，从约0.1M至约0.6M,从约0.15M至约0.5M，从约0.2M至约0.4M，并且如果相关，第三种溶液中冷冻保护剂的浓度高于第四种溶液中渗透活性试剂的浓度。通常如果相关，第三种溶液中冷冻保护剂的浓度高于第四种溶液中的冷冻保护剂浓度。下面给出了本发明方法的总述。将人胚泡来源的干(hBS)细胞集落切成小块(0.1-0.4mmx0.1-0.4mm)。在40-50pl体积中高达20(优选地约10个)个细胞小块可被冷冻在闭合吸管中。闭合吸管在一端具有塞子而在另一端开口。在所述细胞小块被吸入吸管内以进行冷冻后，用cryo-PBS封闭具有塞子(阀)的一端而在开口的一端用粘结剂(焊接)和加热封闭装置(Demtek，A/S)进行密封。在冷冻较大量的细胞前进行一轮冷冻和解冻检验。解冻后，将所述细胞小片接种在具有小鼠胚胎饲养细胞(MEF)的培养皿上。将人BS细胞培养至一次传代后进行评估。所有提到的百分比都是v/v。下列描述对合适的方法、溶液、时间段等给出了说明。但是，基于此处的总体描述和指南，本领域技术人员在本发明范围内可对不同的因素进行改变。玻璃化方法一总述制剂于Cryo-PBS(获自VitrolifeAB(Gothenburg,瑞典))的海藻糖构成的母液。2.溶液A:在Cryo-PBS中制备100/0的1,2-亚乙基二醇并进4亍无菌过滤。加入无菌DMSO至终浓度为10%。3.溶液B:在Cryo-PBS中制备含有0.3M海藻糖和20%1,2-亚乙基二醇的A溶液并进行无菌过滤。加入无菌DMSO至终浓度为20%。4.将1ml溶液A和溶液B分别加入四孔板(Nunclon,VWRInternational)中两个分开的小孔中。将板置于37。C下。5.以使用灭菌的拉制的玻璃毛细管(WorldPrecisionInstruments)(或来自Swemed的干细胞切割工具)对细胞进行切割，方法是以进行传代的相同方法切割所选展示恰当形态学的人胚泡来源的干细胞集落。来自Swemed的切割工具是具有25度倾角和200或300微米的腔，设计用来切割、操作和转移hBS集落或部分hBS集落的无菌的锋利的玻璃毛细管。其由SwemedLabInternationalAB，Bilidal，瑞典生产。6.用hBS编号来标记吸管(闭合吸管，Frenchmini-straws,工作体积为250ul，L，Aigle，IMVZA475，133mm，SvenskMjolk)的必需编号并用冷冻编号(即细胞系/日期/签名)标记可见管(visiotubes)。冷冻流程1.使用玻璃毛细管(WorldPrecisionInstruments)或拉制的玻璃移液管(Pasteur，VWRInternational)将要冷冻在吸管中的细胞转移至溶液A中。2.将所述细胞在溶液A中温育1分钟。3.然后将所述细胞转移至一滴(25pl)溶液B中，并在25秒内将细胞转移到另一滴新鲜溶液B(25^1)中。4.将所述细胞在溶液B中温育25秒(最长)。用于第3至第4步骤的优选时间应当尽可能短。155.将lml的注射器(一次性使用的结核菌素注射器，CodanTriplusAB)连接到l-1.5cm硅氧烷管(已灭菌的)上，接着将硅树脂管连接到吸管上具有绵塞的一端(封塞端)。硅氧烷管在吸管和注射器之间起着密封作用。首先，将约2-3cm体积的cryo-PBS吸入至吸管中。然后吸入约l-2cm的空气(参见图1)。6.在立体视显微镜下从溶液B中将2cm柱中的细胞吸入至吸管中。7.吸入l-2cm空气，接着吸入0.5-lcmcryo-PBS(在该端充当额外的塞子)。8.用注射器吸取吸管中的内容物以使cryo-PBS与绵塞接触从而使所述塞子膨胀。9.使用一对镊子将注射器从吸管上取走，并接着用热密封装置对吸管进行焊接封闭。10.将吸管放入可^L管(visiotube)中，然后再放入装有液氮的罐中进行长期贮存。去玻璃化流程一总体流程制剂1.制备由0.2M溶于cryo-PBS的海藻糖构成的母液。2.溶液C:将0.2M溶于cryo-PBS的海藻糖进行无菌过滤。3.溶液D:制备0.1M溶于cryo-PBS的海藻糖并进行无菌过滤。4.将lml溶液C、溶液D和hBS培养基(参见下面)分别放入4孔板(Nunclon，VWRInternational)的单个小孔中并将板置于37。C下温育。[所述hBS培养基包含补充以20%的KNOCKOUT血清替代物和下列成分的KNOCKOUTDulbecco'sModifiedEagle's培养基，所述成分各自的终浓度为青霉素100单位/ml，非必需氨基酸O.lmM,L-谷氨酰胺2mM，卩-石克基乙醇100jiM，人重组bFGF4ng/ml(碱性成纤维细胞生长因子)。快速从DMSO中洗涤解冻的细胞是非常重要的，所述DMSO用于玻璃化溶液中。较少毒性的海藻糖的存在有助于从玻璃化溶液到用于接种细胞的培养基之相对緩慢的逐步改变。所述浓度也可按不同功效进行改变(5-50%v/v,w/w或w/v)。也有可能使用其它具有低毒性的冷冻保护剂。解冻1.从含有液氮的贮存灌中取出含有玻璃化的人BS细胞的闭合吸管并置于含有液氮的小瓶中。2.将所述封闭的吸管在室温下于空气中放置10秒，然后放入40。C的水浴锅中约2秒。用灭过菌的"通用抹布"(allduk)擦干吸管。3.使用灭过菌的剪刀将只有封塞物封闭的吸管的封塞端剪开。使用一块硅管作为封塞物将所述吸管连接到注射器上。然后将吸管在粘结(焊接)处剪开。用注射器内的空气将hBS细胞推入溶液C中。要在相同小孔中洗涤的细胞量应当不超过单根吸管所含的量。4.将所述hBS细胞集落在溶液C中温育1分钟。通常从约1分钟至约20分钟。5.在立体显微镜下，使用玻璃毛细胞管(WorldPrecisionInstruments)或拉制的玻璃移液管(Pasteur,VWRInternational)将hBS细胞集落转移至溶液D中。6.将hBS细胞集落在溶液D中温育5分钟。通常从约5分钟至约30分钟。7.在立体显微镜下使用玻璃毛细胞管(WorldPrecisionInstruments)或拉制的玻璃移液管(Pasteur，VWRInternational)将hBS细胞集落转移至hBS培养基上。8.使用玻璃毛细胞管(WorldPrecisionInstruments)或拉制的玻璃移液管(Pasteur，VWRInternational)在数秒(>5秒)内将所迷集落从hBS培养基上转移并接种在培养皿中小鼠胚胎饲养细胞(MEF)上面。9.将所述培养皿放入培养箱中进一步培养。图表图1:在玻璃化和去玻璃化后解冻恢复人BS细胞系SAOOl。图2:在玻璃化和去玻璃化后解冻恢复人BS细胞系SA002。图3:在玻璃化和去玻璃化后解冻恢复人BS细胞系SA034。图4(A)-(C):在即将玻璃化前培养在小鼠胚胎饲养细胞上的人BS细胞系SAOOl的典型形态学。图5(A)-(C):在去玻璃化后第一次传代时培养在小鼠胚胎饲养细胞上的人BS细胞系SAOOl的典型形态学。图6:在去玻璃化后第18代(A)、第23代(B)、第29代(C)和第35代(D)时培养在小鼠胚胎饲养细胞上的人BS细胞系SAOOl的典型形态学。图7:(A)人BS细胞集落[pl9，(B)SSEA画l[p31，(C)SSEA-3[p31，(D)SSEA画4[p31，(E)TRA-l画60[p31，(F)TRA誦l-81[p31，(G)Oct-4[p311，(H)ALP[p31。图8:玻璃化后细胞系SAOOl的核型。图9:去玻璃化的人BS细胞(SA001)在体外的分化，第29代。(A)卩-IH-微管蛋白，(B)结蛋白，(C)a-甲胎蛋白，(D)HNF-3(3。图10:第19代人BS细胞(SA001)在体内的分化。(A)内胚层(分泌上皮)，(B)中胚层(软骨)，(C)外胚层(神经外胚层)。图11:带有制备用于冷冻的闭合吸管的注射器。本发明在下面的实施例中将得到进一步说明，所述实施例并不以任何方式限制本发明。实施例1:玻璃化hBS细胞制备溶液A和B(溶液A:无菌过滤的10%的1，2-亚乙基二醇、10%的DMSO的cryo-PBS溶液；溶液B:无菌过滤的0.3M的海藻糖、10%的1，2-亚乙基二醇、10%的DMSO的Cryo-PBS溶液)。18以与<吏用干细胞切割工具(SwemedLabsInternational,Billdal，Sweden)切割人胚泡来源的干细胞以进行常规传代的相同方法切割所选展示恰当形态学的人胚泡来源的干细胞集落。所述细胞小块大小应当为约0.1至0.4mmX0.1-0.4mm。首先将所述细胞小块在预热(37°C)的500^1溶液A中温育1分钟，然后转移至25nl溶液B中并温育30秒，然后再次转移至新鲜的溶液B液滴中并温育30秒。所述体积约是40-50^1。将约IO个细胞小块吸入至制备用于玻璃化的吸管中，然后将吸管用粘合剂封闭。将吸管插入液氮中。实施例2解冻玻璃化的人BS细胞制备两种溶液C和D(溶液C:无菌过滤的0.2M海藻糖的Cryo-PBS溶液；溶液D:无菌过滤的0.1M海藻糖的Cryo-PBS溶液)。将溶液C和D以及hBS培养基于37。C预热。从液氮罐中取出含有玻璃化的hBS细胞(约IO个细胞小块)的闭合吸管。将吸管在室温下保持10秒，然后迅速地在40。C水浴锅中(数秒内)解冻。使用一把灭过菌的剪刀将吸管的封塞端剪开并使用注射器将内容物从吸管推入至溶液C中。将所述hBS细胞在500pi溶液C中温育1分钟然后转入500nl溶液D中并温育5分钟。在立体显微镜下将hBS细胞小块在hBS培养基中快速洗涤，然后接种在培养皿中hBS培养基上的小鼠胚胎饲养细胞上面。接着将所述细胞进行培养(于37。C温育)，对已建立的新集落的数目进行计数并进行传代以检验玻璃化后hBS细胞的生活力。经历该玻璃化和解冻步骤后恢复的有生活力的细胞通常在70-100%的范围内。实施例3使用闭合吸管玻璃化和解冻人BS细胞按照实施例1和2中描述的方法对人BS细胞(细胞系SA002,SA121和SA181)进行玻璃化和解冻。在接种在培养皿中小鼠胚胎饲19养细胞上48小时后对hBS细胞集落进行评估和计数。因为最初玻璃化的hBS细胞小块中的每一片都可产生一个集落，所以以有生活力的解冻后的集落(展示合适的hBS细胞形态学的)数目与最初玻璃化的hBS细胞小块数目之间的比例来计算解冻恢复率。制备3根吸管并评估每个细胞系，并且将各单个吸管的结果显示于下面，结果显示恢复率在40%和100%之间。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例4闭合吸管和开口抽拉式吸管之间的直接比较除了同时使用开口抽拉式吸管作为闭合吸管对照外，其余均按照于实施例1和2中描述的方法对人BS细胞(细胞系AS034)进行玻璃化和解冻。很明显，在各开口抽拉式吸管中只有约4个BS细胞小块可被玻璃化。接种在培养皿中小鼠胚胎铜养细胞上面后48小时对hBS细胞集落进行评估和计数。以有生活力的解冻后的集落(表现合适的hBS细胞形态学的)数目与最初玻璃化的hBS细胞小块数目之间的比例来计算解冻恢复率。对每个细胞系都制备了三根吸管并进行了评估，下面显示各单个吸管的结果并且显示从各闭合吸管获得更多有生活力的(绝对数目)同时保持可接受的恢复率之细胞的成果。<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>实施例5在玻璃化培养基中使用海藻糖和蔗糖之间的比较按照实施例l和2中描述的方法，或者除了在玻璃化和去玻璃化培养基中的海藻糖用与所用海藻糖浓度相同的蔗糖替代外，其余均按照实施例1和2所描述的方法，玻璃化和解冻人BS细胞(细胞系SA121)。在接种到培养皿中小鼠胚胎饲养细胞上48小时后，对hBS细胞集落进行评估和计数。以有生活力的解冻后的集落(表现合适的hBS细胞形态学的)数目与最初玻璃化的hBS细胞小块数目之间的比例来计算解冻恢复率。对每个细胞系都制备了三根吸管并进行了评估，下面显示了各单个吸管的结果并且显示在这种情况下在使用海藻糖和蔗糖之间似乎没有显著差异。<table>tableseeoriginaldocumentpage21</column></row><table>实施例6在玻璃化培养基中使用菲可进行玻璃化和解冻人BS细胞除了在玻璃化培养基中使用菲可(0mg/ml、10mg/ml和100mg/ml)夕卜，其余均按照实施例1和2中描述的方法玻璃化和解冻人BS细胞(细胞系SA121)。在接种到培养皿中小鼠胚胎饲养细胞上48小时后，对hBS细胞集落进行评估和计数。以有生活力的解冻后的集落(表现合适的hBS细胞形态学的)数目与最初玻璃化的hBS细胞小块数目之间的比例来计算解冻恢复率。对每个细胞系都制备了三根吸管并进行了评估，并且将各单根吸管的结果显示于下面。闭合吸管人BS细胞系SA121菲可浓度0mg/ml10mg/ml100mg/ml解冻恢复5/57/106/109/96/103/106/103/10一实施例7在玻璃化培养基中使用不同浓度海藻糖之间的比较除了在第二种玻璃化溶液(溶液B)中使用两种不同浓度(0.3M和0.5M)海藻糖外，其余均按照实施例l和2中描述的方法玻璃化和解冻人BS细胞(细胞系SA121)。当溶液B中使用0.3M海藻糖时，溶液C含有0.2M海藻糖并且溶液D含有0.1M海藻糖。当溶液B中使用0.5M海藻糖时，溶液C含有0.4M海藻糖并且溶液D含有0,2M海藻糖。在接种到培养皿中小鼠胚胎祠养细胞上48小时后，对hBS细胞集落进行评估和计数。以可存活的解冻后的集落(表现合适的hBS细胞形态学)数目与最初玻璃化的hBS细胞小块数目之间的比例来计算解冻恢复率。进行两个分别的使用两种不同人BS细胞系的实验。对每个细胞系都制备了三根吸管并进行了评估，并且各单根吸管的结果如下显示。所述结果显示尽管观察到的两种海藻糖状况表现都良好，但溶液B中0.5M的海藻糖似乎比溶液B中0.3M的海藻糖的表现更好。闭合吸管人BS细胞系SA121和SA002海藻糖0.3M0.5M解冻恢复(SA121)6/108/105/109/106/108/8解冻恢复(SA002)5/87/86/88/87/75/722实施例8使用闭合吸管更广泛地评估玻璃化和去玻璃化方法为了评估玻璃化方法的质量，在三种不同的场合使用三种不同的人BS细胞系(SAOOl、SA002和AS034)对大量人BS细胞进行玻璃化(如上述实施例1中所描述的)。在各场合下各细胞系有>100支吸管被玻璃化。从这些批量的吸管中随机地选择8至10支进行去玻璃化(如上述实施例2中所描述的)并接种在分开的培养皿中的小鼠胚胎饲养细胞上面。在各培养皿中确定接种的hBS细胞团以及附着、增殖以及表现合适形态学的hBS细胞团的数目。所述结果显示于图1、2和3中并且显示每支吸管产生有生活力的hBS细胞集落，按照标准方法将所述hBS细胞集落进行传代并描述其特征。实施例9玻璃化和解冻前后人BS细胞的典型形态学图4显示玻璃化前人BS集落(细胞系SA001)的典型形态学。去玻璃化和接种后，有生活力的集落增殖并表现未分化的人BS细胞的形态学特征(图5)。随后，按照标准方法将这些细胞进行繁殖和传代并且将人BS细胞集落的代表性说明显示于图6。在人BS细胞系SA002和AS034中获得了类似的结果(数据未显示)。实施例10在闭合吸管中接受玻璃化和去玻璃化的人BS细胞的后继特征为了验证人BS细胞在玻璃化和去玻璃化过程后完全恢复和展现合适的特征，对hBS细胞进行广泛的特征描述。这包括表面抗原表达分析、核型分析和体外以及体内的多能检验。通过使用人BS细胞系SA001获得下面的结果，并且通过4吏用人BS细胞系SA002和AS034也可获得类似的结果(数据未显示)。^:为VA#/^5"细^^逸欢必夢染悉23将培养在小鼠胚胎饲养细胞(MEF)上的去玻璃化的人BS细胞(细胞系SA001)在PFA中进行固定，接着用TritonX-100进行穿孔。在连续的洗涤和封闭步骤后，将所述细胞用一抗(按说明)进行温育。随后用缀合的二抗进行检测。通过DAPI染色显示核。按照厂商(SigmaDiagnostics,Stockholm,Sweden)提供的说明书使用商业购得的试剂盒确定碱性磷酸酶(ALP)的活性。所进行的各分析中的传代编号标示于图7中的图例说明括号中。如图7所表明的，所述结果显示人BS细胞对SSEA-3、SSEA画4、TRA-l-60、TRA-1-81、Oct-4和ALP显示阳性染色并且与未分化的人BS细胞相符，其对SSEA-1呈阴性。将进行核型分析的培养在MEF上的去玻璃化的人BS细胞(SAOOl系)在花萼海绵诱癌素A存在的情况下进行温育，然后用细胞培养基进行洗涤。通过离心收集细胞并使用乙醇和冰醋酸进行固定。使用胰蛋白酶-姬姆萨染色显示染色体。如图8中所显示的，所迷结果常。、、，，乂；端在雜活扭为了分析端粒酶活性，按照厂商的说明书使用TeloTAGGG端粒酶PCRELISAPLus试剂盒(Roche,Basel,Switzerland)。所述测定使用端粒酶的内部活性，通过PCR扩增所述产物并用酶联免疫吸收测定(ELISA)对其进行检测。在玻璃化后对人BS细胞系SAOOl进行分析并培养在小鼠饲养细胞上，并且发现其表现出高端粒酶活性。HBS细胞中的高端粒酶活性与其在培养中无限分裂能力有关。#粉必为考察去玻璃化的人BS细胞的多能性，用干细胞切割工具(SwemedLab，Gteborg，Sweden)将来自细胞系SAOOl的未分化集落转移至悬浮培养物中以允许胚泡体(Eb)形成。接着，将Eb涂覆在组织培养皿中，并且同时使用抗p微管蛋白(外胚层)、结蛋白(中胚层)，a曱胎蛋白和HNF-3P(内胚层)的抗体对分化的细胞进行免疫组织化学估测。同时也观察到组装成心肌细胞的收缩细胞(未显示)。总体说来，这些结果表明经受玻璃化和去玻璃化过程的人BS细胞保持着其在体外分化成代表三种不同胚层的细胞的潜能(即其保持多能性)。所述结果示于图9。为了考察去玻璃化人BS细胞的多能性，将未分化的细胞(细胞系SA001)通过手术置于具有严重免疫缺陷(SCID)小鼠的肾囊下。8周后杀死小鼠切除肺瘤并在PFA中固定。为了确定来自所有三个胚层的组织的存在，对苏木精-依红染色的石蜡切片进行组织学估测。如图10中所表明的，经过玻璃化和去玻璃化过程的人BS细胞在体内保持着其分化成代表所述三个不同胚层的细胞的潜能(即，其保持多能性)。-用于建立可用于玻璃化方法的细胞的一般方法用于建立适合于用于本发明方法的人hBS细胞的方法。在2003年7月10日以WO03/055992(相同的申请人)公开的PCT申请中，描述了用于建立hBS细胞的合适方法。在本发明的一个方面，通过WO03/055992中要求保护的方法获得所使用的细胞(在此引用作为参考)。用于建立来自受精卵母细胞的多能性人胚泡来源的千细胞或细胞系的方法包括步骤i)任选地使用受精的卵母细胞(具有1或2级)以获得胚泡(任选地具有A或B级)，ii)用伺养细胞与胚泡共培养以建立一个或多个内细胞团细胞集落，iii)通过机械解剖分离内细胞团细胞，iv)将内细胞团细胞与饲养细胞共培养以获得胚泡来源的干细胞系。V)任选地，繁殖所述胚泡来源的干细胞系。使用作为该方法的起始材料的受精卵母细胞。受精卵母细胞的质量对所获得的胚泡的质量非常重要。所述方法的步骤i)中的人胚泡细胞可来源于冷冻的或新鲜的体外受精的人卵母细胞。下面描述了用于选择用于WO03/055992的方法之合适卵母细胞的方法。已发现本发明的重要成功标准是对卵母细胞的恰当选择。因此，如果只使用3级卵母细胞，获得满足一般要求(描述于下面)的hBS细胞系的概率就很低。捐赠的新鲜受精卵母细胞在第0天将所述卵'母细胞吸入Asp-100(Vitrolife)，并在第1天于IVF-50(Vitrolife)中受精。根据第3天的形态学和细胞分裂评估所述受精卵母细胞。下列等级用于受精卵母细胞的评估l级受精卵母细胞平滑的卵裂球，无碎片2级受精卵母细胞<20%碎片3级受精卵母细胞>20%碎片在第3天评估后，将1级和2级的受精卵母细胞进行移植或冷冻贮藏。将3级受精卵母细胞转移至ICM-2(Vitrolife)。将所述受精卵母细胞进一步培养3-5天(即受精后5-7天)。根据下面的等级评估所述胚泡A级胚泡在第6天具有明显的内细胞团(ICM)扩增B级胚泡无扩增但类似A级C级胚泡无可见ICM捐赠的冷冻受精卵母细胞在第2天(受精后)用Freeze-试剂盒(Vitrolife)将所述受精卵在四细胞期进行冷冻。将冷冻的受精卵母细胞贮存在液氮中。在5年期限界满之前从捐献者获得知情同意。使用Thaw试剂盒(Vitrolife)解冻所述受精卵母细胞，并且从第2天起进行上述方法。如上面所述，新鲜受精卵母细胞来自3级质量，而冷冻受精卵母细胞来自l级和2级。根据通过已建立的方法荻得的数据，发育成胚泡的新鲜受精卵母细胞的百分比是19%，而50%的冷冻受精卵母细胞发育成胚泡。这意味着可能由于受精卵母细胞质量更高的原因，所述冷冻受精卵母细胞可更好地获得胚泡。11%的来源于新鲜受精卵母细胞的胚泡发育成干细胞系，而15。/。的来源于冷冻受精卵母细胞的胚泡发育成干细胞系。总之，在进行培养的受精卵母细胞中2%的新鲜受精卵母细胞发育成干细胞系，而进行培养的冷冻受精卵母细胞中有7%发育成干细胞系。在进行本领域熟知的方法后将受精卵母细胞培养至胚泡阶段。在Gardner等人的Embryoculturesystems，Trounson，A.O.和Gardner,D.K.(编著)的Handbookofinvitrofertilization,第二版，CRCPress,BocaRaton，第205-264页；Gardner等人的FertilSteril，74,增刊3,0-086;Gardner等人的HumReprod，13，3434,3440;Gardner等人的JReprodImmunol(即将发表)；和Hooper等人的BiolReprod，62，增刊1,249中可查到用于制备胚泡的方法。在步骤i)中任选地来源于具有1或2级受精卵母细胞的胚泡建立之后，将具有A或B级的胚泡与饲养细胞共培养以建立一个或多个内细胞团细胞集落。在涂覆在饲养细胞上后，监控其生长并且当所述集落大到足以进行人工传代(约涂覆后1-2周)时，可将所述细胞从其它类型细胞中切开并置于新的饲养细胞上培养以展平。通过使用玻璃毛细管作为切割工具，对内细胞团细胞进行机械切割分离。可通过显微镜可容易地对内细胞团细胞进行检测，并且因此不必用酶和/或抗体对卵母细胞进行任何处理以损害或除去滋养外胚层。因此，WO03/055992的方法减少对免疫切除法的需要。通过比较使用免疫切除法对比保持滋养外胚层完整的本发法的成功率，已发现避免免疫切除法的更简单、更快速和无创伤的方法比免疫切除法更有效。这些方法使得制备干细胞和分化这些细胞系在商业上可行。从总共122个胚泡中建立了19个细胞系(15.5%)。通过免疫切除法处理了42个胚泡并且其中6个成功地建立起细胞系(14%)。通过本发明方法处理80个胚泡并且建立了13个细胞系(16%)。随后分割内细胞团，将所述内细胞团与伺养细胞共培养以获得胚泡来源的干(BS)细胞系。在获得hBS细胞系后，任选地繁殖所述细胞系以扩增细胞量。因此，胚胞来源的干细胞系可通过例如每隔4-5天对所述干细胞系传代来进行繁殖。如果所述干细胞在传代前培养超过4-5天，不想要的细胞分化的可能性就会增加。在此处已建立的实施例5中提供了在伺养培养系统中对细胞进行传代的特殊方法。人BS细胞系可分离自天然孵化的胚泡或来自具有完整透明带的扩张的胚泡。在上述方法中步骤i)的胚泡是天然孵化的胚泡。孵化的胚泡滋养外胚层可保持完整。可将孵化的胚泡或具有去除或部分去除透明带的胚泡置于灭活的饲养细胞上。在步骤ii)之前通过用一种或多种酸性试剂例如ZDTM-10(Vitrolife，Gothenburg,Sweden)、一种或多种酶或酶的混合物例如链霉蛋白酶处理至少可对胚泡的透明带进行部分降解或化学起褶。对具有完整透明带的胚泡进行短暂的链霉蛋白酶(Sigma)处理导致所述带的消除。也可使用具有与链霉蛋白酶相同或相似蛋白酶活性的其它类型蛋白酶。在链霉蛋白处理后可将胚泡涂覆在所述的灭活的饲养细胞上。在本发明的实施方案中，可在改善胚泡和/或内细胞团细胞(如果相关)对饲养细胞的附着的试剂中进行步骤ii)和/或步骤iv)。用于该目的的合适物质是透明质酸。用于将胚泡涂覆在饲养细胞上的合适培养基可以是补充有透明质酸的hBS培养基，所述透明质酸似乎可促进所述胚泡在铜养细胞上的附着和内细胞团的生长。透明质酸(HA)是关节中细胞外基质的重要粘多糖成分。其似乎通过与至少两种细胞表面受体CD44和用于HA介导的运动性(RHAMM)的受体以及与细胞外基质中的蛋白的结合相互作用来发挥其生物学效应。在hBS细胞建立过程中HA的正效应可通过其与细胞膜中磷脂的表面活性极性头部的相互作用来发挥，从而稳定所述表面活性剂层并因此而降低内细胞团或胚泡的表面28张力，所述表面张力的降低可导致与饲养细胞结合效率的增加。可选择地，HA可与其在内细胞团或胚泡上的受体结合和/或与饲养细胞结合并发挥其正向影响内细胞团附着和生长的生物学效应。因此，其它可改变流体表面张力的试剂或其它影响胚泡与饲养细胞之间相互作用的方式也可用来替代透明质酸。在上述方法中所述饲养细胞的培养对hBS细胞系的建立非常重要。胚泡来源的干细胞系的繁殖可包括至多3次饲养细胞传代，例如至多2次。适合用于本发明方法的饲养细胞是例如胚胎或成熟体来源的成纤维细胞。在本发明的方法中应用于步骤ii)或iv)的伺养细胞可以是相同的也可以是不同的并且来源于动物来源例如任何包括人、小鼠、大鼠、猴、仓鼠、青蛙、兔等的哺乳动物。来自人或小鼠的饲养细胞是优选的。另一个获得满足一般要求的hBS细胞系的重要标准是进行胚泡培养的条件。因此可通过使用低于约每cm260,000个细胞，例如低于约每cm255,000个细胞或低于约每cm250,000个细胞的密度的饲养细胞来培养干细胞以对胚泡来源的干细胞系进行增殖。在特定的实施方案中，胚泡来源的干细胞系的增殖包括用约每cm245，000个细胞的密度的伺养细胞来培养所述干细胞系。这些值应用于在使用小鼠伺养细胞的情况下并且预期在其它类型的饲养细胞中也可发现合适的密度。基于本发明的发现，本领域技术人员将能找出这样的合适密度。活。、…，。，'、通过上述建立方法获得的胚泡来源的干细胞系在合适的时间段内保持自我更新和多能性，并且因此在合适的时间段内是稳定的。在本上下文中术语"稳定"是指在有丝分裂灭活的胚胎伺养细胞上培养时在未分化状态下具有超过21个月的增殖能力。通过上述建立方法获得的干细胞系满足一般要求。因此，所述细胞系i)表现出在有丝分裂灭活的胚胎饲养细胞上培养时在未分化状态下具有超过21个月的增殖能力，和ii)表现出正常的整倍体染色体核型，和m)保持在体外和休内发育成所有类型胚层的衍生细胞的潜能，和iv)表现至少两种下列分子标记OCT-4、碱性磷酸酶、糖类表位SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81和由单克隆抗体GCTM-2识别的硫酸角质素/硫酸软骨素细胞外周基质蛋白聚糖的蛋白核心，和v)不表现分子标记SSEA-1或其它分化标记，和vi)保持其多能性和当注射入无免疫应答的小鼠时在体内形成畸胎瘤，和vii)能够分化。通过下列标准确定通过上述方法获得的未分化hBS细胞其分离自人的植入前受精卵母细胞即胚泡，并且表现出在有丝分裂灭活的祠养细胞上培养时在未分化状态下的增殖能力；其表现正常的染色体核型；其表达未分化hBS细胞的典型标记，例如OCT-4、碱性磷酸酶、糖类表位SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81和由单克隆抗体GCTM-2识别的硫酸角质素/硫酸软骨素细胞外周基质蛋白聚糖的蛋白核心，并且显示没有任何糖类表位SSEA-1或其它分化标记的表达。此外，体外和体内(畸胎瘤)多能性检验表明可分化成所有胚层的衍生细胞。如上所述，所述方法提供了基本上纯的多能性人BS细胞制备物，所述人BS细胞制备物i)表现出在有丝分裂灭活的胚胎饲养细胞上培养时在未分化状态下具有超过21个月的增殖能力；ii)表现出正常的整倍体染色体核型；iii)保持在体外和体内都发育成所有胚层的衍生细胞的潜能；iv)表现至少两种下列的分子标记OCT-4、碱性磷酸酶、糖类表位SSEA-3、SSEA-4、TRA1-60、TRA1-81和由单克隆抗体GCTM-2识别的硫酸角质素/硫酸软骨素细胞外周基质蛋白聚糖的蛋30200810166782.0白核心；v)不表现分子标记SSEA-l或其它分化标记，和vi)保持其多能性并且当注射入无免疫应答的小鼠时在体内形成畸胎瘤，和vii)能够分化。在Gage，F.H.的Science,287:1433-1438(2000)中可找到用于检测细胞标记的方法。这些方法对本领域技术人员来说是众所周知的并且包括方法例如RT-PCR或免疫学测定，在所述免疫学测定中使用针对所述细胞标记的抗体。下面描述用于检测细胞标记的方法、杂交方法、核型分析、用于测量端粒酶活性和畸胎瘤形成的方法。这些方法可用于调查根据所述建立方法荻得的hBS细胞是否满足上述标准。^嫂邀欢/么^对继续培养的hBS干细胞的分化状态进行例行监控。用于监控未分化hBS细胞的细胞表面标记是SSEA-1、SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-60、TRA-l-81。在4。/。PFA中固定人BS干细胞，接着用0.5%的TritonX-100穿孔。在洗涤和用10%干牛奶封闭后，用一抗温育所述细胞。在大致洗涤后用二抗温育所述细胞并且用DAPI染色显示细胞核。减遂碌遂雜按照厂商(SigmaDiagnostics)的说明书〗吏用商业购得的试剂盒确定碱性磷酸酶的活性。通过使用RT-PCR和基因特异性引物对(5隱CGTGAAGCTGGAGAAGGAGAAGCTG，5'-CAAGGGCCGCAGCTTACACATGTTC)以及作为管家基因的GAPDH(5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC，5，画TCCACCACCCTGTTGCTGTA)测量转录因子Oct-4的mRNA水平。在一轮FISH中用染色体特异性探针筛选一个或多染色体。该技术可检测出大量遗传畸变(如果存在)。为进行该分析CTS使用了含有用于染色体13、18、21和性染色体(X和Y)的探针的商业购得的试剂盒(Vysis.Inc，DownersGrove，IL，USA)。对于每个细胞系至少分析200个细胞核。将所述细胞悬浮于Carnoy，s固定剂中并滴到带正电荷的载玻片上。将探针LSI13/21与LSI杂交緩冲液混合并加到所述载玻片上并用盖玻片盖上。将探针CEPX/Y/18与CEP杂交緩冲液混合并以相同的方法加到另一载玻片上。于70。C下变性5分钟，接着在湿盒中于37。C杂交14-20小时。经过三个洗涤步骤后用DAPIII对细胞核进行染色并将所述栽玻片在装配有合适滤镜和软件的倒置显微镜(CytoVision,AppliedImaging)下进行分析。核型分析核型分析允许对所有染色体以直接的方式进行研究并且提供非常丰富的信息，可检测到大量和更大结构上的畸变。为了检测镶嵌现象，至少需要30个核型。然而，该技术非常费时并且技术复杂。为了改善用于测定的条件可通过用导致细胞阻止在中期的秋水仙酰胺、秋水仙素的合成类似物和微管解聚试剂提高有丝分裂指数，但仍需要大量细胞的提供(6乂106细胞/分析)。将细胞在0.1ng/ml秋水仙酰胺存在的情况下温育1-2小时，然后用PBS洗涤并用胰蛋白酶消化。通过以1S00rpm离心10分钟收集所述细胞。用乙醇和冰醋酸固定所述细胞并用改进的Wrights对染色体进行染色观察。化較差厉遂杀it比较基因组杂交(CGH)是对核型分析的补充。CGH产生更高的染色体分辨率并且在技术上具有较小的挑战性。在DNA、A4、Texas红dUTP/FITC12-dUTP和DNA聚合酶1的混合物中对分离的DNA进行切口平移。进行琼脂糖凝胶电泳以控制所得的DNA片段大小(600-2000bp)。将检验和参照DNA进行沉淀并重新悬浮于包含甲酰胺、葡聚糖硫酸酯和SSC的杂交混合液中。在湿盒中于37。C下在具有中期相的变性玻璃载玻片上进行杂交。在大致洗涤后加入一滴抗衰减封固混合物(vectashield,O.lng/mlDAPIII)并用盖玻片将所述32载玻片盖上。然后在显微镜下并用图象分析系统对载玻片进行估测。裙在凝活'^因为高端粒酶活性已被确定为hBS细胞6的标准，因此在所述hBS细胞系中测量端粒酶活性。已知当细胞达到更多的分化状态时端粒酶活性持续降低。因此对所述活性的定量必须涉及更早的代数和对照样品，并且可用作检测分化的工具。所述方法，TelomerasePCRELISA试剂盒(Roche)使用端粒酶的内切活性，通过聚合酶链式反应(PCR)扩增所述产物并用酶联免疫吸收测定法(ELISA)对其进行检测。根据厂商说明书进行所述测定。来自该测定的结果通常显示hBS细胞具有高端粒酶活性(>1)。所述细胞系保持其多能性并且当注射入无免疫应答的小鼠时在体内形成畸胎瘤。此夕卜，在体外这些细胞可形成hBS细胞来源的小体。在这两个模型中，可发现所有胚层的细胞特征。^^缺潜V、處分析人BS细胞系是否已保持多能性的一个方法是将所述细胞异种移植至免疫缺陷小鼠以获得肿瘤、畸胎瘤。在所述肺瘤中发现的各类组织应当代表所有三个胚层。已有报道显示来源于异种移植免疫缺陷小鼠的肿瘤的各种组织，例如横紋肌、软骨和骨(中胚层)、肠(内胚层)和神经莲座(外胚层)。还有，大部分肿瘤由杂散(disorganized)的组织构成。严重的组合免疫缺陷(SCID)小鼠(缺乏B和T淋巴细胞的林系)被用于畸胎瘤形成的分析。通过手术将人BS细胞置入睾丸中或肾嚢下。在睾丸或肾中，以10000至100000个细胞的范围移植hBS细胞。理想地，每次对每个细胞系使用5-6只小鼠。初步结果显示雌性小鼠在术后比雄性小鼠稳定并且在肾中和在睾丸中进行异种移植在产生肿瘤方面效果相同。因此，雌性SCID小鼠畸胎瘤模型是优选的。所述肿瘤通常在约1个月后表现明显。在1-4个月后杀死小鼠和解剖肿瘤，并固定用于石蜡或冷冻切片。然后通过免疫组织化学方法对所述肿瘤组织进行分析。使用针对所有三种胚层的特定标记。目前使用的所述标记是用于区分小鼠组织和人肿瘤组织的E-钙粘着蛋白、a-平滑肌肌动蛋白(中胚层)、a-甲胎蛋白(内胚层)和p-III-微管蛋白(外胚层)。此外，为了一般形态学观察进行苏木精-依红染色。在下列"建立实施例，，中对所述建立方法进行描述。此处包括的实施例仅用作说明目的并不以任何方式限制本发明范围。此处描述的一般方法对本领域技术人员来说是众所周知的并且所有反应物和緩沖液是很容易获得的，可商业购得或容易地根据本领域技术人员掌握的已建立好的实验方案制备而来。所有的温育都在37。C下，在C02气体中进行。所使用的一种合适的培养基称作"BS细胞培养基"或"BS培养基，，并且可包含补充以20%的KNOCKOUT血清替代物和下列成分的KNOCKOUTDulbecco'sModifiedEagle's培养基，所述成分各自的终浓度为青霉素100单位/ml,链霉素50ng/ml，非必需氨基酸O.lmM，L谷氨酰胺2mM，卩-硫基乙醇100nM，人重组bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)4ng/ml。另一种合适的培养基是"BS细胞体培养基"，其组成如下补充以20%的KNOCKOUT血清替代物和下列成分的KNOCKOUTDulbecco'sModifiedEagle's培养基，所述成分的各自终浓度为青霉素50单位/ml,链霉素50ng/ml，非必需氨基酸0.1mM，L谷氨酰胺2mM,P-硫基乙醇100pM。在本上下文中术语"稳定，，是指当在有丝分裂灭活的胚胎饲养细胞上培养时在未分化状态下具有超过21个月的增殖能力。建立实施例建立实施例1建立来自天然孵育的胚胞的基本纯净的未分化干细胞制备物人胚泡来源于冷冻或新鲜的人体外受精的胚胎。将天然孵育的胚泡直接置于hBS细胞培养基(补充以20%的KNOCKOUTSerum替34代物和下列成分的KNOCKOUTDulbecco，sModifiedEagle's培养基，并且所述成分各自的终浓度为青霉素50单位/ml,链霉素50ng/ml,非必需氨基酸0.1mM，L谷氨酰胺2mM，p-硫基乙醇100jiM,人重组bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)4ng/ml)中的伺养细胞(EF)上，补充以0.125mg/ml透明质酸。在将所述胚泡涂覆在EF细Jfe上后，监控其生长并且在涂覆约1-2周后集落大到足以人工传代时将所述内细胞团细胞从其它细胞类型中切开并且通过培养在新的EF细胞上进行扩增。建立实施例2建立来自具有完整透明带的胚泡的未分化干细胞的基本纯化的制备物对于具有完整透明带的胚泡，在将所述胚泡直接置于补充有透明质酸(0.125mg/ml)的hBS培养基中的EF细胞层上后，在rS2(ICM-2)培养基中(Vitrolife，Gothenburg,Sweden)使用链霉蛋白酶(10U/ml，Sigma)进行短暂温育以降解透明带。建立实施例3对碱性磷酸酶进行组织化学染色收获所述细胞以进行RT-PCR和组织学(碱性磷酸酶)以及免疫细胞化学分析(参见下面)。分离RNA和进行RT-PCR。按照厂商的推荐使用RneasyMini试剂盒(Qiagen)制备总细胞RNA。使用用于RT國PCR的AMVFirstStrandcDNASynthesis试剂盒(Roche)进行cDNA合成并且使用PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen)进行PCR。按照厂商的推荐使用商业购得的试剂盒(Sigma)对碱性磷酸酶进行组织化学染色。建立实施例4制备和培养hBS细胞系将小鼠胚胎成纤维细胞培养在组织培养皿中的EMFI培养基上DMEM(Dulbecco，sModifiedEagle's培养基)，补充以10%FCS(胎牛血清)、0.1nM(5-硫基乙醇、50单位/ml青霉素、50ng/ml链霉素和2mML-谷氨酰胺(GibcoBRL)。使用丝裂霉素C(10ng/ml，3小时)对所述祠养细胞进行有丝分裂灭活。通过人工切割将人BS细胞集落置于灭活的小鼠胚胎成纤维饲养细胞上进行扩增。将人BS细胞培养在具有hBS细胞培养基的组织培养皿中的有丝分裂灭活的小鼠胚胎成纤维饲养细胞上，所述培养基是补充以20%的KNOCKOUT血清替代物和下列成分的KNOCKOUTDulbecco'sModifiedEagle's培养基，所述成分各自的终浓度为青霉素50单位/ml，链霉素50pg/ml，非必需氨基酸0.1mM，L谷氨酰胺2mM，p-疏基乙醇100nM，人重组bFGF(碱性成纤维细胞生长因子)4纳克/ml。传代7天后所述集落大到足以产生BS细胞小体。用玻璃毛细胞管将BS细胞集落切成0.4X0.4mm的小块并涂覆在含有BS细胞小体培养基的非粘附性细胞培养皿中，所述培养基包括补充以20%的KNOCKOUT血清替代物和下列成分的KNOCKOUTDulbecco'sModifiedEagle's培养基，所述成分各自的终浓度为青霉素50单位/ml,链霉素50ng/ml，非必需氨基酸O.lmM，L谷氨酰胺2mM和j3-硫基乙醇100nM。所述BS细胞小体(包括嚢状hBS细胞小体)在7-9天内形成。建立实施例5hBS细胞传代在传代前使用NikonEclipseTE2000-U倒置显微镜(10X物镜)和DXM1200的数码相机对所述hBS细胞进行拍照。每隔4-5天对集落进行传代。当所述集落可被切成小块(0.1-0.3X0.1-0.3mm)时其便大到足以进行传代。当所述细胞第一次传代时，其已经培养了1-2周并且可以;陂切成约4片。将所述集落在立体显微镜下逐个地聚焦并根据上述大小在小方格36图案上进行切割。只对内部均一的结构进行传代。用切挪动各集落方块，将其吸入毛细管并置于新的饲养细胞(最多4天大小)上。将10-16个方块均匀地放在每个新IVF培养皿中。将培养亚放置5至10分钟以使所述细胞可粘附在新的饲养细胞上，然后再放入培养箱中。每周换三次hBS培养基。如果对集落进行传代，在该特定周更换两次培养基。通常进行"半更换"，其是指只吸出一半的培养基并用等量的新鲜的、温和的培养基替代。如果需要可将整个体积的培养基进行更换。建立实施例6玻璃化hBS细胞切割具有适当的未分化形态学的来自所述细胞系的集落以进行传代。将100-2O0ml液氮无菌过滤至足够量的冷冻管中。制备两种溶液A和B(A:800fil具有1M海藻糖的CryoPBS,100^11，2-亚乙基二醇和100nlDMSO，B:600^1具有1M海藻糖的PBS，200^11,2-亚乙基二醇和200nlDMSO)并将所述集落置于A中进行l分钟和置于B中进行25秒。使用闭合吸管贮存所述冷冻集落。在将所述集落转移至吸管中后，迅速将其放入装有无菌过滤液氮的冷冻管中。建立实施例7接种胚胎小鼠饲养(EMFi)细胞通过在37°C下用含有丝裂霉素C的EMFi培养基温育3小时对所述细胞进行灭活。用明胶覆盖IVF培养皿。吸入所述培养基并用PBS洗涤所述细胞。用胰蛋白酶替代PBS以分离所述细胞。温育后，用EMFi培养基停止胰蛋白酶活性。然后通过离心收集所述细胞，在EMFi培养基中按1:5稀释，并在Burker小室中进行计数。将所述细胞稀释至终浓度为170K细胞/mlEMFi培养基。用lml细胞悬浮液替代IVF培养皿中的明胶并放入培养箱中。接种后的第二天更换EMFi培养基。37用于将hBS细胞有效地将由饲养细胞支持的hBS细胞转移至无饲养细胞培养体系中和在无饲养细胞条件下长期繁殖hBS细胞的方法可将本发明所使用的hBS细胞培养在无饲养细胞培养体系中，与已知方法相比所述方法优势在于被转移细胞在至少高达10次的传代中保持稳定。Richards等人的研究显示hBS细胞系在未分化状态下不能在无细胞基质(包括MatrigelTM)中繁殖超过6次传代。然而，所述hBS细胞可在Matrigel中稳定高达35次传代，甚至在冷冻/解冻周期后仍然表达未分化hBS细胞的标记并且生长速度保持大致相当。此外，当机械分离与酶分离相比较时，在涂覆2天后观察到显著更高数目的存活集落。关键的步骤似乎是将所述hBS细胞转移至无饲养细胞培养体系的最初步骤。因此，下面描述用于将hBS细胞转移至无饲养细胞培养体系的方法，其中将所述hBS细胞从饲养细胞中机械地切出。在此处的无饲养细胞实施例中，只使用各集落的中间部分，尽管在Xu等人先前的工作中整个集落冒着被带有饲养细胞的培养基污染的风险通过酶处理被进行分离。此外，在非常精细的将饲养细胞培养的hBS细胞转移至无伺养细胞的表面上的步骤中，酶的使用造成涉及细胞粘附和生长的重要表面分子的失活。Matrigel中的主要成分是细胞外基质蛋白，例如IV类胶原蛋白和层粘连蛋白。据信当与细胞外基质蛋白结合时细胞表面的整联蛋白的活性成为调节细胞粘附、存活和繁殖的关键步骤。例如，在胶原蛋白受体中整联蛋a在体内和体外调节胶原基质中的细胞增殖方面都具有独特的作用。可能由hBS细胞大量表达的整联蛋白a6和pi形成的层粘边蛋白特异性受体也可在hBS细胞粘附至基质表面中起着主要作用。因此，有一种可能是在所述细胞已适应新的表面之前所述最初强烈的胶原蛋白酶IV处理不利地影响了一些起着附着或存活作用的重要表面受体。在此处的实施例中在关于细胞粘附、存活率和繁殖方面考察了通过机械或酶促分离将hBS细胞转移至无饲养细胞环境中的不同技术。此外，发展了用助于长期繁殖和大规模生产未分化的hBS细胞的纯系群体的方法。同样也考察了用于冷冻/解冻hBS细胞的常规冷冻保存技38术的用途。勿應摔移^尤辨#勿應伴^斧症在切开内细胞团后，将所述内细胞团与饲养细胞共培养以获得胚泡来源的干(BS)细胞系。在获得hBS细胞系后，任选地繁殖所述细胞系以增加细胞的量。在无饲养细胞体系中对hBS细胞进行繁殖前，可将所述hBS细胞转移至无饲养细胞体系。如之前在此处所提到的和在无饲养细胞实施例中所证明的，成功转移至无伺养细胞培养体系中的方法。因此，必须通过机械切割将所述hBS细胞转移至无饲养细胞培养体系，可通过使用玻璃毛细管作为切割工具进行所述机械切割。如此处实施例中所显示的，与酶处理的培养物相比，机械分离使得细胞更加极其有效地粘附在MatrigeITM上、更加快速地繁殖，并且在传代过程中所述细胞更加稳定得多。因此，根据本发明用于转移HS细胞的方法不需要任何酶处理。如此处实施例中所看到的，在无饲养细胞条件下培养和繁殖的细胞具有与在饲养细胞条件下培养的细胞相似的有丝分裂指数。胚泡来源的干细胞系的繁殖包括在无饲养细胞培养条件下培养所述干细胞，由于在无饲养细胞的情况下培养hBS细胞具有许多有利方面，例如不需要进行祠养细胞的生产，因此可容易地根据商业产量将hBS细胞按比例扩大生产并且无来自饲养细胞的DNA转移或其它感染的风险。因此，在无祠养细胞条件下转移和繁殖步骤可包括如下步骤a)通过机械处理将胚泡来源的干细胞从饲养细胞上转移至无饲养细胞培养物上。b)任选地，在合适的培养基和/或在合适的支持底物上在祠养细胞的培养条件下培养所述胚泡来源的干细胞，和c)任选地，每隔3-10天通过酶促和/或机械处理对所述胚泡来源的干细胞进行传代。39通常，包括i)-iii)的所有步骤。摔/^S鈿應^匈#勿應潜##^脊移^无匈#勿>敏潜#伴系如上所述已发现转移步骤是个关键步骤。因此，应当通过机械分离的方法或在饲养细胞培养体系中对细胞进行机械分离来进行转移。可通过任何合适的切割工具例如具有尖锐末端和适合于切割的大小的工具来进行这种机械处理。所述工具可以由任何合适的材料例如塑料或玻璃制成，并且具有25度角和200或300微米管腔、设计用来切割、操纵和转移hBS集落或部分hBS集落的无菌的尖锐的玻璃毛细管切割工具是个合适的工具的例子。其由SwemedLabInternationalAB，Billdal,瑞典生产。要转移的hBS细胞是hBS细胞集落并且从所述集落的中央切割出小块并以细胞团悬浮于合适的培养基中。一次或多次机械地将所述细胞团分割开例如直至所述细胞团具有至多为原始集落的50%，例如至多约40%、至多约30%、至多约20%、至多约10%、至多约5%的大小。例如将所述大小分别确定为所述细胞团或集落的直径。在此处的无祠养细胞实施例中给出了合适的用于转移步骤的条件。当然这些条件可在合适的限制内变化，所述限制在本领域技术人员的知识范围内。无饲养细胞实施例1为无饲养细胞培养物制备适应性(conditioned)VitroHESTM-培养基(k-VitroHES-培养基)为适应VitroHESTM-培养基制备mEF细胞，用丝裂霉素C处理汇合的单层mEF细胞(第二次传代)并以59000细胞/cm2的浓度接种在装有Dulbecco，sModifiedEagle培养基(D-MEM)的覆盖有明胶(0.1%;Sigma)的培养扁瓶中，所述培养基补充有1%的青霉素/链霉素(PEST;10000单位/ml)、10%胎牛血清(FBS)和2mMGLUTAMAXTM-1补充物(200mM);所有东西都来自GibcoBRL/Invitrogen,Carlsbad,CA，USA。在经过24小时的温育时期并用PBS(GibcoBRL/Invitrogen)洗涤一次后，抛弃所述培养基并用VitroHESTM-培养基(0.28ml/cm2)替代进行24小时的适应期。每天从相同的mEF培养物(在第二次传代中)中进行高达三次的收集所述VitroHESTM-适应培养基并且使用0.2jim的低蛋白结合过滤器(Sarstedt，Landskrona，Sweden)进行无菌过滤。使用新鲜的或在-20。C下冷冻过的k-VitroHES-培养基并且在使用前补充以4ng/ml的bFGF(GibcoBRL/Invitrogen)。如果贮存在+4。C度k-VitroHES-培养基中可使用长达一周。当贮存在-20。C时可长达两个月，在使用时没有检测到生物活性减退的迹象。无祠养细胞实施例2将hBS细胞系转移至无饲养细胞培养条件上将最初的hBS细胞系保持在丝裂霉素C处理过的传代10-50次的小鼠饲养细胞上并培养在补充有4ng/ml的人碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)的VitroHESTM-培养基上。对用于将hBS细胞从饲养细胞培养物中转移至MatrigelTM覆盖的培养皿中的两种不同技术进行评估，一种用机械分离而另一种用胶原酶处理。通过使用干细胞切割工具(SwemedLabAB，Bilidal,Sweden)将hBS细胞切成方块，所述方块代表集落的中部，并且将所述细胞小心地分离并转移至HBSS溶液中。所述干细胞切割工具是具有25度角和200或300微米管腔、设计用来切割、操纵和转移hBS集落或部分hBS集落的无菌尖锐的玻璃毛细管。其由SwemedLabInternationalAB,Billdal，瑞典生产。^^t^雜j^^雜炎A理f眉力^^,在HBSS中洗涤后将所述细胞团转移至胶原酶IV溶液(200单位/ml，Sigma)以进行酶促分离。将所述细胞在37。C下和5%的C02中温育30分钟。在温育期间，用移液器进行重复的机械分离并在倒置显微镜下监控分离过程。在温育过后沉淀(400G进行5分钟)所述细胞悬浮物并在重新悬浮于k-VitroHES培养基中之前用KnockOutD画MEM(GibeoBRL/Invitrogen)洗涤一次。旅^本发^进^^批械为、岸在HBSS中洗涤后，使用lml自动移液器机械地将所述细胞团小心地分离开。如上所述当所述细胞团的大小展现出相应于通过胶原酶IV处理产生的细胞聚集体的大小一约为原始集落(平均20000个细胞/原始集落)的1/10-1/20时，完成所述分离过程。在HBSS中洗涤后，将所述集落转移至胶原酶IV溶液(200单位/ml)以开始进行酶分离。对于两种不同的技术，各将所述细胞接种到4个小孔中并在37°C下于5。/。的C02中温育。各实验重复4次，每次接种相同量的细胞。2和6天后计算集落的大小和数量。尤辨#*^婆滋辨/*2#潜^为了最优化hBS细胞从饲养细胞至无祠养细胞条件的转移，评估两种不同的技术，一种用机械分离而一种用酶促分离。相对于酶处理的培养物，机械分离使细胞对MatrigelTM产生更有效的粘附和更快速的增殖。当机械分离与酶促分离(图5)进行比较时，在涂覆2天后观察到显著更高的存活集落的数目。对通过两种不同技术分离后分别在MatrigelTM上产生的所有集落的总面积进行比较(PO.001)。此外，在涂覆6天后与酶促分离的培养物相比机械分离的培养物中总集落面积显著增加(P=0.036)。无祠养细胞实施例3对培养在MatrigelTM上的hBS细胞进行培养和传代在所有实验中使用4种不同的细胞系SA002、AS038、SA121和SA167。将所述细胞系在MatrigelTM上培养至35代并且甚至在冷冻/解冻周期后所述形态学外貌和其它hBS特征保持不变。所有培养物由不具有分化的形态学标记的充分确定的hBS细胞集落构成。在约3-6天后通过取走培养基对所述细胞进行传代并且在各小孔中加入lml胶原酶IV"00单位/ml)溶液并温育15-20分钟。为了帮助细胞从表面分离出来，进行机械分离，接着进行另外15分钟的温育。然后洗涤所述细胞，重新悬浮于k-VitroHESTM培养基中并以1:2至1:6的分隔比例接种在MatrigelTM上。每隔5至6天对所述hBS培养物进行传代并在每次传代的第二至第三天更换培养基。无匈#*^《遂辨3^潜^观察到在建立在Matrige「M上的hBS细胞传代过程中，需要使用胶原酶IV的酶处理方法将集落从表面分离。相对于机械分离，在接种后发现传代过程中酶促处理也使得繁殖速度增加。无饲养细胞实施例4培养在MatrigelTM上的hBS细胞的冷冻保存和解冻在冷冻前用胶原酶IV对4种不同的细胞系SA002、AS038、SA121和SA167处理20-30分钟以将所述细胞相互分开。离心后将所述细胞以每ml冷冻培养基含一百万个细胞的浓度转移至冷冻培养基中，所述培养基含有包含10%DMSO，30%血清替代物和4ng/ml的bFgF的VitroHESTM-培养基。最终获得的细胞悬浮液是单个细胞和细胞团的混合物。在长期在液氮中贮藏前将冷冻管(0.5-1.0ml细胞悬浮物)快速转移至Nalgene冷冻容器中于-80。C下贮存过夜或至少贮存2小时。ims细應的席^在通过将冷冻管放入37°C水浴锅中直至所有细胞悬浮物解冻来进行解冻之前必须制备k-VitroHESTM-培养基并进行预热。离心(400G5分钟)前将所述细胞悬浮物转移至预热的培养基中进行5分钟。通过加入lmlk-VitroHESTM-培养基至小孔中对Matrigel薄层覆盖(BD)的小孔进行再水化并于37°C下温育30分钟。将所述细胞沉淀在k-VitroHESTM-培养基中重新悬浮并转移至24-或6-孔Matrigel板中。无饲养细胞实施例5无伺养细胞培养的hBS细胞的表征43在建立在Matrigel上后和经过冷冻/解冻周期后进行所有表征实验。^瘦勿應必夢如上所述对所述培养物进行传代，接种至6-或24-孔MatrigelTM板上并在进行免疫染色前培养6天。用PBS洗涂所述培养物，在室温下用4%甲醛(HistoLab，Gothenburg,Sweden)固定15分钟，接着又在PBS中洗涤3次。所使用的单克隆一抗是抗SSEA-1、-3和-4(1:200;DevelopmentalStudiesHybridomaBank,UniversityofIowa，IowaCity,IA)、Tra-1-60、Tra-1-81(1:200;SantaCruzBiotechnology,SantaCruz，CA)的抗体，和多克隆兔抗磷酸组蛋白H3(1:150;KeLab，Upstate)。在使用合适的Cy3-或FITC缀合的二抗(1:300;JacksonimmunoResearchlaboratories,WestGrove,PA)进行显示之前将所述一抗于4。C下孵育过夜。同样在室温下以终浓度为0.5ng/ml的4，-6，二氨基画2-苯基吲咮(DAPA;Sigma-AldrichSwedenAB，Stockholm，瑞典)对培养物温育5分钟以显现所有细胞核。漂洗染色的培养物并使用DAKO荧光封固介质(DakopattsAB，Alvsjd，Sweden)进行封固并在倒置荧光显微镜(NikonEclipseTE2000-U)下进行观察。根据厂商说明书使用商业购得的试剂盒(Sigma-Aldrich)对Matrigel培养的hBS细胞进行碱性磷酸酶(AP)染色。端在躇活遂收获、裂解Matrigel培养的hBS细胞并且根据厂商说明书通过基于PCR的ELISA方法(RocheDiagnosticsGmbH，Mannheim,Germany)分析端粒酶活性。核型为、浙和^FXS好将用于核型分析的MatrigelTM繁殖的hBS细胞在秋7jC仙素(0.1ng/ml,Invitrogen，Carisbad，CA，USA)中温育1至3小时、分离、固定、封固于载玻片上并通过使用改进的Wrights染色(#WS-32，Sigma)显示染色体。如前面所述制备中期相的板(plates)。为进行荧光原位杂交(FISH)分析，按照厂商说明书使用商业购的含有用于染色体13、18、21和性染色体(X和Y)的探针的试剂盒(MultiVysionTMPBMulticolourProbePanel;Vysis,Inc.,DownersGrove,IL)。使用装配有合适滤镜和软件(CytoVision，AppliedImaging,SantaClara,CA)的倒置显微镜分析载片。为进行畸胎瘤形成实验，使用免疫缺陷SCID小鼠(C.B-17/lcrCro曙scidBR，CharlesRiverLaboratories,德国)。通过寸吏用胶原酶IV(200单位/ml)将MatrigelTM繁殖的hBS细胞集落酶促地从表面分离开，机械地分割成小的细胞聚集体并以每个器官约50000至100000个细胞的量注射到肾囊下。用cryo-PBS注射液或来自同胎生下的小鼠初生脑细胞处理对照动物。注射后经八周杀死所述动物并将肿瘤迅速固定在4%的多聚曱醛溶液中并用石蜡包埋。将所迷畸胎瘤切成8nm的切片并用AlcianBlue/VanGiesson染色以进行组织学分析。0"々4S^及rCi为、浙:根据厂商说明书使用RneasyMini试剂盒(Qiagen)分离来自所有4种MatrigelTM培养的hBS细胞系的总RNA。使用AMVFirstStrandcDNASynthesis试剂盒(Roche)从l^ig总RNA中合成eDNA并且使用PlatinumTaqDNA聚合酶(Invitrogen)进行PCR反应。所述PCR反应包括四步最初的下降循环，所述下降循环在每个退火温度上重复两次循环，在94。C变性15秒，在66。C至60。C退火15秒并且在72°C延伸30秒。接下来的循环包括35个退火温度为58。C的重复。在前面描述了用于Oct-4的正向和反向引物序列。B肌动蛋白引物用作内对照(正义，5-TGGCACCACACCTTCTACAATGAGC-3'，反义，5國GCACAGCTTCTCCTTAATGTC國ACGC-3';400bp产物)。使用1.5%的琼脂糖凝胶通过凝胶电泳将所述PCR产物按大小进行分离。使用人肝脏作为PCR反应的正对照和使用水作为负对照。^匈#*應《滋浙4和5W潜果通过使用冷冻保存技术冷冻和解冻细胞系SA002、AS038、SA121和SA167以观察是否可发现任何特征变化。解冻后所有四种细胞系都存活并开始以类似的模式生长在覆盖有Matrigel的培养皿上。在无饲养细胞条件下的四种不同的hBS细胞系的多能性和维持性得以验证并且与前面的各细胞系在铜养细胞培养下的结果进行比较。45通过对形态学、未分化标记的表达、端粒酶活性、核型和体内分化进行考察以描述这些特征。2^逸。敏/么^:与用抗SSEA-3、SSEA-4、TRA-l-6-和TRA-1-80抗体染色(显示出与多能性hBS细胞相符的清晰的阳性免疫反应)相反，在所有无祠养细胞培养的hBS细胞系中SSEA-1表达呈阴性。此外，所有四种MatrigelTM繁殖的细胞系中的细胞都展现高水平的AP反应性。裙在雜承^:在三种MatrigelTM培养的细胞系(AS038、SA121和SA167)中进行分析。培养在Matrigel中的hBS细胞被发现具有高水平的端粒酶活性。裙《》^f和F/Si/:在其中两种MatrigelTM培养的细胞系AS038和SA121中进行核型分析。来自细胞系AS038的3个细胞中的3个和来自细胞系SA121的12个细胞中的10个发现具有正常的人46，XY核型(图.IO)。来自SA121细胞系的剩余2个细胞表现出45，XY和42，XY的异常核型。尽管如此，对于饲养细胞和无伺养细胞培养的hBS细胞来说，在长期培养后核型的变化似乎是正常发生的事件。在本研究中詞养细胞培养的hBS细胞的核型分析与MatrigelTM"^殖后的结果相似，暗示着在这些无饲养细胞的条件下hBS细胞核型保持正常和稳定。在其中两个MatrigelTM繁殖的细胞系(SA(XY)和SA167(XX))中进行FISH分析。对染色体X、Y、18、13和21进行分析。对于两个接受检验的细胞系至少93%是正常的。来自FISH分析的结果与来自饲养细胞培养的hBS细胞系的结果相似。使用两个MatrigelTM培养的hBS细胞系SA167和SA002形成畸胎瘤，并且结果显示形成的畸胎瘤由代表来自所有三个胚层(内胚层、中胚层和内胚层)的分化的细胞和组织构成，提供了MatrigelTM繁殖的hBS培养物具有保持其多能性的证据。^Mt这Oct-4在所有四种培养在MatrigelTM上的细胞系中高度表达。46无饲养细胞实施例6在MatrigelTM涂覆的板中培养在无祠养细胞条件下的hBS细胞的有丝分裂指数与培养在胚胎小鼠饲养细胞上的hBS细胞的有丝分裂指数的比较将细胞系SA121同时培养在无饲养细胞条件下的MatrigelTM涂覆的板中和培养在胚胎小鼠饲养细胞上进行3天。然后通过磷酸化的组蛋白H3的核免疫反应性对有丝分裂的细胞数目进行定量。对两种培养物中的有丝分裂指数进行计算以比较无饲养细胞和饲养细胞培养的hBS细胞之间的生长速度。稀虞与饲养层条件相比，培养在无祠养细胞(MatrigelTM)下的培养物具有相似的有丝分裂指数。无伺养细胞培养物增倍的时间与饲养细胞繁殖的hBS细胞的大致相同(约35小时)。4权利要求1.用于细胞玻璃化的方法，包括i)将细胞转移至第一种溶液(溶液A)中，ii)任选地在第一种溶液中温育所述细胞，iii)将步骤i)或ii)中获得的所述细胞转移至第二种溶液(溶液B)中，iv)任选地在第二种溶液中温育所述细胞，v)将从步骤iii)或iv)中获得的所述细胞转移至一个或多个具有允许可在其中包含至少20μl体积大小的闭合吸管，vi)封闭所述一个或多个闭合吸管，和vii)玻璃化一个或多个闭合吸管。2.权利要求l的方法，其中所述闭合吸管的大小允许具有的体积从约20^1至约250nl，例如从约20|nl至约225nl、从约25pl至约200nl、从约25|xl至约175fd、从约25pl至约150fil、从约30fil至约125^1、从约30^1至约100nl、从约35^1至约75pl、从约40^1至约50nl。3.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞是BS细胞或BS细胞系。4.前述权利要求中任一项的方法，其中所述细胞是hBS细胞或hBS细胞系。5.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一和第二种溶液中至少一种包含一种或多种冷冻保护剂。6.权利要求5的方法，其中一种或多种冷冻保护剂选自甘油、海藻糖、蔗糖、1，2-亚乙基二醇、DMSO、丙二醇和/或其混合物。7.权利要求5或6中任一项的方法，其中所述第一和第二种溶液包含一种或多种相同或不同的冷冻保护剂。8.权利要求5-7中任一项的方法，其中在所述第一和第二种溶液中的一种或多种冷冻保护剂的浓度相同或不同。9.权利要求5-8中任一项的方法，其中在所述第二种溶液中冷冻保护剂的总浓度(按。/dv/v、％w/v或M计算)大于在所述第一种溶液中的浓度。10.权利要求5-9中任一项的方法，其中所述冷冻保护剂是海藻糖。11.权利要求10的方法，其中所述海藻糖的浓度从约0.02M至约1M，例如从约0.05M至约0.9M，从约0.1M至约0.8M，从约0.2M至约0.7M，从约0.3M至约0.65M,从约0.4M至约0.6M，从约0.45M至约0.55M。12.权利要求5-9中任一项的方法，其中所述冷冻保护剂是蔗糖。13.权利要求12的方法，其中所述蔗糖的浓度在从约0.02M至约1M，例如从约0.05M至约0.9M,从约0.1M至约0.8M,从约0.2M至约0.7M，从约0.3M至约0.65M，从约0.4M至约0.6M,从约0.45M至约0.55M。14.前述权利要求中任一项的方法，其中在所述第一和第二种溶液中至少一种包含粘度调节剂。15.权利要求14的方法，其中所述粘度调节剂选自菲可、珀可、透明质酸、清蛋白、聚乙烯吡咯烷酮、藻酸、明胶和甘油。16.权利要求14或15的方法，其中所述粘度调节剂是菲可。17.权利要求16的方法，其中菲可的浓度至多是约150mg/ml，例如至多约为100mg/ml，至多约为50mg/ml，至多约为25mg/ml，至多约为15mg/ml或至多约为10mg/ml。18.权利要求14-17中任一项的方法，其中所述第一和第二种溶液包含一种或多种相同或不同的粘度调节剂。19.权利要求14-18中任一项的方法，其中在所述第一和第二种溶液中的一种或多种粘度调节剂的浓度相同或不同。20.前述权利要求中任一项的方法，其中所述第一和第二种溶液中至少有一种是水性溶液。21.前述权利要求中任一项的方法，其中包括步骤ii)。22.权利要求21的方法，其中在约37。C下进行从5秒至约20分钟之间的温育例如，从约10秒至约15分钟，从约15秒至约10分钟，从约20秒至约7.5分钟，从约30秒至约5分钟，从约40秒至约4分钟，从约50秒至约3分钟，从约30秒至约2分钟，从约45秒至约1.5分钟或约l分钟。23.前述权利要求中任一项的方法，其中包括步骤iv)。24.权利要求23的方法，其中在约37。C下进行从5秒至约10分钟之间的温育，例如，从约10秒至约7.5分钟，从约10秒至约5分钟，从约15秒至约4分钟，从约15秒至约3分钟，从约15秒至约2分钟，从约20秒至约1分钟，从约5秒至约1分钟，从约5秒至约30秒或从约10秒至约30秒。25.权利要求23或24的方法，其中所在约37°C下进行温育约30秒或更短时间。26.前述权利要求中任一项的方法，其中约50%或更多例如，约55%或更多，约60%或更多，约65%或更多，约70%或更多，约75%或更多，约80%或更多，约85%或更多，约90%或更多或约95%或更多的细胞在去玻璃化后和培养在合适的培养基上后有生活力。27.—种细胞，通过权利要求1-26中任一项中所定义的方法对所述细胞进行玻璃化。28.权利要求1-26中任一项的方法，所述方法进一步包括通过包含下列步骤的方法进行去玻璃化viii)将一支或更多支玻璃化的闭合吸管置于具有温度从约室温至约40°C的环境中进行一段时间以使闭合吸管中的内容物解冻，ix)打开一支或多支闭合吸管，x)使用所述第三种溶液(溶液C)对包含在一支或多支打开的闭合吸管中的细胞进行洗涤流程，xi)任选地将获自步骤x)的洗涤后的细胞转移至第四种溶液(溶液D)中，并xii)任选地将所述细胞在第四种溶液中温育，xiii)任选地从所述第四种溶液中转移来自xii)的细胞并将所述细胞接种在飼养细胞上，和xiv)任选地进一步培养所述细胞。29.权利要求28的方法包括步骤xi)、xii)和xiv)。30.权利要求29的方法，进一步包括步骤xii)。31.权利要求28-30中任一项的方法，其中所述第三和/或第四(如果相关)溶液包含一种或多种冷冻保护剂。32.权利要求31的方法，其中所述一种或多种冷冻保护剂选自甘油、海藻糖、蔗糖、1,2-亚乙基二醇、DMSO、丙二醇和或其混合物。33.权利要求32的方法，其中所述一种或多种冷冻保护剂是甘油、海藻糖、蔗糖或其混合物。34.权利要求33的方法，其中所述冷冻保护剂的浓度是从约0.02M至1M,例如从约0.05M至约0.9M，从约0.1M至约0.8M，从约0.1M至约0.7M，从约0.1M至约0.6M,从约0.15M至约0.5M,从约0.2M至约0.4M。35.权利要求28-34中任一项的方法，其中如果相关，所述第三种溶液中冷冻保护剂的浓度高于所述第四种溶液中冷冻保护剂的浓度。全文摘要用于生物学细胞，特别是胚泡来源的干细胞(BS细胞)玻璃化的改进方法。所述方法对在解冻后保持生活力的细胞非常温和。所述方法包括，i)将细胞转移至第一种溶液(溶液A)中，ii)任选地在第一种溶液中温育所述细胞，iii)将步骤i)或ii)中获得的细胞转移至第二种溶液(溶液B)中，iv)任选地在第二种溶液中温育所述细胞，v)将从步骤iii)或iv)中获得的细胞转移至一个或多个具有允许可在其中包含至少20μl体积大小的闭合吸管，vi)封闭所述一个或多个闭合吸管，和vii)玻璃化一个或多个闭合吸管。本发明的重要特征在使用闭合吸管以及可被有效地玻璃化和随后被解冻的相对较大的体积。文档编号C12N5/08GK101497873SQ20081016678公开日2009年8月5日申请日期2004年5月10日优先权日2003年5月8日发明者A·舍格伦,E·舍格伦-詹森,P·埃里克森,S·埃内巴克申请人:塞拉提斯股份公司