abl基因突变的检测用探针及其用途的制作方法

专利名称：abl基因突变的检测用探针及其用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及用于检测与白血病相关的abl基因的突变的探 针及其用途。
背景技术：
点突变的检测，即单核苷酸多态性(SNP)的检测有着广 泛的应用，该方法可从基因水平上分析所有疾病的原因，以及 个体间疾病易感性(感染某种疾病的难异程度)、个体间药效的 差异等。
点突变的通常4企测方法为(1 )扩增样品的目标DNA相应 于检测对象序列的区域，对全长基因序列进行解析的直接测序 (Direct Sequencing )法,(2 )焦石奔酉臾观寸序(Pyrosequencing ) 法，(3)扩增检测对象序列所在的区域，在温度梯度柱中进行 HPLC，根据洗脱时间检测突变的有无的变性高效液相色谱 (Denaturing HPLC )法，(4 )利用荧光探针与含有靶突变的区 域结合时可发出荧光的现象，根据所述荧光的检测来检测突变 的Invadar法，(5 )使用3，末端含有靶突变的引物进行PCR,才艮 据是否能扩增来判断突变存在性的ASP- PCR法等。
但是，上述(1 )、(2)和(4)方法的敏感度分别低达约20%、 约5%、约5%左右，操作需要很多功夫和时间。上述(3)方法 的敏感度低达约10%,另外，仅能确认有无突变，无法解析在 何部位产生了何种突变，具有缺乏特异性的问题。另外，上述 (5)的方法虽然敏感度高、但特异性低，具有易于产生假阳性 的问题。予以说明，数值(％)越小则敏感度为越高。目标核酸与探针形成的双链核酸的熔解温度(melting temperature, Tm )的方法。这才羊的方法通过例^口 Tm分冲斤或前 述双链的熔解曲线的分析来进行，因此被称为熔解曲线分析。 该方法例如可以如下进行。首先，使用与含有4企测目标的点突 变的检测对象序列互补的探针，形成检测样品中的目标单链 DNA和上述探针的杂交体(双链DNA)。接着，对该杂交产物 实施加热处理，利用吸光度等信号测定来检测随着温度上升的 杂交体的解离(融解)。然后，根据该检测结果决定Tm值，从 而判断有无点突变。Tm值在杂交产物的同源性越高时越高，在 同源性越低时越低。因此，对于由含有点突变的^r测对象序列 和与其互补的探针的杂交产物，预先求出其Tm值(评价基准
值)，测定检测样品的目标单链DNA和上述探针的Tm值(测定 值)，则可以进行以下的判断。当上述测定值与上述评价基准值 相同时，则可以判断为匹配、即在目标DNA上存在点突变。另 一方面，上述测定值低于上述评价基准值时，则可以判定为错 配、即在目标DNA上不存在点突变。
但是，使用这种Tm分析的检测方法具有敏感度低的问题。 作为具体例子，对于白血病患者的血细胞来源的DNA斥全测点突 变时存在问题(专利文献l)。白血病是骨髓中的造血干细胞癌 变所引起的疾病。其中，已知慢性粒细胞白血病(Chronic myeloid leukemia, CML )的发病原因在于由第9个染色体和第 22个染色体易位所形成的bcr- abl融合基因，在其治疗中广泛 使用作为ABL酶抑制剂的伊马替尼等。但是，存在如下的问题 该abl基因(包括上述融合基因中的abl基因)上存在点突变时， 对伊马替尼表现出耐受性。此时，治疗中例如有必要进行伊马 替尼给药量的增加、换成其它治疗药、改为骨髓移植等。因此， 在白血病、特别是CML的治疗中，检测abl基因上有无点突变非常重要。但是，即便是同 一个CML患者的血液，在其血细胞中 也包括abl基因中产生了点突变的序列(检测对象序列)和未产 生点突变的序列(非检测对象序列)，两者的不同仅为点突变、 即一个碱基的序列。这样，发生如下现象用于检测点突变的 探针与含有点突变的检测对象序列杂交(匹配)，进而还与不含 点突变的非检测对象序列杂交(错配)。这种情况下，当通过 T m分析制作表示信号强度和温度间的关系的融解曲线时，相应 于匹配的突变序列的高温侧峰由于相应于错配的正常序列的低 温侧峰的存在而难以纟企测到，进而发生#全测敏感度降低。 专利文献l:曰本净争7>表2004 — 537992号

发明内容
因此，本发明的目的在于提供一种检测用探针以及其用途， 所述探针即使在仅一 个碱基不同的、包含突变的检测对象序列 和不含突变的非检测对象序列共存的情况下，也能够检测所述 包含突变的检测对象序列。
为了达到所述的目的，本发明的探针为用于检测abl基因的 突变的探针，其特征在于，包含选自由下述(A1) ~ (II)所 组成的组中的至少一种寡核苷酸。
(Al)包含序列号2的碱基序列的寡核苷酸 (A2)包含序列号3的碱基序列的寡核苷酸 (Bl)包含序列号4的碱基序列的寡核苷酸 (B2)包含序列号5的碱基序列的寡核苷酸 (Cl)包含序列号6的碱基序列的寡核苷酸 (C2)包含序列号7的碱基序列的寡核苷酸 (Dl)包含序列号8的碱基序列的寡核香酸 (D2)包含序列号9的碱基序列的寡核普酸(El)包含序列号10的碱基序列的寡核苷酸 (Fl)包含序列号ll的碱基序列的寡核苷酸 (Gl)包含序列号12的碱基序列的寡核苷酸 (G2)包含序列号13的碱基序列的寡核苷酸 (Hl)包含序列号14的碱基序列的寡核苷酸 (H2)包含序列号15的碱基序列的寡核苷酸 (II)包含序列号16的碱基序列的寡核苷酸 本发明的突变检测方法，其特征在于，其为检测abl基因中 的突变的方法，含有下述(1 ) ~ ( 3 )工序。
(1) 配制反应液的工序，所述反应液包含含有DNA的样 品与本发明的探针，
(2) 改变所述反应液的温度，测定所述DNA与所述探针 的杂交产物显示熔解状态的信号值的工序，
(3) 由伴随温度变化的所述信号值的变化，决定突变的 有无的工序。
使用本发明的探针，即使在发生了检测目标突变的abl基因 (突变基因)和未发生突变的abl基因(正常基因)共存的情况 下，也能检测所述发生目标突变的检测对象序列。例如，前述 Tm分析中，若采用以往的探针，所述探针会与仅有一个碱基不 同的突变基因以及正常基因二者都杂交，导致所述的熔解曲线 中，二者的信号行为(如信号峰)重叠，检测突变基因的存在 非常困难。与此相反，若采用本发明的探针，即使探针与突变 基因和正常基因二者都杂交，在熔解曲线中，也可以充分分离 二者的信号峰。因此，根据本发明，可以以比以往更高的灵敏 度检测突变基因。另外，在本发明中，abl基因还包括bcr - abl 融合基因中的abl基因(下同)。


图l为示意本发明实施例中Tm分析结果的图表。 图2为示意本发明另 一实施例中Tm分析结果的图表。 图3为示意本发明又一实施例中Tm分析结果的图表。 图4为示意本发明又一实施例中Tm分析结果的图表。 图5为示意本发明又一实施例中Tm分析结果的图表。 图6为示意本发明又一实施例中Tm分析结果的图表。 图7为示意本发明又一 实施例中Tm分析结果的图表。 图8为示意本发明又一实施例中Tm分析结果的图表。 图9为示意本发明又 一 实施例中Tm分析结果的图表。
具体实施例方式
在本发明中，下面将发生检测目标突变的abl基因称为"突 变基因或检测对象基因"；将发生检测目标突变的序列、利用探 针进行检测的对象序列称为"突变序列或检测对象序列"；将未 发生检测目标突变的abl基因称为"正常基因或非检测对象基 因"；将未发生检测目标突变的序列称为"正常序列或非检测对 象序列"，将待检测是否有突变的样品中的DNA称为"目标 DNA"。在本发明中，所检测的突变可以列举出单核苦酸多态 性(SNP)等。
<探针>
如前所述，本发明的探针为用于检测abl基因的突变的探 针，其特征在于，包含选自前述(A1) ~ (Il)所组成的组中 的至少 一种寡核苷酸。在序列号1中示意出abl基因的cDNA序列 (mRNA序列)。另夕卜，该序列的NCBI登录号为No.NM—005157。 下面对这些探针进行说明。
包含下述(Al )及(A2)的寡核苷酸的探针，分别为用于检测序列号l的碱基序列中第730位的碱基A的突变(A—G)的 探针。通过下述序列号2或序列号3的寡核苷酸可以确认正链上 的突变，通过与之互补的寡核苷酸则可以确认负链上的突变。 (Al )包含序列号2的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
苷酸
(A2 )包含序列号3的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
苷酸
5'-tgtgcttcaCggtgatgtcc-3'(序歹'J号2 ) 5'-gtgcttcaCggtgatgtccgtgcgttcc—3，(序歹ij号3 )
包含下述(Bl)及(B2)的寡核苷酸的探针，分别为用于
检测序列号l的碱基序列中第749位碱基G的突变(G—A)的探 针。通过下述序列号4或序列号5的寡核苷酸可以确认负链上的 突变，通过与之互补的寡核苷酸则可以确认正链上的突变。
(Bl )包含序列号4的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
苷酸
(B2 )包含序列号5的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
苷酸
5，-caagctgggcgAgggcc-3，(序歹ij号4 ) 5， -cacaagctgggcgAggg-3，(序歹ij号5 )
包含下述(Cl )及(C2)的寡核苷酸的探针，分别为用于 检测序列号1中的第943位碱基A的突变(A—G)的探针。通过 下述序列号6或序列号7的寡核苷酸可以确认正链上的突变，通 过与之互补的寡核苷酸则可以确认负链上的突变。
(Cl )包含序列号6的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
苷酸
(C2 )包含序列号7的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
苷酸5，-ctcagCgatgatatagaacgg-3，(序歹ij号6 ) 5，-cagCgatgatat卿acggg-3，(序歹ij号7 )
包含下述(Dl )及(D2)的寡核苷酸序列的探针，分别为 用于检测序列号l的碱基序列中第944位的碱基C的突变(C—T) 的探针。通过下述序列号8或序列号9的寡核苷酸可以确认正链 上的突变，通过与之互补的寡核苷酸则可以确认负链上的突变。 (Dl )包含序列号8的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
苷酸
苷酸
(D2 )包含序列号9的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
5'—ctcaAtgatgatatagaacg—3，(序歹寸号8 ) 5'-actcaAtgatgatatagaac-3，(序列号9 )
包含下述(E1)的寡核苷酸序列的探针，分别为用于检测 序列号l的碱基序列中第951位的碱基C的突变(C—G)的探针。 通过下述序列号10的寡核苷酸可以确认DNA正链上的突变，通 过与其互补的寡核苷酸则可以确认负链上的突变。
(El )包含序列号10的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
苷酸
5，—ttcccgtaggtcatCaac—3' (序歹ij号10 )
包含下述(Fl)的寡核苷酸序列的探针，分别为用于检测 序列号1的碱基序列中第1052位的碱基T的突变(T—C )的探针。 通过下述序列号11的寡核苷酸可以确认负链上的突变，通过与 之互补的寡核苷酸则可以确认正链上的突变。
(Fl )包含序列号ll的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
苷酸
5'-gtcagccaCggagtacc-3，(序歹ij号11 )包含下述(Gl )及(G2)的寡核苷酸序列的探针，分别为 用于检测序列号1的碱基序列中第1064位的碱基A的突变 (A—G)的探针。通过下述序列号12或序列号13的寡核苷酸可 以确认正链上的突变，通过与之互补的寡核苷酸则可以确认负 链上的突变。
(Gl )包含序列号12的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
苷酸
(G2)包含序列号13的碱基序列的寡核普酸或其互补寡核
苷酸
5，-gtttttcttcCccaggtactc-3， (序歹寸号12 ) 5，-gtttttcttcCccaggtactcc-3，(序歹'J号1 3 )
包含下述(Hl)及(H2)的寡核苷酸序列的探针，分别为 用于检测序列号1的碱基序列中第1075位碱基T的突变(T—G ) 的探针。通过下述序列号14或序列号15的寡核苷酸可以确认正 链上的突变，通过与之互补的寡核苷酸则可以确认负链上的突变。
(Hl )包含序列号14的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
苷酸
(H2 )包含序列号15的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
苷酸
5，—gatgaCgtttttcttctcc-3，(序歹ij号14 ) 5'-tgtggatgaCgtttttcttc-3，(序歹寸号1 5 )
包含下述(II)的寡核苷酸序列的探针，分别为用于检测 序列号l的碱基序列中第1187位的碱基A的突变(A—G)的探针。 通过下述序列号16的寡核苷酸可以确认正链上的突变，使用与
之互补的寡核普酸则可以确认负链上的突变。(II )包含序列号16的碱基序列的寡核苷酸或其互补寡核
苷酸
5'-ccagcaCgggctgtgtaggtgtcc-3，(序歹ij号1 6 )
本发明的纟笨4十，优选为用标记物标记的纟罙针。前述标记物 并无限制，可列举出荧光染料(荧光团)。所述标记探针的具体 例子，优选例如如下的探针用所述荧光染料标记的、单独时 显示荧光且形成杂交体后荧光减弱(例如猝灭)的探针。利用
这种焚光摔灭王见象(Quenching phenomenon)的4果4十称、为焚光 猝灭探针。其中，所述探针优选寡核苷酸的3，末端或者5，末端 用荧光染料进行标记，被标记的所述的末端的碱基优选为C。 此时，优选所述标记探针的碱基序列如下地进行设计使得在 前述标记探针所杂交的检测对象序列中，与所述标记探针的末 端碱基C配对的碱基或距离所述配对的碱基l ~ 3个碱基处的碱 基为G。这种探针一般称为鸟噤呤猝灭探针，已知有所谓的 QProbe (注册商标)探针。这种鸟噤呤猝灭探针与检测对象序 列杂交后，被荧光染料标记的末端的C由于接近所述检测对象 DNA上的G,因而产生所述荧光染料发光减弱(荧光强度降低) 的现象。使用这样的探针的话，根据信号的变化可以容易地确 认杂交、解离。
所述的荧光染料并无限制，可列举出例如荧光素、磷光体、 罗丹明、聚曱川染料衍生物等。市售的荧光染料可列举出例如 BODIPYFL (商标名，乇^年二，一'7。口一/公司生产)、 FluorePrime (商品名，7 7 7卞厶7 7》7 、> 7公司生产)、 Fluoredite(商品名，$ ]J求了公司生产)、FAM( ABI公司生产)、 Cy3和Cy5 ( 了 7 、>亇厶7 7/P7、乂7公司生产)、TAMRA (乇 k年二 ，一y口 一:/公司生产)等。探针的检测条件并无特别限制，可根据使用的荧光染料适当决定，例如Pacific Blue检测 ;皮长为450 ~ 480nm, TAMRA冲全观'H皮长为585 ~ 700nm, BODIPY F L检测波长为515 ~ 5 5 5 n m 。若使用此类探针，根据信号的变化， 可以容易地确定杂交或解离。另外，若在同一反应液中检测二 种突变时，可同时使用两种以上与各突变相应的探针。此时， 通过用检测波长不同的荧光染料将各探针进行标记，可使用同 一反应液4全测二种以上的突变。
此外，本发明的探针，例如3，末端可以带有磷酸基团。如 后文所述，可以通过PCR等基因扩增方法制备用来检测有无突 变的DNA(靶DNA),此时，可使本发明的探针在基因扩增反 应的反应液中共存。这时若探针的3，末端预先带有磷酸基团， 可以很好地防止探针自身通过基因扩增反应而延伸。此外，也 可以在3，末端加上前面所述的标记物来获得同样的效果。
本发明的探针如前所述，可用于检测abl基因的突变。检测 方法无任何限制，只要是利用检测对象序列与探针的杂交的方 法即可。作为应用本发明的探针的方法的一个例子，下文对利 用Tm分析的突变检测方法进行说明。
<突变4全测方法>
如前所述，本发明的突变检测方法，其特征在于，其为检 测abl基因中的突变的方法，含有下述(1 ) ~ ( 3 )工序。此外， 本发明的突变检测方法的特征在于采用本发明的探针，对于其 他的组成以及条件并不限于下述记载。
(1) 配制反应液的工序，所述反应液包含含有DNA的样 品与本发明的探针
(2) 改变所述反应液的温度，测定所述DNA与所述探针 的杂交产物显示熔解状态的信号值的工序
(3) 由伴随温度变化的所述信号值的变化，决定突变的有无的工序
在本发明中，样品中的DNA可为单链DNA,亦可为双链 DNA。所述DNA为双链DNA时，优选例如包含在所述工序(2 ) 之前通过加热使前述双链DNA解离的工序。通过将双链DNA解 离成单链DNA，使得与本发明的探针进行杂交成为可能。
在本发明中，样品中所含的DNA例如可以为生物样品中原 本含有的DNA,但为了提高检测精度，优选以生物样品中原本 含有的DNA为模板，通过PCR等扩增后的扩增产物。扩增产物 的长度并无特别限制，例如为50~ 1000mer,优选80 200mer。 此外，前述核酸例如可以为DNA、 RNA(总RNA, mRNA等) 等，亦可为由前述RNA通过RT - PCR ( Reverse Transcription PCR，逆转录PCR)合成的cDNA等。
使用本发明的突变检测方法的样品，并无特别限制，可列 举出存在abl基因的样品。具体例子可列举出白细胞等血细胞样 品，全血样品等。此外，本发明中对于样品的采集手段、DNA 的制备方法等亦无限制，可采用目前已知的方法。
本发明中，本发明的探针相对于所述样品中的DNA的添加 比例(摩尔比)并无限制，但为了能够充分确保检测信号而优 选为l倍以下，更优选为0.1倍以下。此时，样品中的DNA既可 以指例如发生纟企测目标突变的检测对象DNA与所述未发生突 变的非检测对象DNA的总计，亦可以指包含发生检测目标突变 的检测对象序列的扩增产物与包含所述未发生突变的非检测对 象序列的扩增产物的总计。此外，在样品中的DNA中，所述检 测对象DNA的比例通常未知，但从结果上看，优选所述探针的 添加比例(摩尔比)相对于检测对象DNA (含有检测对象序列 的扩增产物)为10倍以下，更优选为5倍以下，进一步优选为3 倍以下。另外，对其下限并无特别限制，例如为0.001倍以上，优选0.01倍以上，更优选0.1倍以上。
本发明的探针相对于所述DNA的添加比例，例如可为相对 于双链DNA的摩尔比，也可为相对于单链DNA的摩尔比。
下面对Tm值进行说明。持续加热含双4连DNA的溶液的话， 260nm处的吸光度会上升。这是由于双链DNA中双链间的氢键 由于加热而解开，成为单链DNA ( DNA熔解)。并且所有的双 链DNA解离成单《连DNA的话，吸光度显示为开始加热时的吸光 度(仅双《连DNA时的吸光度)的约1.5倍，可以由此判定已完成 熔解。根据这种现象，熔解温度Tm通常指吸光度值达到吸光度 总上升部分的5 0 %时的温度。
本发明的所述工序(2)中，测定所述DNA与所述纟笨针的 杂交产物显示熔解状态的信号值时，由上述的原理出发，可以 测定260nm处的吸光度，但优选测定本发明的探针上带有的标 记物的信号。因此，本发明的探针优选使用前述的标记探针。 所述标记探针可以列举例如单独时显示信号且通过形成杂交体 不显示信号的标记探针，或单独时不显示信号而通过形成杂交 体显示信号的标记探针。若为前者这样的探针，在与检测对象 序列形成杂交体(双链DNA)时不显示信号，通过加热探针游 离而显示信号。若为后一种探针则通过与检测对象序列形成杂 交体(双链DNA)时显示信号，通过加热探针游离时信号减弱 (消失)。因此，通过在信号特有的条件(吸光度等)下检测该 标记物质的信号，可以与所述260nm下的吸光度测定同样地进 行熔解进行情况和Tm值的决定。标记探针上的标记物例如如前 所述。
下面，列举使用荧光染料标记的标记探针作为本发明探针 的例子，对本发明的突变检测方法进行说明。此外，本发明的 突变检测方法的特征在于使用本发明的探针，对其他的工序、条件并无任何限制。
首先从全血中提取基因组DNA。可使用目前已知的方法从
全血提取基因组DNA,例如，可使用市售的基因组DNA提取试 剂盒(商品名GFX Genomic Blood DNA Purification kit; GE、 ^^少7"、4才廿4工7义公司生产)。
接着，将本发明的标记探针加入到包含所提取的基因组 DNA的样品中。所述标记探针例如优选前述那样的QProbe。该 QProbe通常是指探针末端的胞嘧啶碱基被荧光染料标记了的 探针，通过其与检测对象序列杂交，所述荧光染料与检测对象 序列中鸟嘌呤碱基相互作用，结果使得荧光减弱(或猝灭)。标 记探针的序列如前所述，可根据检测目标突变适当进行选择。
所述;f全测用纟罙^"的添加时才;i无特别限制，例如可以在后述 的基因扩增处理后，向扩增产物中添加，亦可在基因扩增处理 前添加。像这样，在通过PCR等进行扩增处理前添加所述检测 用探针的情况下，例如，优选如前所述地在其3，末端附加荧光 染料或者附加磷酸基团。
所述检测用探针，可以添加在包含所提取的基因组DNA的 液体样品中，亦可在溶剂中与基因组DNA混合。所述溶剂无特 别限制，可列举例如Tris - HC1等緩冲液，含KC1 、 MgCl2、 MgS04、 甘油等的溶剂，基因扩增反应液等公知常用的溶剂。
接着，以所提取的基因组DNA为模板，通过PCR等基因扩 增方法扩增包含发生检测目标点突变的位点的序列(检测对象 序列及非检测对象序列)。所述基因扩增方法并无限制，例如， PCR ( Polymerase Chain Reaction,聚合酶4连反应)法，NASBA (Nucleic acid sequence based amplification,依赖核酸序歹'J的扩 增)法，SDA( Strand Displacement Amplification,链置换扩增) 法等。其中优选PCR法。此外，虽然下文以PCR法为例来阐述本发明，但并不限定于此。另外，PCR条件也无特别限制，可 通过目前已知的方法来进4亍。
PCR的引物序列只要能扩增目标检测对象序列即可，此外 无特别限制，可根据目标序列使用目前已知的方法适当进行设 计。引物长度无特别限制，通常，长度可设定为例如10 30mer。 以下示意出使用所述(Al ) ~ (Il)的探针时，可用于扩增检 测对象序列的引物对的一些例子。另外，这些为例示，并不限 定本发明。
A1探针及A2探针用引物对
正义引物 序列号17
5 ，-gacaagtgggagatggaacgc-3 ，
反义引物 序列号18
5 ， -cacggccaccgtcagg-3 ，
B1探针及B2探针用引物对
正义引物 序列号19
5，-gacaagtgggagatggaacgc-3 ，
反义引物 序列号20
5' -cacggccaccgtcagg-3'
C1探针及C2探针用引物对
正义引物 序列号21
5' -ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3'
反义引物 序列号22
5' -ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3'
D1探针及D2探针用引物对
正义引物 序列号23
5 ， -ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3 ，
反义引物 序列号245 -ggacggacggaxxgcactccctcaggtagtccag-3 ，
El探针用引物对
正义引物 序列号25
5 ， -ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3 ，
反义引物 序列号26
5' -ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3'
Fl探针用引物对
正义引物 序列号27
5 ， -ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3 ，
反义引物 序列号28
5 ， -cacgccctgtgactccatg-3 ，
G1探针及G2探针用引物对
正义引物 序列号29
5' -ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3'
反义引物 序列号30
5' -cacgccctgtgactccatg-3'
H1探针及H2探针用引物对
正义引物 序列号31
5 ， -ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3'
反义引物 序列号32
5' -cacgccctgtgactccatg-3'
ii探针用引物对
正义引物 序列号33
5' -acctacctacctagatcttgctgcccgaaactg-3'
反义引物 序列号34
5' -acctacctacctcttgttgtaggccaggctctc-3'
接着，进行所得到的PCR扩增产物的解离、以及通过解离获得的单链DNA与所述标记探针的杂交。这些操作例如可以通
过改变反应液的温度来进行。
所述解离工序中的加热温度，只要是所述扩增产物可以解
离的温度即可，此外无特别限制，例如，为85 95。C。加热时 间亦无特别限制，通常为1秒~10分钟，优选1秒 5分钟。
解离后的单链DNA与所述标记探针的杂交可通过例如在 所述解离工序后，降低所述解离工序中的加热温度来进行。温 度条件例如为40 ~ 50°C。
所述反应液中各成分的体积、浓度无特别限制。所述反应 液中DNA浓度的具体例子例如为O.Ol ~ l(iM,优选O.l ~ 0.5fiM, 所述标记探针的浓度例如优选满足对所述DNA的添加比例的 范围，例如为O.OOl ~ lO(iM,优选为O.OOl ~ l(iM。
随后，再改变所述反应液的温度，测定所述扩增产物与所 述标记探针的杂交产物显示熔解状态的信号值。具体来说，例 如，力口热含有所述单链DNA与所述标记^笨针的杂交产物的前述 反应液，测定随着温度上升的信号值的变化。如前所述，例如， 在使用末端的C碱基被标记的探针(鸟噤呤猝灭探针)时，在 其与单链DNA杂交的状态下，荧光强度减弱(或猝灭)，在解 离的状态下发出荧光。因此，緩慢加热荧光强度减弱(或猝灭) 了的杂交产物，测定随温度上升的荧光强度的增加即可。
测定荧光强度变化时的温度范围无特别限制，例如，起始 温度可为室温~ 85°C ,优选为25 ~ 70°C。终止温度例如可为40 ~ 105°C。此外，温度的上升速度无特别限制，例如为0.1 20。C/ 秒，优选0.3 ~ 5。C/秒。
在本发明中，例如，可使用同一反应液4全测2个以上不同位 点的突变。此时，如前所述，各突变相应的探针优选使用附加 不同的标记物的标记4笨针。并且，在该测定工序中，优选在各标记物相应的4全测波长下测定各标记物的荧光信号强度。
此后，分析所述信号的变动来决定Tm值。具体来说，由得 到的荧光强度计算出各温度下的每单位时间的荧光强度变化量 (- d荧光强度增加量/dt),将显示最低值的温度作为Tm值。另 外，也可将每单位时间的荧光强度变化量(d荧光强度增加量 /dt)最高的点作为Tm值。此外，不使用猝灭探针，而是使用单 独时不显示信号且通过形成杂交体显示信号的标记作为标记探 针的情况下，相反地测定荧光强度的减少量即可。
随后，可由Tm值决定^r测对象序列的基因型。Tm分析中， 可以获得完全互补的杂交体(完全匹配)比一个碱基不同的杂 交体(错配)显示解离的Tm值变高的结果。所以，通过预先对 所述探针，确定完全互补杂交体的Tm值、 一个碱基不同的杂交 体的Tm值，可以决定各检测对象部位的基因型。例如，假设检 测对象部位的碱基为突变型(例如，序列号1中第730位碱基为 G),使用与含该部位的检测对象序列互补的探针(序列号2或3 ) 时，所形成的杂交体的Tm值若与完全互补的杂交体的Tm值相 同时，则所述扩增产物的多态可判断为突变型。若所形成的杂 交体的Tm值与 一 个碱基不同的错配杂交体的Tm值相同时(较 完全互补杂交体的Tm值低)，所述扩增产物的多态则可判定为 野生型(例如，序列号1中第730位的碱基为A)。另外，仅检测 到完全互补的杂交体的Tm值时，可判断为突变型纯合子；仅检 测到错配的杂交体的Tm值时，可判断为野生型纯合子。另一方 面，若同时检测到双方的Tm值时，则可判断为杂合体。这样即 可根据各标记探针的2个Tm值来判定基因型。
本发明中，优选事先对各探针决定完全匹配的杂交产物的 Tm值和错配的杂交产物的Tm值。这样通过将实际与检测对象 序列形成杂交体时的Tm值与事先决定的作为评价标准的Tm值进行比较，可容易地确定有无突变和合子类型。所述作为评价
标准的Tm值可通过例如目前已知的MELTCALC4欠件(http: 〃www.meltcalc.com )或邻接法(Nearest Neighbor Method )确
形成杂交体并进行Tm分析来确定。
另外，本发明中，例如也可测定杂交体形成时的信号变化 来替代如前所述的使含杂交产物的反应液温度上升(加热)并 测定随温度上升的信号变化的方法。即亦可在使所述含探针的 反应液的温度降低而形成杂交产物时，测定随所述温度下降的 信号变化。
作为具体例子，使用单独时显示信号且通过形成杂交体后 不显示信号的标记探针(例如鸟噤呤猝灭探针)时，在单链DNA 与探针解离的状态下发出荧光，通过降低温度形成杂交体的话， 所述荧光减弱(或猝灭)。因此，例如可以緩慢降低所述反应液 的温度，测定伴随温度下降的荧光强度的降低。另一方面，使 用单独时不显示信号且通过形成杂交体显示信号的标记探针 时，在单链DNA与探针解离的状态下不发荧光，通过降低温度 形成杂交体后能发出荧光。因此，例如可以緩慢降低所述反应 液的温度，测定伴随温度下降的荧光强度的增加。
<探针试剂盒>
本发明的探针试剂盒，其特征在于，其为用于检测abl基因 突变的试剂盒，含有本发明的探针。本发明的探针试剂盒中， 本发明的探针既可以是一种亦可是两种以上。为后者的情况下， 所包含的二种以上探针可为混合状态，也可分别为单个试剂。 另外，二种以上的本发明的探针以混合状态包含在本发明的试 剂盒中的情况；以及以单个试剂被包含、例如使用时在同一反 应体系中进行各探针与各检测对象序列的Tm分析的情况中，优选各纟采针4吏用不同的标记物进行标记。这样通过改变标记物的 种类，即使在同一反应体系中，也可以分别检测不同的探针。 所述标记物优选例如才企测波长不同的物质。
如前所述，已知abl基因上有多个突变与白血病相关，使用 本发明的探针，可检测所述的各种突变(9种)。另一方面，与 白血病相关的abl基因，例如，存在仅检测其中任一个位点的突 变的情况，亦存在检测多个位点的突变的情况。本发明中作为 检测目标多个突变虽然都是显示与白血病及所用药品(例如伊 马替尼)相关的突变，但也显示出每个突变所特有的特征。因 此，例如，检测出多个突变时，对所得结果进行综合分析，由 此可能作出更佳的诊断、治疗。因此，本发明的探针试剂盒中 通过包含2种以上本发明的探针时，用于诊断、治疗等目的的突 变检测将更加简便易行。
<it断方法>
本发明的诊断方法，其特征在于，其为白血病诊断方法， 包含通过本发明的突变检测方法检测abl基因的突变的工序。本 发明的特征在于，使用所述本发明的探针对abl基因的突变进行 检测，对其他的工序、条件无任何限制。
根据本发明，可以通过abl基因特定部位上有无突变，来判 断对白血病治疗药物的耐性。所述白血病治疗药物例如可举出
伊马替尼、曱磺酸伊马替尼。
下面举实施例对本发明进行阐述，但本发明并不受下述实 施例限制。
实施例1
abl基因第730位碱基的点突变(A—G) 使用本发明的探针，对abl基因第730位碱基的点突变 (A—G)进行Tm分析。制备插入有序列号1所表示的第730位的碱基A未突变的正 常abl基因序列的质粒(以下称"wtDNA，，)、插入有所述第730位 的碱基A突变为G的突变abl基因(abl酪氨酸激酶A730G,氨基 酸信息M244V)的质粒(以下称"mtDNA")。并将两者配制成 关见定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97), ^l寻104copy/test ( 1 |iL )力口 入到49iiL下述PCR反应液中，进行PCR反应。所述PCR反应液 中检测探针的终浓度为50nM。所述PCR反应如下进行使用热 循环4义，95。C处理60秒后，以95。C处理1秒、58。C处理30秒为一 循环，重复50个循环，随后95。C处理1秒，40。C处理60秒。此后 使温度上升速度为TC/3秒，将所述PCR反应液从4(TC加热至 95°C,测定荧光强度随时间的变化(波长585 ~ 700nm)。
(PCR反应液单位[il)
蒸馏水 25.25
10xgene Taq buffer* 5
40%甘油 12.5
2.5mM dNTPs 4
100pM正义引物 1 (实施例) 0.5 (比较例)
100pM反义引物 0.5 (实施例) 1 (比较例)
5pM检测用探针 0.5
5U/|aL Gene Taq FP*_^_
总计 49pL
*商品名Gene Taq Fp: 二 y求乂 ^ 一 乂乂>司生产(以下同) 正义引物 序列号17
5 ， -gacaagtgggagatggaacgc-3,
反义引物 序列号18
5' -cacggccaccgtcagg-3'
(实施例i -1)
检测用探针A1 序列号2
5' —tgtgcttcaCggtgatgtcc— (TAMRA) -3'(实施例1 - 2 )
检测用探针A2 序列号3
5' -gtgcttcaCggtgatgtccgtgcgttcc- (TAMRA) -3 ，
(比较例1 ) 检测用探针 序列号35
5 ， -(TAMRA)-caccGtgaagcacaag-P-3 ，
这些的结果如图i所示。图i为表示随温度上升的荧光强度
变化(微分值=(-d荧光强度增加量/dt),以下同)的Tm分析 的图表(熔解曲线)。图1中(A )为实施例1 - 1的结果，(B ) 为实施例l-2的结果，(C)为比较例l的结果。此外，在相同 条件下各探针与wtDNA ( 100%)形成杂交体的情况、以及各探 针与mtDNA ( 100%)形成杂交体的情况下，各峰值如下所示， 并以此作为评^介标准。
峰值温度(。C )
探针_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )_
实施例1 - 1 ^ ^75
实施例1 - 2 69.0 74.0
比较例l 50.0 57.0
如该图中的(A)与(B)所示，使用实施例l - l及实施例 1 - 2的探针，结果检测到与所述评价标准相同的wtDNA峰(°C ) 与mtDNA峰(。C)。与此相反，如该图的(C)所示，使用比较 例l的探针时，未能观察到mtDNA峰。由此结果可知，使用本 发明的探针，即使在mtDNA与wtDNA共存的情况下，也可以提 高mtDNA的检测灵敏度。
实施例2
abl基因第749位碱基的点突变(G—A)
使用本发明的探针，对abl基因第749位碱基的点突变(G—A)进行Tm分析。
制备插入有序列号1所表示的第749位碱基G未突变的正常 abl基因序列的质粒(以下称"wtDNA，，)，制备插入有所述第749 位碱基G突变为A的突变abl基因(abl酪氨酸激酶G749A,(氨基 酸信息G250E))的质粒(以下称"mtDNA")。随后将两者配制 成规定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97),将104copy/test ( lpL) 加入到49^L的下述PCR反应液中，进行PCR反应。PCR反应及 荧光强度的检测与前述实施例1同样地进行。
(PCR反应液单位ial)
蒸馏水 31.5 10xgene Taq buffer* 5 40%甘油 6.25 2.5mM dNTPs 4
100pM正义引物 1 (实施例) 0.5 (比较例)
100pM反义引物 0.5 (实施例) 1 (比较例)
5pM检测用探针 0.5
5U/^L Gene Taq FP*__
49pL
正义引物 序列号21
5, -ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3 ，
反义引物 序列号22
5' -ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3 ，
(实施例3 - 1 ) 检测用探针C1 序列号6
5'-(Pacific Blue)-ctcagCgatgatatagaacgg-P-3
(实施例3 - 2 ) 检测用探针C2 序列号7
5 ， -(TAMRA)-cagCgatgatatagaacggg-P-3 ，
(比较例3 - 1 ) 检测用探针 序列号37
5' -(TAMRA)-catgaactcaGcgatgatatag-P-3'
(比專交例3 — 2 ) 检测用探针 序列号38 5 ， —(TAMRA)-cccgttctatatcatcgCtg-P-3 ，这些结果如图3所示。图3为表示随温度上升的荧光强度变 化的Tm分析的图表。图3中，(A)为实施例3- l的结果，(B) 为实施例3 - 2的结果，(C)为比较例3 - l的结果，(D)为比较 例3-2的结果。此外，在相同条件下，各探针与wtDNA( 100%) 形成杂交体的情况、以及各探针与mtDNA ( 100%)形成杂交体 的情况下，各峰值如下所示，并以此作为评价标准。
峰值温度(。c )
探针_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )
实施例3 - 1 ^T5 ^
实施例3 - 2 50.0 60.0
比丰i例3 - 1 52.0 N.D
比较例3 - 2 55.0 N.D
如该图的(A)与(B)所示，使用实施例3- l及实施例3 - 2的探针，结果可检测到与所述评价标准相同的wtDNA的峰 (。C )与mtDNA的峰(。C )。与此相反，如该图中的(C)和图 (D)所示，使用比较例3 - l及比较例3 - 2的探针时，未能观 察到mtDNA的峰。由此结果可知，使用本发明的探针，即使在 mtDNA与wtDNA共存的情况下，也可以提高mtDNA的检测灵敏 度。
实施例4
abl基因第944位碱基的点突变(C—T)
使用本发明的探针，对abl基因第944位碱基的点突变 (C—T)进行Tm分析。
制备插入有序列号1所表示的第944位碱基C未突变的正常 abl基因序列的质粒(以下称"wtDNA，，)，制备插入有所述第944 位碱基C突变为T的突变abl基因(abl酪氨酸激酶C944T,(氨基 酸信息T3151))的质粒(以下称"mtDNA")。随后将两者配制成 头见定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97), 4夺104copy/test ( l^iL )力口入到49jaL前述表3所示的PCR反应液中，进行PCR反应。PCR反 应及荧光强度的才企测与所述实施例1同样地进行。 正义引物 序列号23
5 ， -ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3,
反义引物 序列号24
5' -ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3'
(实施例4 - 1 ) 检测用探针D1 序列号8
5' -(BODIPY FL)-ctcaAtgatgatatagaacg-P-3'
(实施例4 - 2 ) 检测用探针D2 序列号9
5, -actc aAtgatgatat卿ac-(TAMRA)-3,
(比较例4- 1 ) 检测用探针 序列号39
5' -(TAMRA)-cccgttctatatcatcaTtgag—P—3'
(比较例4 - 2) 检测用探针 序列号40 5 ， —(TAMRA)—ccgttctatatcatcaTtg—P-3'
这些结果如图4所示。图4为表示随温度上升的荧光强度变 化的Tm分析的图表。图4中，(A)为实施例4 - l的结果，(B ) 为实施例4-2的结果，(C)为比较例4- l的结果，(D)为比较 例4-2的结果。此外，在相同条件下，各探针与wtDNA( 100% ) 形成杂交体的情况、以及各探针与mtDNA ( 100%)形成杂交体 的情况下，各峰值如下所示，并以此作为评价标准。
峰值温度(。c )探针_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )_
实施例4 _ 1
实施例4 - 2 46.0 55.0
比4交例4 - 1 54.0 59.0
比4交例4 - 2 49.0 54.0
如该图的(A)与(B)所示，使用实施例4_ l及实施例4 -2的探针，结果可才企测到与所述评1介标准相同的wtDNA的峰 (。C )与mtDNA的峰(。C )。与此相反，如该图中的(C)和图 (D)所示，使用比较例4- l及比较例4-2的探针时，未能观 察到mtDNA的峰。由此结果可知，使用本发明的探针，即使在 mtDNA与wtDNA共存的情况下，也可以提高mtDNA的检测灵敏 度。
实施例5
abl基因第951位石威基的点突变(C—G)
使用本发明的探针，对abl基因第951位碱基的点突变 (C—G)进行Tm分析。
制备插入有序列号1所表示的第9 51位碱基C未突变的正常 abl基因序列的质粒(以下称"wtDNA")，制备插入有所述第951 位碱基C突变为G的突变abl基因(abl酪氨酸激酶C951G，(氨基 酸信息F317L))的质粒(以下称"mtDNA")。随后将两者配制 成头见定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97),将104copy/test ( 1 pL ) 加入到49pL前述表3所示的PCR反应液中，进行PCR反应。PCR 反应及荧光强度的检测与所述实施例1同样地进行。
正义引物 序列号25
5 ， -ggacggacggaccgtcctcgttgtcttgttggc-3 ，
反义引物 序列号26
5' _ggacggacggaccgcactccctcaggtagtccag-3'
(实施例5 )检测用探针E1 序列号IO 5, -ttcccgtaggtcatCaac-(TAMKA)-3 ，
(比较例5- 1 ) 检测用探针 序列号41 5' -ttGatgacctacgggaacc-(TAlVlRA)-3'
(比较例5 - 2) 检测用探针 序列号42 5 ， -ttGatgaccUcgggaac-(TAVIRA)-3 ，
(比较例5 - 3 ) 检测用探针 序列号43 5 ， -(TAMRA)—cccgtaggtcatCaactc-P-3 ，
这些结果如图5所示。图5为表示随温度上升的荧光强度变 化的Tm分析的图表。图5中，(A)为实施例5的结果，(B)为 比较例5 - 1的结果，(C )为比较例5 - 1的结果，(D )为比较例 5-3的结果。此外，在相同条件下，各探针与wtDNA ( 100%) 形成杂交体的情况、以及各探针与mtDNA( 100%)形成杂交体 的情况下，各峰值如下所示，并以此作为评价标准。
峰值温度(°c )
探针_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )_
实施例5
比较例5 - 1 58.0 62.0
比较例5 - 2 56.0 60.0
比较例5 —3 N.D. N.D.
如该图的(A)所示，使用实施例5的探针，结果可检测到
与所述评价标准相同的wtDNA的峰(°C )与mtDNA的峰(°C )。
与此相反，如该图中的(B)和(C )所示，使用比较例5 - 1
及比较例5-2的探针时，未能观察到mtDNA的峰。另外，如该图中的(D)所示，使用比较例5 - 3的探针时存在多个峰，无 法进行判断。由此结果可知，使用本发明的探针，即使在mtDNA 与wtDNA共存的情况下，也可以提高mtDNA的检测灵敏度。 实施例6
abl基因第1052位碱基的点突变(T—C) 使用本发明的探针，对abl基因第1052位碱基的点突变 (T—C)进行Tm分析。
制备插入有序列号l所表示的第1052位碱基T未突变的正 常abl基因序列的质粒(以下称"wtDNA，，)，制备插入有所述第 1052位碱基T突变为C的突变abl基因(abl酪氨酸激酶T1052C， (氨基酸信息M351T))的质粒(以下称"mtDNA")。随后将两 者配制成规定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97),将104copy/test (ljiL)加入到49fiL前述表l所示的PCR反应液中，进行PCR反 应。PCR反应及荧光强度的检测与所述实施例l同样地进行。
正义引物 序列号27
5' -ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3 ，
反义引物 序列号28
5' -cacgccctgtgactccatg-3'
(实施例6 ) 检测用探针F1 序列号ll
5' -gtcagccaCggagtacc-(BODIPY FL)-3'
(比较例6 - 1 ) 检测用纟笨针 序列号44
5' -ccactcagatctcgtcagccaCggagtacc-(TAMRA)-3'
(比较例6 - 2) 检测用探针 序列号455 ，《TAMRA)-ccaTggagtEicctEigCgeieig-P-3,
这些结果如图6所示。图6为表示随温度上升的荧光强度变 化的Tm分析的图表。图6中，(A)为实施例6的结果，(B)为 比较例6-l的结果，(C)为比较例6-2的结果。此外，在相同 条件下，各探针与wtDNA ( 100%)形成杂交体的情况、以及各 探针与mtDNA( 100%)形成杂交体的情况下，各峰值如下所示， 并以此作为评i"介标准。
峰值温度(。c )
探针_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )_
实施例6 ^
比较例6 - 1 68.0 73.0
比砵交例6 —2 N.D. N.D.
如该图的(A)所示，使用实施例6的探针，结果可检测到 与所述评价标准相同的wtDNA的峰(。C )与mtDNA的峰(°C )。 与此相反，如该图中的(B )和(C )所示，使用比较例6 - 1 及比较例6-2的探针时，未能观察到mtDNA的峰。由此结果可 知，使用本发明的探针，即使在mtDNA与wtDNA共存的情况下， 也可以提高mtDNA的检测灵敏度。
实施例7
abl基因第1064位碱基的点突变(A—G) 使用本发明的探针，对abl基因第1064位碱基的点突变 (A—G)进行Tm分析。
制备插入有序列号l所表示的第1064位碱基A未突变的正 常abl基因序列的质粒(以下称"wtDNA"),制备插入有所述第 1064位碱基A突变为G的突变abl基因(abl酪氨酸激酶A1064G, (氨基酸信息E355G))的质粒(以下称"mtDNA")。随后将两 者配制成规定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97)，将104copy/test(l[iL)力口入到49pL下述PCR反应液中，进行PCR反应。PCR反 应及荧光强度的4全测与所述实施例1同样地进行。 [表IO]
(PCR反应液单位[il)
蒸馏7jc 28.375
10xgene Taq buffer* 5
40%甘油 9.375
2.5mM dNTPs 4
100^M正义引物 1
100pM反义引物 0.5
5[iM检测用探针 0.5
5U/^L Gene Taq FP*_0.25
总计 49nE
正义引物 序列号29
5 ， -ggccggccccgtggtgctgctgt織tg-3 ，
反义引物 序列号30
5' -cacgccctgtgactccatg-3'
(实施例7 - 1 ) 检测用纟笨针G1 序列号12
5' -gtttttcttcCccaggtactc-(TAMRA)-3'
(实施例7 _ 2 ) 检测用探针G2 序列号13
5' -gtttttcttcCccaggtactcc-(TAMRA)-3'
(比较例7) 检测用探针 序列号46
5' -(TAMRA)-cttcCccaggtactcc-P-3'
这些结果如图7所示。图7为表示随温度上升的焚光强度变 化的Tm分析的图表。图7中，(A)为实施例7- l的结果，(B) 为实施例7-2的结果，(C)为比较例7的结果。此外，在相同条件下，各探针与wtDNA ( 100%)形成杂交体、以及各探针与 mtDNA ( 100%)形成杂交体的情况下，各峰值如下所示，并以 此作为评价标准。 [表ll]
峰值温度(。C )
探针_wtDNA ( 100% )mtDNA ( 100% )
实施例7 - 1 53.0 62.0
实施例7 - 2 55.0 63.0
如该图的(A)和(B)所示，使用实施例7- l及实施例7 -2中的探针，结果可检测到与所述评价标准相同的wtDNA的 峰(。C )与mtDNA的峰(。C )。与此相反，如该图中的(C )所 示，使用比较例7的探针时，未能观察到mtDNA的峰。由此结 果可知，使用本发明的探针，即使在mtDNA与wtDNA共存的情 况下，也可以提高mtDNA的检测灵敏度。
实施例8
abl基因第1075位碱基的点突变(T—G)
使用本发明的探针，对abl基因第1075位碱基的点突变 (T—G)进行Tm分析。
制备插入有序列号l所表示的第1075位碱基T未突变的正 常abl基因的质粒(以下称"wtDNA"),制备插入有所述第1075 位碱基T突变为G的突变abl基因(abl酪氨酸激酶T1075G,(氨 基酸信息F359V))的质粒(以下称"mtDNA")。随后将两者配 制成规定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97),以104copy/test ( lpL ) 加入到49nL前述表4所示的PCR反应液中，进行PCR反应。PCR 反应及荧光强度的检测与所述实施例1同样地进行。
正义引物 序列号31
5 ， -ggccggccccgtggtgctgctgtacatg-3 ，反义引物 序列号32
5' -cacgccctgtgactccatg-3'
(实施例8 - 1 ) 检测用探针H1 序列号14
5' —gatgaCgtttttcttctcc—(TAMRA)—3'
(实施例8 _ 2 ) 检测用探针H2 序列号15
5 ， -tgtggatgaCgtttttcttc-(TAMRA)-3'
(比较例8 - 1 ) 检测用探针 序列号47
5' -(TAMRA)-ctgtggatgaCgtttttc-P-3'
(比较例8 _ 2 )
检测用探针 序列号48
5' -(TAMRA)-cctgtggatgaCgtttttc-P-3'
这些结果如图8所示。图8为表示随温度上升的荧光强度变
化的Tm分析的图表。图8中，(A)为实施例8-l的结果，(B) 为实施例8 - 2的结果，(C )为比较例8 - 1的结果，(D )为比较 例8-2的结果。此外，在相同条件下，各探针与wtDNA( 100%) 形成杂交体、以及各探针与mtDNA( 100%)形成杂交体的情况 下，各峰值如下所示，并以此作为评价标准。 [表12]
峰值温度(。c )
探针_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )_
实施例8 - 1
实施例8 - 2 50.0 60.0
比较例8 - 1 48.0 58.0.
比较例8 - 2 50.0 59.0
如该图的(A)和(B)所示，使用实施例8- l及实施例8-2中的探针，结果可检测到与所述评价标准相同的wtDNA的 峰(°C )与mtDNA的峰(°C )。与此相反，如该图中的(C)和
(D)所示，使用比较例8- l和比较例8-2的探针时，出现多 个峰，无法辨别mtDNA的峰。由此结果可知，使用本发明的探 针，即使在mtDNA与wtDNA共存的情况下，也可以提高mtDNA 的检测灵敏度。 实施例9
abl基因第1187位碱基的点突变(A—G)
使用本发明的探针，对abl基因第1187位碱基的点突变 (A—G)进行Tm分析。
制备插入有序列号1所表示的第1187位碱基A未突变的正 常abl基因的质粒(以下称"wtDNA"),制备插入有所述第1187 位碱基A突变为G的突变abl基因(abl酪氨酸激酶A1187G，(氨 基酸信息H396R))的质粒(以下称"mtDNA")。随后将两者配 制成规定比例(mtDNA: wtDNA=3: 97),以104copy/test ( lpL ) 加入到49(iL下述PCR反应液中，进行PCR反应。PCR反应及荧 光强度的4企测与所述实施例1同样地进行。
(PCR反应液单位pl)
蒸馏水 31.5
10xgene Taq buffer* 5
40%甘油 6.25
2.5mM dNTPs 4
100^M正义引物 0.5
100pM反义引物 0.5
5nM检测用探针 0.5
5U/nL Gene Taq FP*_0.25
总计 49nL
正义引物 序列号33
5' -acctacctacctagatcttgctgcccgaaactg-3反义引物 序列号34
5' -acctacctacctcttgttgtaggccaggctctc-3'
(实施例9 ) 检测用探针Il 序列号16
5 ， —ccagcaCgggctgtgtaggtgtcc—(TAMRA)-3'
(比较例9- 1 ) 检测用探针 序列号49 5 ， -gctccagcaCgggctgtgtaggtgtcc-(TAMRA)-3'
(比举交例9 _ 2 ) 检测用探针 序列号50
5 ， -(TAMRA)-ccagcaCgggctgtgtag-P-3 ，
这些结果如图9所示。图9为表示随温度上升的荧光强度变 化的Tm分析的图表。图9中，(A)为实施例9的结果，(B)为 比较例9-l的结果，(C)为比较例9-2的结果。此外，在相同 条件下，各探针与wtDNA ( 100%)形成杂交体、以及各探针与 mtDNA ( 100%)形成杂交体的情况下，各峰值如下所示，并以 此作为评1^介标准。
峰值温度(。c )
探针_wtDNA ( 100% )_mtDNA ( 100% )_
实施例9 ^
比较例9 - 1 69.0 75.0
比较例9 - 2 55.0 65.0
如该图的(A)，使用实施例9的探针，结果可检测到与所 述评价标准相同的wtDNA的峰(°C )与mtDNA的峰(°C )。与 此相反，如该图中的(B )和(C )所示，使用比较例9 - l和比 较例9-2的探针时，出现多个峰，无法辨别mtDNA的峰。由此 结果可知，使用本发明的探针，即使在mtDNA与wtDNA共存的情况下，也可以提高mtDNA的检测灵敏度。 工业上利用的可能性
如上所述，利用本发明的探针，即使在发生检测目标的突 变的abl基因(突变基因)与未发生突变的abl基因(正常基因) 共存的情况下，也可检测出所述作为检测对象的突变基因。例 如，进行所述的Tm分析时，使用以往的探针的话，如前所述探 针会与仅一个碱基不同的突变基因以及正常基因双方发生杂 交，因而所述的熔解曲线中，两者的信号重叠，很难检测突变 基因的存在。与此相反，若采用本发明的探针，虽然探针也会 与突变基因与正常基因双方杂交，但在熔解曲线中，能够使二 者的信号分离。因此，采用本发明，例如可通过Tm分析来检测 突变基因的存在。
权利要求
1. 一种探针，其为用于检测abl基因的突变的探针，其包含选自由下述(A1)～(I1)组成的组中的至少一种寡核苷酸，(A1)包含序列号2的碱基序列的寡核苷酸、(A2)包含序列号3的碱基序列的寡核苷酸、(B1)包含序列号4的碱基序列的寡核苷酸、(B2)包含序列号5的碱基序列的寡核苷酸、(C1)包含序列号6的碱基序列的寡核苷酸、(C2)包含序列号7的碱基序列的寡核苷酸、(D1)包含序列号8的碱基序列的寡核苷酸、(D2)包含序列号9的碱基序列的寡核苷酸、(E1)包含序列号10的碱基序列的寡核苷酸、(F1)包含序列号11的碱基序列的寡核苷酸、(G1)包含序列号12的碱基序列的寡核苷酸、(G2)包含序列号13的碱基序列的寡核苷酸、(H1)包含序列号14的碱基序列的寡核苷酸、(H2)包含序列号15的碱基序列的寡核苷酸、(I1)包含序列号16的碱基序列的寡核苷酸。
2. 根据权利要求l所述的探针，其中，所述包含(Al)及(A2 )的寡核苷酸的探针为用于检测序列号1的碱基序列中第730位碱基A的突变(A—G)的探针。
3. 根据权利要求l所述的探针，其中，所述包含(Bl)及(B2)的寡核苷酸的探针为用于检测序列号l的碱基序列中第749位碱基G的突变(G—A)的探针。
4. 根据权利要求l所述的探针，其中，所述包含(Cl)及(C2)的寡核苷酸的探针为用于检测序列号l的碱基序列中第943位碱基A的突变(A—G)的探针。
5. 根据权利要求l所述的探针，其中，所述包含(Dl)及944位碱基C的突变(C—T)的探针。
6. 根据权利要求l所述的探针，其中，所述包含(El)的C的突变(C—G)的探针。
7. 根据权利要求l所述的探针，其中，所述包含(Fl)的寡核苷酸的探针为用于检测序列号l的碱基序列中第1052位碱基T的突变(T—C)的探针。
8. 根据权利要求l所述的探针，其中，所述包含(G1)及1064位碱基A的突变(A—G)的探针。
9. 根据权利要求l所述的探针，其中，所述包含(H1)及(H2 )的寡核香酸的探针为用于检测序列号l的碱基序列中第1075位碱基T的突变(T—G)的探针。
10. 根据权利要求l所述的探针，其中，所述包含(Il)的寡核苷酸的探针为用于检测序列号l的碱基中第1187位碱基A的突变(A—G)的探针。
11. 根据权利要求l所述的探针，其中，所述探针为标记探针。
12. 根据权利要求ll所述的探针，其中，所述标记探针为单独时显示信号、通过形成杂交体不显示信号的标记探针，或为单独时不显示信号、通过形成杂交体显示信号的标记探针。
13. 根据权利要求ll所述的探针，其中，所述标记探针为用荧光染料标记的探针，单独时显示荧光，通过形成杂交体而荧光减弱。
14. 根据权利要求13所述的探针，其中，所述探针中，5，末端或3，末端的i咸基为C,所述末端石威基C^皮标记。
15. 根据权利要求l所述的探针，其中，所述探针为Tm分析用探针。
16. —种突变的检测方法，其特征在于，其为检测abl基因中的突变的方法，该方法包括下述(1 ) ~ ( 3 )工序，(1) 配制反应液的工序，所述反应液包含含有DNA的样品与权利要求1中所述的探针；(2) 改变所述反应液的温度，测定所述DNA与所述探针的杂交产物显示熔解状态的信号值的工序；(3 )由伴随温度变化的所述信号值的变化，决定突变的有无的工序。
17. 根据权利要求16所述的突变检测方法，其中，所述样品 为血液样 品。
18. —种白血病诊断方法，其为白血病的i貪断方法，其特征在于，包含通过权利要求16所述的突变的检测方法，检测abl基因中的突变的工序。
19. 根据权利要求18所述的白血病诊断方法，其通过abl基因的突变来判断对白血病治疗药物的耐性。
20. 根据^又利要求19所述的白血病"i貪断方法，其中，所述白血病治疗药物为伊马替尼。
全文摘要
本发明提供一种检测用探针，其即使在仅一个碱基不同的、包含突变的检测对象序列与不含突变的非检测对象序列共存的情况下，也能检测所述包含突变的检测对象序列。使用选自由序列号2～16所组成的组中的至少一种寡核苷酸作为探针。例如通过在Tm分析中使用这些探针，即便是包含发生突变的abl基因与未发生突变的abl基因的样品，也能检测出前者的突变。
文档编号C12Q1/68GK101548022SQ20088000083
公开日2009年9月30日 申请日期2008年2月19日 优先权日2007年2月20日
发明者前川平, 平井光春, 木村晋也, 间岛智史 申请人:爱科来株式会社