重组微生物的制作方法

专利名称：：重组微生物的制作方法
技术领域：
：本发明涉及用于产生有用的蛋白质或多肽的重组微生物，以及产生蛋白质或多肽的方法。
背景技术：
：使用微生物在工业上生产有用的物质被用于大范围的物质，其类型包括食品，例如酒精饮料、大豆酱和酱油，以及氨基酸、有机酸、核酸相关物质、抗生素物质、碳水化合物、脂质、蛋白质等。这些物质的应用还扩展至更宽的领域，包括食品、药品、洗涤剂、日用品例如化妆品，以及多种化学原料。关于这种通过微生物在工业上生产有用物质，一个重要的挑战是提高生产率，并且作为其措施，已经进行了通过遗传技术例如突变来培育生产性微生物。近年来，具体地，微生物遗传学和生物技术的进展已经使人们可以使用遗传重组技术和类似技术来更有效地培育生产性微生物。另外，近年来基因组分析技术的迅速进展使得能够尝试解读目标微生物的基因组数据，并且更积极地在工业上利用获得的信息。其基因组数据已公开的工业上有用的宿主微生物的实例包括枯草杆菌(5ac说wsSM&z7fs)Marburg168(非专利文献1)、大肠埃希杆菌(Escherichiacoli)K-12MG1655(非专利文献2)、粒状棒状杆菌(Coiynebacteriumglutamicum)ATCC132032等等，并且已经使用这些基因组数据开发了进一步改良的微生物菌株。然而，尽管进行了这些努力，生产效率未必能令人满意。对于某些类型的微生物，近年来已经构建了其中与芽孢形成早期相关的基因已被缺失或灭活的菌株，从而正在获得提高蛋白质或多肽的生产率的效果。例如，已有报道称，通过使用其中枯草杆菌的sigE基因、sigF基因、spoI正基因、spoIISB基因或sigG基因、或者从spoIVCB基因延伸至spoIIIC基因的区中包括的一组基因已缺失的宿主株，增加纤维素酶和类似物的分泌的生产率(专利文献l)。此外，在枯草杆菌中操纵蛋白质易位系统的功能(Sec路线)由SecA分担，其作用是作为将分泌的蛋白质排出至细胞外部的发动机，并且三种蛋白质，SecY、SecE和SecG构成易位(translocation)0通道(分泌的蛋白质经过此通道)的主要部分，以及SecDF是易位通道的辅因子，等等。尤其是，已报道有能够过度表达编码SecG蛋白质的secG基因的表达载体(专利文献2)，或者其中已通过改变SecG基因的核糖体结合位点来改变secG基因的表达的革兰氏阳性细菌(专利文献3)。由此，显示出在产生外源蛋白质期间SecG基因被破坏的枯草杆菌种属的繁殖受到抑制。也有报道称，在大肠埃希杆菌中，secY基因的变异抑制低温下的繁殖或蛋白质的分泌(非专利文献3)。然而，目前为止，过度表达secY基因、并且芽孢形成相关基因缺失或灭活的微生物还是未知的。JP-A-2003-47490JW-A-2001-510046US-A-2003/0157642Nature,3卯，249,1997Science,277,1453，1997Cell,32，789，1983。
发明内容本发明具有以下几个方面。(1)一种重组微生物，其通过将对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因转染到微生物株中而获得，所述微生物株通过如下方法获得以遗传方式构建成过度表达枯草杆菌的secY基因或与所述secY基因对应的基因，并使选自芽孢形成相关基因和与所述芽孢形成相关基因对应的基因中的一种或多种基因从基因组中缺失或灭活。(2)—种产生如权利要求1所述的重组微生物的方法，其包括在微生物中，将在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点，导入至枯草杆菌的secY基因或与所述secY基因对应的基因的基因组的上游，或者导入至含有枯草杆菌的secY基因或对应基因的基因组上的操纵子的先导基因的上游；或者导入一基因片段，其中，在所述基因片段中，在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点连接在枯草杆菌的secY基因或与所述secY基因对应的基因的上游；使选自芽孢形成相关基因和与所述芽孢形成相关基因对应的基因的一种或多种基因缺失或灭活；和将对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因转染到微生物株中。(3)—种使用重组微生物产生所需的蛋白质或多肽的方法。图1是显示使用通过SOE-PCR法制备的结合核酸片段的基因转染的示意图。图2是说明在枯草杆菌中芽孢形成信号转导的图。图3是显示通过SOE-PCR制备用于产生secY表达增强的菌株的DNA片段的方法的示意图。图4是显示使用SOE-PCR片段通过双交换(doublecrossover)法使目标基因缺失的示意图。具体实施例方式最佳实施方式本发明涉及蛋白质或多肽生产率提高的微生物，以及使用该微生物产生所需的蛋白质或多肽的方法。本发明的发明人已经在微生物基因组上编码的多种基因当中搜索了影响有用的蛋白质或多肽的产生的基因，并发现，当对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因被转染到其中枯草杆菌secY基因已被增强以过度表达枯草杆菌的SecY、以及芽孢形成相关基因被调控的微生物株中时，与改变之前的生产率相比，所需蛋白质或多肽的生产率提高。本发明的重组微生物对所需的蛋白质或所需的多肽具有很高的生产率。因此，当使用该重组微生物进行所需蛋白质或所需多肽的生产时，可以减少生产物质所需的时间或成本。本发明中的氨基酸序列和碱基序列的同一性通过Lipman-Pearson法(Science,227，1435(1985))计算。具体地，同一性通过使用遗传数据处理软件Genetyx-Win(SoftwareDevelopmentCo.,Ltd.)的同源性分析程序(同源性搜索)执行分析来计算，比较的单位大小(ktup)设定为2。在本说明书中，转录起始控制区是包括启动子和转录起始点的区，核糖体结合位点是与Shine-Dalgamo(SD)序列对应的位点，上述Shine-Dalgamo(SD)序列与起始密码子一起形成翻译起始控制区(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，71，1342(1974))。根据本发明，术语基因的上游和下游不是指关于复制起始点的位置，而是上游表示接着目的基因或区的5'-端的区，而下游表示接着目的基因或区的3'-端的区。用于构建本发明的微生物的亲代微生物可以是具有枯草杆菌secY基因或与其对应的基因的任意微生物，并且这些微生物可以是野生型微生物以及突变的微生物。具体地，可以是芽孢杆菌属的细菌、梭状芽孢杆菌(Clostridium)属的细菌、酵母或类似微生物，并且其中优选芽孢杆菌属细菌。而且，从下列角度来看更优选枯草杆菌微生物的全部基因组信息已被披露，由此构建了遗传工程和基因组工程的相关技术，并且该微生物具有分泌和产生蛋白质至细菌细胞外部的能力。本说明书所述的枯草杆菌的各种基因和基因区的名称均基于在Nature,390,249-256(1997)中报道、并且在日本站点JapanFunctionalAnalysisNetworkforBacillussubtilis(BSORFDB)(2004年3月10日更新的1^://^(^11118#11011^.&(1.1/)上在互联网中公布的枯草杆菌基因组数据进行描述。本发明的枯草杆菌secY基因是指具有SEQIDNO:1所示的碱基序列的基因。与枯草杆菌secY基因对应的基因是指功能与枯草杆菌secY基因基本相同的基因，例如，可以是主要通过基因组分析鉴定的各secY基因，以及在地衣芽孢杆菌(Bacilluslicheniformis)、炭疽芽孢杆菌(Bacillusanthracis)、蜡状芽孢杆菌(Bacilluscereus)、苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)、Oceanobacillusiheyensis等中编码SecY蛋白质的基因。此外，有许多情况下，在微生物诸如炭疽芽孢杆菌中鉴定出两种类型的相应基因。作为与枯草杆菌secY基因对应的基因，可以是下列(1)至(4)的基因的任意者。(1)包括如下DNA的基因与SEQIDNO:l所示的碱基序列的同一性为至少90%、优选至少95%、且更优选至少99%，并且编码与具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质功能相当的蛋白质。(2)包括如下DNA的基因在严格条件下与包括与SEQIDNO:1所示的碱基序列互补的碱基序列的DNA杂交，并且编码与具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质功能相当的蛋白质。另外，对于本文所用的"严格条件"，可以是，例如，分子克隆-实验手册第三版(MolecularCloning-ALABORATORYMANUALTHIRDEDITION)[JosephSambrook,DavidW.Russell,ColdSpringHarborLaboratoryPress]中所述的方法，例如，可以是如下杂交条件在含6xSSC(lxSSC的组成0.15M氯化钠，0.015M拧檬酸钠，pH7.0)、0.5%SDS、5xDenhardts和1.00mg/mL鲱精(herringsperm)DNA的溶液中，与探针一起在65'C下保持恒温8-16小时。(3)包括如下DNA的基因编码与SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的同一性为至少卯％、优选至少95%、且更优选至少99%的氨基酸序列，并且编码与具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质功能相当的蛋白质。(4)包括如下DNA的基因编码在SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个或两个或更多个氨基酸的氨基酸序列，并且编码与具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质功能相当的蛋白质。另外，如本文用，在SEQIDNO:2所示的氨基酸序列中缺失、置换或添加一个或两个或更多个氨基酸的氨基酸序列包括缺失、置换或添加一个或数个、优选1-10个氨基酸的氨基酸序列，并且所述添加包括在氨基酸序列的两个末端上添加一个至数个氨基酸。另外，与具有SEQIDNO:2所示的氨基酸序列的蛋白质功能相当的蛋白质是指功能与secY基因编码的蛋白质基本相同、并且能够构成分泌的蛋白质所通过的易位通道的重要部分的蛋白质。术语枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因的过度表达表示观察到在枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因的宿主中表达的量超过通常的表达量。用于过度表达枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因的方式的实例包括将在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点，导入至枯草杆菌的secY基因或与secY基因对应的基因在基因组中的上游，或者导入至含有枯草杆菌的secY基因或与secY基因对应的基因的基因组上的操纵子的先导基因的上游；或者导入一基因片段，在所述基因片段中，在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点连接在枯草杆菌的secY基因或与secY基因对应的基因的上游。在此，在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点不特别地限制，只要该区是在用作宿主的微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点即可，但优选，例如，位于枯草杆菌spoVG基因或aprE基因或与这些基因的任意者对应的基因的上游的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点，并且更优选位于枯草杆菌spoVG基因或与spoVG基因对应的基因的上游的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点。作为枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区，可以是用于控制spoVG基因转录的区，spoVG基因是在JAFAN:JapanFunctionalAnalysisNetworkforBacillussubtilis(BSORFDB)的互联网站点(2004年3月10日更新的http://bacillus.genome.ad.jp/)中作为GeneNo.BG10112公开的基因。更具体地，可以是具有由SEQIDNO:9所示的碱基序列的38号碱基至210号碱基的碱基序列的DNA，或者包括与上述碱基序列同源的碱基序列、并且具有枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区的功能的DNA。此外，作为枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区-核糖体结合位点，可以是包括具有由SEQIDNO:9所示的碱基序列的38号碱基至230号碱基的碱基序列的DNA，或者包括与上述碱基序列同源的碱基序列、并且具有枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区-核糖体结合位点的功能的DNA。与由SEQIDNO:9所示的碱基序列的38号碱基至210号碱基的碱基序列同源的碱基序列或与由SEQIDNO:9所示的碱基序列的38号碱基至230号碱基的碱基序列同源的碱基序列的实例包括(A)包括与如下DNA在严格条件下杂交的DNA的碱基序列上述DNA包括与由SEQIDNO:9所示的碱基序列的38号碱基至210号碱基或38号至230号碱基的碱基序列互补的碱基序列；(B)与由SEQIDNO:9所示的碱基序列的38号碱基至210号碱基或38号碱基至230号碱基的碱基序列的同源性为至少卯％、优选至少95%、且更优选至少99%的碱基序列；和类似序列。另外，在此使用的术语"严格条件"可以如上所述的相同条件作为例子。术语"具有枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的功能"表示当具有功能的DNA被导入至枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因的上游，或导入至含有枯草杆菌secY基因或对应基因的基因组上的操纵子(枯草杆菌rpsJ基因)的先导基因的上游时，secY基因或与secY基因对应的基因被过度表达，从而导致所需的蛋白质或多肽的生产率提高，并且提高的程度还与在下列情况下获得的提高相同其中枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点被导入至枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因的上游，或导入至含枯草杆菌secY基因或对应基因的基因组上的操纵子(枯草杆菌rpsJ基因)的先导基因的上游。转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点导入至secY基因或与secY基因对应的基因在基因组上的上游，或导入至含有枯草杆菌secY基因或对应基因的基因组上的操纵子(枯草杆菌rpsJ基因)的先导基因的上游，包括部分或全部地置换枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因或含有枯草杆菌secY基因或对应基因的基因组上的操纵子的初始转录起始控制区，以及插入并同时保留初始转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点。转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的置换可以例如使用涉及同源重组的已知方法来进行。即，首先，通过已知的方法例如SOE(重叠延伸拼接，splicingbyoverlapextension)-PCR法(Gene,77，61，1989)，在含有该转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的DNA片段的上游，连接含有含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区的上游区的DNA片段，以及药物抗性基因片段，而在前述基因片段的下游，连接含有部分或全部的rpsJ基因的转录起始控制区和结构基因区(其为含有secY基因的操纵子的先导基因)，或者连接含有部分或全部的ipsJ基因的结构基因区的DNA片段。以这种方式，获得DNA片段，其中含有含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区的上游区的DNA片段、药物抗性基因片段、含目标转录起始控制区或目标转录起始控制区结合核糖体的位点的DNA片段、以及含有部分或全部的rpsJ基因的转录起始控制区和结构基因区或含有部分或全部的rpsJ基因的结构基因区的DNA片段以该顺序连接。接下来，当通过已知方法将该DNA片段转染到亲代微生物中时，在亲代微生物基因组的两点处发生双交换同源重组，例如在含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区的上游区，以及包括部分或全部的rpsJ基因的转录起始控制区和结构基因区或包括部分或全部的rpsJ基因的结构基因区的区。结果，可以使用药物抗性基因作为标记物分离出如下转化体其中初始转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点被目标转录起始控制区或目标转录起始控制区-核糖体结合位点置换。以这种方式，导入至基因组上含secY基因的操纵子的上游的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点可以稳定地得以遗传保留。另外，作为用转染用DNA片段转染宿主微生物的已知方法，特别地可以是感受态细胞转化法(J.Bacteriol.93，1925(1967))、原生质体转化法(Mol.Gen.Genet.168，111(1979))、电穿孔法(FEMSMicrobiol.Lett.55，135(1990))等，特别优选感受态细胞转化法。具体地，在使用枯草杆菌作为本发明的宿主微生物的情况下，可使用Mol.Gen.Genet.，223,268(19卯)中所述的方法或类似方法，通过同源重组，进行从含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点到目标转录起始控制区或目标转录起始控制区-核糖体结合位点的置换。如果适当地选择要插入到需要插入的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的两个末端的DNA片段的序列，可以通过如上述置换方法相同的方法，进行目标转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的插入。例如，在该转录起始控制区的上游，连接含有含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区的上游区的DNA片段，以及药物抗性基因，而在该转录起始控制区的下游，连接含有部分或全部的初始转录起始控制区的DNA片段。以这种方式，获得DNA片段，其中含有含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区的上游区的DNA片段、药物抗性基因片段、目标转录起始控制区、以及含有部分或全部的初始转录起始控制区的DNA片段以该顺序连接。随后，将该DNA片段插入至宿主微生物中，然后可以使用药物抗性基因作为标记物分离出转化体。在由此分离的转化体的基因组上，含secY基因的操纵子的初始转录起始控制区和目标转录起始控制区可以稳定地保留，同时二者相互邻接，其间没有任何空隙。另外可选地，当制备和使用其中含secY基因的上游区的DNA片段和药物抗性基因连接在目标转录起始控制区的上游、而含部分或全部的secY基因的DNA片段连接在目标转录起始控制区的下游的DNA片段时，目标转录起始控制区可以稳定地保留，同时立即被导入至secY基因的上游。根据本发明，导入有在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的基因组的上游包括secY基因。上游不受特别的限制，只要该区在rpsJ基因(其为操纵子先导基因)的起始密码子的上游侧，或secY基因的起始密码子的上游侧即可，但优选为包括2000个相邻碱基对的区，更优选包括500个碱基对的区，再更优选包括100个碱基对的区，再更优选包括50个碱基对的区。根据本发明，使用通过将目标转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的片段与secY基因或与secY基因对应的基因的片段连接获得的基因片段，可以进行其中目标转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点连接在secY基因或与secY基因对应的基因的上游的基因片段的导入，上述片段已经通过已知的克隆方法获得，例如使用PCR法，使用枯草杆菌以外的微生物的基因组作为模板，通过已知方法例如限制性内切酶法或SOE(重叠延伸拼接)-PCR法(Gene,77,61(1989))而获得。可以根据已知的转化方法，通过在导入至细胞中的核酸片段与染色体之间的同源重组，可以将这些片段导入染色体。要导入的secY基因或与secY基因对应的基因的碱基序列可以与微生物原始具有的secY基因或与该secY基因对应的基因的碱基序列不一致，只要它是secY基因或与secY基因对应的基因的碱基序列即可。此外，要导入的在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点(例如枯草杆菌spoVG基因的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点)的碱基序列，可以与微生物所具有的碱基序列不一致，只要它是目标碱基序列即可。将核酸片段导入至宿主中的方法的例子可以是感受态细胞转化法、原生质体转化法、电穿孔法等，并且特别优选感受态细胞转化法。此外，这些片段也可以通过载体例如质粒导入至细胞质中。另外，如稍后所述的实施例中所示，由于在通过质粒的方式导入时，通过每个细菌细胞导入一个拷贝，这些片段对于所需蛋白质或多肽的产生发挥充分的效应，因此即使在生产和培养期间一些质粒丢失也几乎不影响该片段。另外，至于允许导入在宿主中的染色体区，优选非必需基因的内在部分、或非必需基因上游的非基因区的内在部分。例如，可以是aprE基因、sacB基因、nprE基因、amyE基因和ybxG基因的内在部分，或这些基因上游的非基因区的内在部分，但优选amyE基因的内在部分、或ybxG基因上游的非基因区的内在部分。如本文所用，术语"非必需基因"是指即使当该基因被破坏时，至少在特定条件下具有该基因的宿主仍能存活的基因。另外，即使导入伴随着非必需基因的缺失，或部分或全部的非必需基因上游的非基因区的缺失，仍不会由此产生任何问题。根据本发明，枯草杆菌的secY基因或与secY基因对应的基因的过度表达，以及与枯草杆菌的Sec途径相关的另一基因(例如，secE基因等)的过度表达可以在不影响所需蛋白质或多肽的生产率的提高的范围内进行，并且一种或两种或多种基因的灭活或缺失也可以并行地实现。另外，基因的灭活或缺失包括基因中的部分或全部碱基的置换和缺失，以及将碱基插入至基因中。下文将更详细地说明使用根据SOE(重叠延伸拼接)-PCR法(Gene，77,61(1989))制备的DNA片段，通过双交换的方式将其中spoVG基因的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点连接在secY基因上游的基因片段导入至宿主基因组的方法。然而，根据本发明的导入方法并无意于局限于以下方法。用于本发明方法中的导入用DNA片段是如下的DNA片段其中在邻近宿主基因组上的导入位点上游的大小为大约0.1-3kb、优选0.4-3kb的片段(下文中称为片段(l))和邻近导入位点下游的大小为大约0.1-3kb、优选0.4-3kb的片段(下文中称为片段(2))之间，以如下顺序插入有含有spoVG基因的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点的片段(下文中称为片段(3))、secY基因片段(下文中称为片段(4))、和药物抗性标记基因例如氯霉素抗性基因的片段(下文中称为片段(5))。首先，在第一轮PCR中制备片段(1)至片段(5)的5个片段。这时，使用如下设计的引物例如，片段(3)上游侧上的10-30个碱基对的序列加入至片段(1)的下游端，片段(3)下游侧上的10-30个碱基对的序列加入至片段(4)的上游端，片段(5)上游侧上的10-30个碱基对的序列加入至片段(4)的下游端，并且片段(5)下游侧上的10-30个碱基对的序列加入至片段(2)的上游(图l)。随后，使用在第一轮中制备的5种类型的PCR片段作为模板，并使用位于片段(1)上游的引物和位于片段(2)下游的引物进行第二轮PCR。从而，片段(3)在加入至片段(1)下游端的片段(3)的序列中发生退火，片段(3)在加入至片段(4)上游端的片段(3)的序列中发生退火，片段(5)在加入至片段(4)下游端的片段(5)的序列中发生退火，并且片段(5)在加入至片段(2)上游的片段(5)的序列中发生退火。由此，作为PCR扩增的结果，可以得到其中片段(l)至片段(5)的五个片段以(1)、(3)、(4)、(5)和(2)的顺序连接的DNA片段(图1)。在此进行的PCR反应可以在文献(PCRProtocols.CurrentmethodsandApplications,B.A.White主编，HumanaPress,pp.251,1993;Gene,77,61(1989))中所述的常规条件下，使用表1所示的引物组，并使用常规PCR用酶试剂盒例如PyrobestDNA聚合酶(TakaraShuzoCo.，Ltd.)而有利地进行。当由此获得的转染用DNA片段通过感受态法或类似方法转染到细胞中时，在细胞内，在基因组上导入位点的上游和下游存在同一性的同源区中发生基因重组，并且通过基于药物抗性标记物的选择，可以分离出用如下基因片段转染的细胞其中SPOVG基因的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合位点连接在secY基因的上游。基于药物抗性标记物的选择可以通过以下方法有利地进行分离在含氯霉素的琼脂培养基上生长的集落，然后选择基因组上的导入通过PCR法使用该基因组作为模板而得到确认的细胞，等等。另外，药物抗性标记基因不受特别的限制，只要它可以用于使用通用的抗生素物质的选择即可，但除氯霉素抗性基因以外，还可以是例如红霉素抗性基因、新霉素抗性基因、壮观霉素(spectinomycin)抗性基因、四环素抗性基因和灭瘟素S抗性基因的药物抗性标记基因。在本发明的重组微生物中，除了由secY基因增强引起的SecY过度表达以外，还实现了从基因组中使一种或多种芽孢形成相关基因和与其对应的基因缺失或灭活。如实施例2和3所示，基因的缺失或灭活是抑制芽孢形成的变化。根据本发明，芽孢形成相关基因的实例包括加速芽孢形成的多组基因，由此这些基因的每一种的缺失或灭活导致芽孢形成的过程基本上被抑制，例如，编码对芽孢形成各期有特异性的sigma因子的一组基因，或者与sigma因子基因的表达和sigma因子的活化相关的一组基因。此外，还包括由相应的sigma因子转录并且参与加速芽孢形成的一组基因。在芽孢杆菌属细菌中，对于枯草杆菌，己经鉴定出17种sigma因子，并且已知存在有如下sigma因子从SigA开始，SigA是参与营养生长期中生长所必需的基因的转录的主要sigma因子(看家sigma因子)，SigH、SigF、SigE、SigG和SigK是控制芽孢形成过程的sigma因子，SigD是控制鞭毛形成或细胞壁消化的sigma因子，SigL是控制某些类型氨基酸或糖的代谢的sigma因子，SigB是控制对环境变化的响应的sigma因子，称为ECFsigma因子的sigma因子等(BacillussubtilisandItsClosestRelatives:FromGenestoCells,A丄.Sonenshein主编，AmericanSocietyforMicrobiology,289页(2002))。其中，己知控制芽孢形成过程的sigma因子根据芽孢形成过程的进程而相继地表达和活化，如图2所示。换句话说，当枯草杆菌进入营养饥饿状态时，首先经由涉及多种蛋白质的多级磷酸盐转导系统(称为磷酸中继系统)发生SpoOA(其为芽孢形成起始控制因子)的磷酸化(Cell,64,545(1991))。更具体地，由于营养饥饿导致细胞质中存在的KinA以及细胞膜中存在的KinB和KinC发生自磷酸化，并且磷酰基经由SpoOF和SpoOB转移至SpoOA，从而产生磷酸化的SpoOA(磷酸化SpoOA)。此外，在涉及KinB的芽孢形成过程的活化过程中需要KapB(Mol.Microbiol.，26，1097(1997))，同时KipA与KipI(其为KinA的自磷酸化抑制剂)结合，以避免其芽孢形成抑制作用(GenesDev.,11，2569(1997))。另外，PhrA抑制RapA的功能，RapA是磷酸化SpoOF的去磷酸化酶(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,94,8612(1997))。KinA、KinB、KinC、SpoOF、Spo0B、Spo0A、KapB、Kipl、KipA、RapA和PhrA分别由基因kinA、kinB、kinC、spo0F、spoOB、spo0A、kapB、kipl、kipA、rapA和phrA编码。伴随着磷酸化SpoOA浓度的增加，抑制SigH的结构基因(sigH)表达的阻抑物AbrB的诱导受到抑制，因此，sigH的转录以依赖于SigA的方式被诱导(J.Bacterio1.，173,521(1991))。另外，在磷酸化SpoOA转录调节功能被参与染色体分离的Soj抑制的同时，也参与染色体分离的SpoOJ抑制Soj的该作用(J.Bacteriol.，182,3446，2000)。Soj和Spo0J分别由soj基因和spoOJ基因编码。在SigH活化后，不对称隔膜的形成将枯草杆菌的细胞质分隔为母细胞侧和子细胞侧。随后，在子细胞侧，磷酸化SpoOA和SigH接合，以诱导含有SigF的结构基因(sigF)的操纵子(spoIIAA-spoIIAB-sigF)的表达(Gene，101，113(1991)),并且在母细胞侧，磷酸化Spo0A和SigA接合，以诱导含SigE前体的结构基因(sigE)的操纵子(spoIIGA-sigE)的转录(J.Bacteriol.，169，3329(1987))。存在有两级抑制，其中SigF被抗sigma因子SpoIIAB在功能上抑制，而抗-抗sigma因子SpoIIAA抑制SpoIIAB的作用。艮P，如SigF的功能缺失的情况一样，SpoIIAA的功能缺失导致芽孢形成的抑制，己知SpoIIAB的功能缺失也能抑制芽孢形成(Proc.Natl.Acad.Sci.USA,87,9221(1990);J.Bacteriol.，173,6678(1991))。而且，活化由SpoIIE控制，Spol正是SpoIIAA的去磷酸化酶(GenesCells,1，881(1996))，并且活化的SigF诱导SpoIIR(其为信号转导蛋白质)的结构基因的转录。据设想，从子细胞侧分泌的SpoIIR活化SpoIIGA，SpoIIGA是位于母细胞侧上的不对称隔膜中的SigE前体活化蛋白酶，并且由此发生SigE的活化(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，92，2012(1995))。SpoIIAA、SpoIIAB、SpoIIE、SpoIIR和SpoIIGA分别由spoIIAA、spoIIAB、spol正、spoIIR和SpoIIGA基因编码。此外，在子细胞侧，SigF诱导SigG的结构基因(sigG)的转录，并且在母细胞侦U，SigE诱导SigK的结构基因(spoIIIC基因和spoIVCBgene)的转录。然而，在母细胞侧上的SigE活化后，在子细胞侧上发生SigG的活化，并且此后在母细胞侧上发生SigK的活化(Mol.Microbiol.，31，1285(1999))。从图2中很显然，在上述的基因中，当缺失或灭活时抑制芽孢形成过程的基因是kinA、kinB、kinC、spo0F、spo0B、spo0A、kapB、kipA、phrA、spo0J、sigH、sigF、sigE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIE、spoIIR、spoIIGA、sigG、spoIIIC和spoIVCB基因。在本发明中要缺失或灭活的芽孢形成相关基因优选地选自属于枯草杆菌的这些基因，并且更优选地选自枯草杆菌的sigF基因、sigE基因和phrA基因。sigF基因是编码sigma因子的基因，其负责在芽孢形成阶段期间从II期开始在枯草杆菌细胞中形成不对称隔膜处的子细胞侧中发生的基因表达，而sigE基因是编码sigma因子的基因，其负责在芽孢形成阶段期间从II期开始在枯草杆菌细胞中形成不对称隔膜处的母细胞侧中发生的基因表达。此外，phrA基因是涉及感受外部生长环境中的变化并以各种方式对其响应所需要的细胞间信息传输的机制中的基因之一，并且基因产物暂时分泌至细胞外。据报道，在细胞外被加工后，该基因作为五肽被摄取至细胞中，并且与RapA蛋白质结合，RapA控制用于传输芽孢形成起始信号的磷-中继系统中的Spo0F的磷酸化，从而参与芽孢形成起始信号的转导(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，94,8612(1997))。上述基因的每一种基因的基因编号和功能总结于表6。与芽孢形成相关基因诸如kinA、kinB、kinC、spo0F、spo0B、spo0A、kapB、kipA、phrA、spo0J、sigH、sigF、sigE、spoIIAA、spoIIAB、spoIIE、spoIIR、spoIIGA、sigG、spoIIIC和spoIVCB对应的基因是功能与上述基因的任一种基本相同的基因，并且例如，可以是来自另一微生物的基因，优选来自芽孢杆菌属细菌的基因，其碱基序列与这些基因的任一种的碱基序列的同一性为至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、再更优选至少95%、再更优选至少98%。另外，碱基序列的同一性在此根据Lipman-Pearson法计算(Science,227,1435(1985))。这些基因的缺失或灭活可以是前述各种基因当中单个基因的缺失或灭活，或可以是其两种或多种的组合的缺失或灭活。此外，目标基因之外的基因的增强或缺失或灭活也可以并行地进行。另外，基因的缺失或灭活包括基因中的部分或全部碱基的置换或缺失，以及将碱基插入至基因中。对于一组基因或单个基因的缺失或灭活的顺序，可以是有意地缺失或灭活目标基因(靶基因)的方法，以及通过缺失或灭活使随机基因突变、然后进行蛋白质生产率的评价并通过适当方法进行遗传分析的方法。为了使靶基因缺失或灭活，例如，可以使用涉及同源重组的方法。即，可以将通过将含有部分靶基因的DNA片段克隆到适当的质粒中获得的环状重组质粒，转染到亲代微生物的细胞中，使得亲代微生物的基因组上的靶基因被靶基因的某些区中的同源重组分开，从而使靶基因灭活。另外可选地，如图3所示，根据PCR法或类似方法，通过构建经由突变例如碱基置换或碱基插入而灭活的靶基因，或者构建含有靶基因的上游和下游区但不含有靶基因的线性DNA片段，并将所得物转染到亲代微生物细胞中，从而在亲代微生物的基因组上的靶基因内突变位点外的两个位点处，或者在靶基因的上游侧和下游侧上，引起双交换同源重组，也可以用缺失或灭活的基因片段置换基因组上的耙基因。具体地，在使用枯草杆菌作为构建本发明的微生物的亲代微生物的情况下，已经有几个关于通过同源重组缺失或灭活靶基因的方法的报道(Mol.Gen.Genet.，223，268(1990)等)，由此通过重复这些方法可以获得本发明的宿主微生物。随机基因的缺失或灭活也可以通过诱导同源重组的方法进行，例如使用随机克隆DNA片段的上述方法，或者通过用放射照射亲代微生物的方法进行。下文将更具体地解释使用根据SOE(重叠延伸拼接)-PCR法(Gene,77，61(1989))制备的缺失用DNA片段通过双交换进行缺失的方法，但本发明中的基因缺失方法并不限于以下方法。本发明中使用的缺失用DNA片段是通过将药物抗性标记基因片段插入在邻接于要被缺失基因上游的大小为大约0.1-3kb、优选0.4-3kb的片段和邻接于要被缺失基因下游的大小为大约0.1-3kb、优选0.4-3kb的片段之间而制备的片段。首先，通过第一轮PCR制备三个片段要被缺失基因的上游片段和下游片段，以及药物抗性标记基因片段，这时，使用如下设计的引物例如，药物抗性标记基因上游侧上的10-30个碱基对的序列加入至上游片段的下游端，反过来，药物抗性标记基因下游侧上的10-30个碱基对的序列加入至下游片段的上游端(图4)。随后，使用在第一轮中制备的三种类型的PCR片段作为模板，并使用上游片段的上游侧引物和下游片段的下游引物进行第二轮PCR。从而，药物抗性标记基因片段在加入至上游片段的下游端和下游片段的上游端的药物抗性标记基因序列中发生退火，并且作为PCR扩增的结果，可以得到药物抗性标记基因插入在上游侧片段和下游侧片段之间的DNA片段(图4)。在使用氯霉素抗性基因作为药物抗性标记基因的情况下，通过在文献(PCRProtocols.CurrentmethodsandApplications,B.A.White主编，HumanaPress，pp.251,1993;Gene,77,61(1989))中所述的常规条件下，使用表1所示的引物组，并使用常规PCR用酶试剂盒例如PyrobestDNA聚合酶(TakaraShuzoCo.,Ltd.)来进行SOE-PCR，获得用于缺失各种基因的DNA片段。当由此获得的缺失用DNA片段通过感受态法或类似方法转染到细胞中时，在细胞内，在要缺失的基因的上游和下游的存在同一性的同源区中发生基因重组，并且通过基于药物抗性标记物的选择，可以分离出其中所需基因已经被药物抗性基因置换的细胞。即，当使用表l所示的引物组制备的缺失用DNA片段被转染时，可以分离在含氯霉素的琼脂培养基上生长的集落，并通过使用基因组作为模板的PCR法或类似方法，确认基因组上的所需基因被氯霉素抗性基因置换。本发明的微生物可以通过将编码所需蛋白质或所需多肽的基因转染到由此产生的微生物中而获得。在此，术语"所需蛋白质或多肽"是指目的之一是生产或纯化的蛋白质或多肽。另外，关于"具有编码所需蛋白质或多肽的基因的微生物"，其中的基因意在包括微生物原本具有的基因，以及该微生物原本不具有的基因，即外源基因。所需蛋白质或所需多肽不受特别的限制，其实例包括在洗涤剂、食品、纤维、饲料、化学品、药物、诊断等中使用的各种工业酶或生理活性肽，并且优选工业酶。此外，就工业酶的功能而言，包括氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂解酶、异构酶、连接酶/合成酶等，并且可以优选为水解酶，例如纤维素酶、？淀粉酶和蛋白酶。对于蛋白酶，可以是来自微生物的蛋白酶，优选来自芽孢杆菌属细菌的蛋白酶，更优选来自克劳氏芽孢杆菌(Bacillusclausii)KSM-K16株(FERMBP-3376)的蛋白酶。来自克劳氏芽孢杆菌KSM-K16株的碱性蛋白酶的更具体的实例包括来自芽孢杆菌属细菌的碱性蛋白酶，其包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列的1号氨基酸至380号氨基酸的氨基酸序列，或者是包括与上述氨基酸序列的同一性为至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、再更优选至少95%、再更优选至少98%的氨基酸序列的蛋白酶。对于纤维素酶，可以是属于多糖水解酶类别中第5家族的纤维素酶(Biochem,J"280，309(1991))，并且其中，可以是来自微生物的纤维素酶，尤其是来自芽孢杆菌属细菌的纤维素酶。例如，可以是来自芽孢杆菌属KSM-S237株(FERMBP-7875)和芽孢杆菌属KSM-64株(FERMBP-2886)的纤维素酶，并且其合适的实例包括来自芽孢杆菌属细菌的碱性纤维素酶，其包括SEQIDNO:6所示的氨基酸序列的1号氨基酸至795号氨基酸的氨基酸序列，或者是包括SEQIDNO:8所示的氨基酸序列的1号氨基酸至793号氨基酸的氨基酸序列的碱性纤维素酶，或者是包括与上述氨基酸序列的同一性为至少70%、优选至少80%、更优选至少90°/。、再更优选95%、再更优选至少98%的氨基酸序列的纤维素酶。此外，对于Y-淀粉酶，可以是来自微生物的Y-淀粉酶，优选来自芽孢杆菌属细菌的，淀粉酶，并且更优选来自芽孢杆菌属KSM-K38株的Y-淀粉酶。合意地，要转染到本发明的微生物中的所需蛋白质或所需多肽的基因与上游的一个或多个区以适当的顺序连接，该一个或多个区选自以下区与基因的转录、翻译和分泌有关的控制区，即，含有启动子和转录起始点的转录起始控制区；含核糖体结合位点和起始密码子的翻译起始控制区；以及分泌信号肽区。具体地，优选具有三个结合区，包括转录起始控制区、翻译起始控制区和分泌信号肽区的基因，另外，合意地，分泌信号肽区来自芽孢杆菌属细菌的纤维素酶基因，而转录起始控制区和翻译起始控制区是纤维素酶基因上游的大小为0.6-1kb的区，并且这些区适当地与所需蛋白质或所需多肽的基因连接。例如，合意地，来自芽孢杆菌属细菌(即KSM-S237株(FERMBP-7875)或KSM-64株(FERMBP-2886))的纤维素酶基因以及该纤维素酶基因的转录起始控制区、翻译起始控制区和分泌信号肽区适当地与所需蛋白质或所需多肽的结构基因连接。更具体地，合意地，包括SEQIDNO:5所示的碱基序列的1号碱基至659号碱基的碱基序列的DNA片段，或包括SEQIDNO:7所示的碱基序列的1号碱基至696号碱基的碱基序列的DNA片段，或者包括与上述碱基序列的同一性为至少70%、优选至少80%、更优选至少90%、再更优选至少95%、再更优选至少98%的碱基序列的DNA片段，或包括由任意上述碱基序列的一部分的缺失、置换或添加得到的碱基序列的DNA片段，适当地与所需蛋白质或所需多肽的结构基因连接。另外，如本文所用，包括由任意上述碱基序列的一部分的缺失、置换或添加得到的碱基序列的DNA片段是指其中任意上述碱基序列的一部分被缺失、置换或添加，但保留了与基因的转录、翻译和分泌相关的功能的DNA片段。编码所需蛋白质或所需多肽的这些基因的导入可以通过如下方法进行例如，(1)通过载体导入，或(2)插入到基因组中。在(1)通过载体导入的情况下，可以通过适当的转化法，例如感受态细胞转化法、原生质体转化法或电穿孔法，导入含有以下基因的载体该基因编码所需蛋白质或所需多肽，并且在上游与选自与基因的转录、翻译和分泌相关的控制区(即含启动子和转录起始点的转录起始控制区)、含核糖体结合位点和起始密码子的翻译起始控制区和分泌信号肽区的一个或多个区以适当的形式连接。在此，载体不受特别的限制，只要它是用于将所需基因转染到宿主中以便增殖并表达该基因的合适的载体核酸分子即可，并且，载体可以是质粒，也可以是，例如，人工染色体，例如YAC和BAC，使用转座子的载体，黏端质粒等等。质粒的实例包括pUB110和pHY300PLK。此外，(2)插入至基因组中可以使用例如涉及同源重组的方法进行。即，具有用于诱导与编码所需蛋白质或所需多肽的基因连接的导入的染色体区的一部分的DNA片段，可以通过将该DNA片段转染到微生物的细胞中、并在染色体区的一些部分中诱导同源重组而结合至基因组中。在此，用于诱导导入的染色体区不受特别的限制，但优选非必需基因区或非必需基因区上游的非基因区。使用本发明的重组微生物产生所需的蛋白质或多肽可以通过如下方法进行将细菌菌株接种至含有可同化碳源、氮源和其他必需组分的培养基中，通过常规微生物培养方法培养菌株，并且培养完成后，收集和纯化蛋白质或多肽。如在后述的实施例中所述，与使用基因未被改变的微生物的情况相比，所需蛋白质或多肽的生产率得到提高。下文将详细地描述构建本发明的重组微生物的方法，以及使用重组微生物产生纤维素酶和淀粉酶的方法。实施例在以下实施例中用于扩增DNA片段的聚合酶链式反应(PCR)中，使用GeneAmpPCR系统(AppliedBiosystems，Inc.)并使用PyrobestDNA聚合酶(TakaraBio，Inc.)和辅助试剂来进行DNA扩增。通过加入1HL适当稀释的模板DNA、20pmol各正义引物和反义引物、以及2.5uPyrobestdna聚合酶，并将反应溶液的总量调节至50mL，制备PCR反应溶液的组合物。在下列反应条件下进行PCR:重复30轮在98。C下10秒、在55匸下30秒和在72'C下l-5分钟(根据所需的扩增产物调节。大致标准是1分钟/1kb)的三阶段温度变化，然后反应在72-C下继续进行5分钟。此外，在下列实施例中，基因的上游和下游不是指从复制起始点开始的位置，而是，上游表示在各种操作和过程中紧接着基因或目的区域的5'-端的区域，而下游表示在各种操作和过程中紧接着基因或目的区域的3'-端的区域。此夕卜，在下列实施例中各种基因和基因区的名称基于在Nature，390:249國256(1997)中报道、并在日本站点JapanFunctionalAnalysisNetworkforBacillussubtilis(BSORFDB)(http://bacillus.genome.ad.JP/，2004年3月10日更新)上在互联网上公布的枯草杆菌基因组数据进行描述。枯草杆菌的转化以下列方式进行。具体地，将枯草杆菌株在SPI培养基(0.20%硫酸铵、1.40%磷酸氢二钾、0.60%磷酸二氢钾、0.10%柠檬酸三钠二水合物、0.50%葡萄糖、0.02%酪蛋白氨基酸(DifcoLaboratories,Inc.)、5mM硫L酸镁、0.25jjM氯化锰和50ng/mL色氨酸)中在37'C下振荡培养，直至生长度值(OD600)达到大约1。在振荡培养后，将一些培养溶液接种至9倍量的SPII培养基(0.20%硫酸铵、1.40°/。磷酸氢二钾、0.60%磷酸二氢钾、0.10%梓檬酸三钠二水合物、0.50%葡萄糖、0.01%酪蛋白氨基酸(DifcoLaboratories,Inc.)、5mM硫酸镁、0.40pM氯化锰和5pg/mL色氨酸)中，并将细胞进一步振荡培养，直至生长度值(OD600)达到大约0.4。由此，制备枯草杆菌的感受态细胞。随后，向100nL由此制备的感受态细胞悬液(SPII培养基中的培养溶液)中加入5mL含各种dna片段的溶液(soe-pcr反应溶液等)，将混合物在37X:下振荡孵育1小时，并且将全部的量涂在含适当药物的LB琼脂培养基(1%色氨酸、0.5%酵母提取物、lc/。NaCl和1.5Q/。琼脂)上。在37'C下静止培养后，分离出生长的集落作为转化体。提取所获得的转化体的基因组，并使用该基因组作为模板通过PCR确认实现了所需的基因组结构的改变。将编码所需蛋白质或多肽的基因转染到宿主微生物中遵循下列的任一种方法进行感受态细胞转化法(J.Bacteriol.，93，1925(1967))、电穿孔法(FEMSMicrobiol.Lett.，55，135(1990))和原生质体转化法(Mol.Gen.Genet"168，111(1979))。对于用于通过重组微生物产生蛋白质的培养，使用LB培养基(1%色氨酸、0.5%酵母提取物和l%NaCl)、2xYT培养基(1.6%色氨酸、1%酵母提取物和0.5%NaCl)、2xL-麦芽糖培养基(2%色氨酸、1%酵母提取物、l%NaCl、7.5。/。麦芽糖和7.5ppm硫酸锰四水合物或五水合物)或CSL发酵培养基(2%酵母提取物、0.5%玉米浸出液(CSL)、0.05%氯化镁七水合物、0.6%尿素、0.2°/丄-色氨酸、10%葡萄糖、0.15%磷酸二氢钠和0.35%磷酸氢二钠，pH7.2)。实施例1构建过度表达secY基因的菌株如下进行过度表达secY基因的变异体的构建(见图3)。使用从枯草杆菌168株中提取的基因组DNA作为模板，并使用PVG-FW和PVG-R，以及secY/PVG-F和secY/Cm-R引物组，通过PCR扩增含spoVG基因的转录起始控制区和核糖体结合位点的0.2kb片段(A)和含spoVG基因的1.3kb片段(B)。此夕卜，使用质粒pC194(J.Bacteriol.，150(2),815(1982))作为模板，并使用表1所示的catf和catr引物组，通过PCR扩增含氯霉素(Cm)抗性基因的0.9kb片段(C)。接下来，通过使用获得的三个片段(A)、(B)和(C)的混合物作为模板，并使用表1所示的PVG-FW2和catr2引物组进行SOE-PCR，获得大小为2.2kb的DNA片段(D)，其中三个片段(A)、(B)和(C)以该顺序连接，spoVG基因的转录起始控制区和核糖体结合位点连接在secY基因的上游(连接成secY基因的起始密码子位于spoVG基因的起始密码子的位置处)，并且Cm抗性基因结合在其下游。随后，使用从枯草杆菌168株提取的基因组数据作为模板，并使用表1所示的amyEfw2和amyE/PVG2-R以及amyE/Cm2-F和amyErv2引物组，通过PCR扩增含amyE基因的5'-端上的区的1.0kb片段(E)，和含amyE基因的3'-端上的区的1.0kb片段(F)。随后，通过使用获得的三个片段(E)、(F)和(D)的混合物作为模板，并使用表1所示的amyEfWl和amyErvl引物组进行SOE-PCR，获得总碱基长度为4.2kb的DNA片段(G)，其中三个片段(E)、(D)和(F)以该顺序连接，secY基因连接在spoVG基因的转录起始控制区和核糖体结合位点的下游，并且在其下游连接有氯霉素抗性基因的大小为2.2kb的DNA片段插入至amyE基因的中央。使用获得的4.2kb的DNA片段(G)，通过感受态细胞法将枯草杆菌168株转化，并分离出在含(10pg/mL)的LB琼脂培养基上生长的集落作为转化体。通过使用从获得的转化体提取的基因组DNA作为模板，并使用表1所示的amyEfw2和secY/Cm-R以及secY/PVG-F和amyErv2引物组，通过PCR确认大小分别为2.5kb和3.1kb的DNA片段的扩增,并且确认其中secY基因连接在spoVG基因的转录起始控制区和核糖体结合位点的下游的DNA片段在枯草杆菌168株的基因组上的amyE基因位点处被插入。由此获得的菌株称为secY-K株。<table>tableseeoriginaldocumentpage26</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>实施例2用药物抗性基因置换基因组中的sigF基因用药物抗性基因置换基因组中的sigE基因的方法将基于图4进行说明。使用从枯草杆菌168株提取的基因组DNA作为模板，使用表1所示的sigF-FW和sigF/Sp-R引物组，通过PCR扩增邻近基因组中sigE基因上游的1.0kb片段(A)。另外，使用上述基因组DNA作为模板，使用sigF/sp-F和sigF-RV引物组，通过PCR扩增邻近基因组中sigF基因下游的1.0kb片段(B)。此外，使用质粒pDG1727(Gene，167,335(1995))DNA作为模板，并使用表1所示的spf和spr引物组，通过PCR制备大小为1.2kb的壮观霉素(Sp)抗性基因区(C)。随后，如图4所示，使用获得的1.0kb片段(A)、l.Okb片段(B)和Sp抗性基因区(C)三个片段的混合物作为模板，并使用表1所示的sigF-FW2和sigF-RV2引物组，根据SOE-PCR法获得其中以1.0kb片段(A)、Sp抗性基因区(C)和l.Okb片段(B)的顺序含有以上三个片段的2.8kb的DNA片段(D)。然后，使用获得的DNA片段(D)，根据感受态细胞转化法进行168株的转化。转化后，分离出在含壮观霉素(100pg/mL)的LB琼脂培养基上生长的集落作为转化株。提取获得的转化体的基因组DNA，并通过PCR确认sigF基因被Sp抗性基因置换。这样，构建缺失sigF基因的菌株(AsigF株)。此外，使用在实施例1中构建的secY-K株通过在转化中用此株更换枯草杆菌168株，构建其中在secY-K株的基因组中sigF基因被Sp抗性基因置换的菌株(secYKAsigF株)。实施例3用药物抗性基因置换基因组中的sigE基因和phrA基因以在实施例2中所示的用药物抗性基因置换sigE基因相同的方式，进行用壮观霉素抗性基因置换168株基因组中的sigE基因和phrA基因，从而构建缺失sigE基因的菌株(AsigE株)和缺失phrA基因的菌株(AphrA株)。对于各菌株的构建，使用表l所示的引物，并且各引物与构建AsigF株中使用的引物的对应关系显示于表2。[表2]<table>tableseeoriginaldocumentpage30</column></row><table>通过用壮观霉素抗性基因置换实施例1中构建的secY-K株的基因组上的sigE基因或phrA基因，构建secYKAsigE株和secYKAphrA株。实施例4评价碱性蛋白酶的分泌和产生实施例1-3中获得的secY-K株、secYKAsigF株、secYKAsigE株和secYKAphrA株的异源蛋白质生产率的评价如下进行使用来自芽孢杆菌属细菌的碱性蛋白酶的生产率作为指标，上述蛋白酶包括SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。作为对照，对枯草杆菌168株、AsigF株、AsigE株和AphrA株也进行评价。即，使用从克劳氏芽孢杆菌KSM-K16株(FERMBP-3376)中提取的基因组DNA作为模板，并使用表1所示的S237pKAPpp-F和KAPter-R(BglII)引物组，通过PCR扩增大小为1.3kb的编码具有SEQIDNO:3所示的氨基酸序列的碱性蛋白酶的DNA片段(W)(Appl.Microbiol.Biotechnol.，43,473(1995))。另夕卜，使用从枯草杆菌KSM-S237株(FERMBP-7875)中提取的基因组DNA作为模板，并使用表1所示的S237ppp-F2(BamHI)和S237pKAPpp-R引物组，通过PCR扩增大小为0.6kb的含碱性纤维素酶基因的启动子区(JP-A第2000-210081号)的DNA片段(X)。随后，使用获得的两个片段(W)和(X)的混合物作为模板，并使用表1所示的S237ppp-F2(BamHI)和KAPter-R(BglII)等引物组进行SOE-PCR，获得大小为1.8kb的DNA片段(Y)，其中碱性蛋白酶基因连接在碱性纤维素酶基因的启动子区下游。将得到的1.8kb的DNA片段(Y)插入在穿梭载体pHY300PLK(YakultHonshaCo.，Ltd.)的BamHI-Bgin限制性酶切位点处，以构建用于评价碱性蛋白酶产量的质粒pHYKAP(S237p)。将根据原生质体转化法构建的质粒pHYKAP(S237p)转染到各菌株中。获得的各重组株在37'C下在lOmLLB培养基中振荡培养过夜，将0.05mL该培养溶液接种至50mL2xL-麦芽糖培养基(2%胰蛋白质胨、1%酵母提取物、l%NaCl、7.5%麦芽糖、7.5ppm硫酸锰四水合物或五水合物和15ppm四环素)中，在3(TC下振荡培养3天。培养后，测定通过离心去除细菌细胞的培养溶液的上清液的碱性蛋白酶活性，以确定培养期间分泌和产生至细菌细胞外的碱性蛋白酶的量。培养上清液中蛋白酶活性的测定如下进行。具体地，向50nL用2mMCaCl2溶液适当稀释的培养上清液中，加入含7.5mM琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-丙氨酸对硝基苯胺(STANA,PeptideInstitute,Inc.)作为底物的100nL75mM硼酸-KCl缓冲溶液(pH10.5)并混合。当反应在30'C下进行时，脱离的对硝基苯胺量的定量通过测量420nm处的吸光度(OD420nm)的变化来进行。在1分钟内使1一mol对硝基苯胺脱离的酶量作为1U。如表3所示，作为碱性蛋白酶活性的测定结果，当使用secY-K株作为宿主时，碱性蛋白酶的生产率等于对照168株(野生型)的生产率，并且特别地，观察不到生产率的提高。另一方面，观察到secYKAsigF株、secYKAsigE株和secYKAphrA株的生产率显著提高，在这些菌株中结合了芽孢形成相关基因的缺失。对于没有进行secY基因表达增强的导入的AsigF株、AsigE株和AphrA株也观察到生产率的提高超过了168株的提高；然而，与secY基因表达的增强相结合，由这些基因的缺失所引起的生产率提高作用的表现显然是增加的。换句话说，设想当首先增加SecY蛋白质(其为分泌机构)的量，然后使芽孢形成相关基因例如sigF、sigE和phrA缺失时，在异源蛋白质生产率的提高方面获得了协同作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage32</column></row><table>实施例5评价碱性纤维素酶的分泌和产生其他异源蛋白质生产率的评价如下进行使用来自芽孢杆菌属细菌的包括SEQIDNO:6所示氨基酸序列的碱性纤维素酶的生产率作为指标。具体地，使用表1所示的237UB1和237DB1引物组，扩增来自芽孢杆菌属KSM-S237株(FERMBP-7875)的碱性纤维素酶基因(JP-A第2000-210081号)的片段(3.1kb)，然后用BamHI限制性内切酶处理，以将该片段插入在穿梭载体pHY300PLK的BamHI限制性酶切位点处。根据原生质体转化法将由此获得的重组质粒pHY-S237转染到各菌株中。由此获得的各重组株在与实施例4相同的条件下振荡培养3天。测定离心去除细菌细胞的培养溶液的上清液的碱性纤维素酶活性，以确定培养期间分泌和产生至细菌细胞外的碱性纤维素酶的量。对于纤维素酶活性的测定，向50mL用1/7.5M磷酸盐缓冲液(pH7.4，WakoPureChemicalIndustries,Ltd.)适当稀释的样品溶液中加入50HL0.4mM对硝基苯基-p-D-纤维三糖苷(SeikagakuCorporation)并混合，并且通过测量420nm处吸光度(OD420nm)的变化，当反应在3(TC下进行时进行脱离的对硝基苯酚量的定量。在1分钟内使1p-mol对硝基苯酚脱离的酶量作为1U。如表4所示，作为碱性纤维素酶活性的测定结果，当使用secY-K株作为宿主时，与对照168株(野生型)相比，观察到较高的碱性纤维素酶的分泌和产生。另外，观察到secYKAsigF株、secYKAsigE株和secYKAphrA株的生产率进一步显著提高，在这些菌株中结合了芽孢形成相关基因的缺失。对于没有进行secY基因表达增强的导入的AsigF株、AsigE株和AphrA株，也观察到生产率的提高超过了168株的提高；然而，与secY基因表达的增强相结合，由这些基因的缺失所引起的生产率提高作用的表现显然是增加的。换句话说，设想当首先增加SecY蛋白质(其为分泌机构)的量，然后使芽孢形成相关基因例如sigF、sigE和phrA缺失时，在生产率的提高方面获得了协同作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>比较例l用药物抗性基因置换rsiX基因以与实施例2所示的用壮观霉素抗性基因置换sigF基因相同的方式，用氯霉素抗性基因置换枯草杆菌168株的基因组上的rsiX基因，从而构建ArsiX株。使用的引物显示于表l，并且使用的各引物与构建AsigF株使用的引物的对应关系显示于表2。另外，以相同的方式用氯霉素抗性基因置换实施例2中构建的AsigF株的基因组上的rsiX基因，从而构建AsigFArsiX株。此外，rsiX基因是编码抑制SigX功能的抗sigma因子(抗-SigX)的基因，SigX是属于枯草杆菌的ECF(胞质外功能)家族的sigma因子之一。SigX在细胞周围环境在热应激或类似情况下发生变化时受到活化，并且具有通过诱导具有识别该活化作用的启动子的基因的转录或操纵子的转录来应付环境变化的功能(J.Bacteriol.，179,2915(1997))。比较例2评价碱性蛋白酶的分泌和产生比较例1中构建的AsigFArsiX株的碱性蛋白酶的分泌生产率的评价以与实施例4相同的方式进行。作为对照，对枯草杆菌168株、实施例1中构建的ArsiX株和AsigF株进行相同的评价。结果，如表5所示，尽管rsiX基因缺失的ArsiX株的蛋白酶生产率高于野生株的生产率，但其中结合有sigF基因的缺失的AsigFArsiX株的生产率则低于AsigF株的生产率。换句话说，确认对于rsiX基因的缺失，没有观察到表现出当与芽孢形成相关基因的缺失结合时的产生异源蛋白质的协同作用。<table>tableseeoriginaldocumentpage34</column></row><table>比较例3用药物抗性基因置换yacP基因、yvdE基因、yurK基因、yhdQ基因和glcT基因通过实施例2所示的用壮观霉素抗性基因置换sigF基因的相同方式，用氯霉素抗性基因置换枯草杆菌168株的基因组上的yacP基因、yvdE基因、yurK基因、yhdQ基因和glcT基因，从而分别构建AyacP株、AyvdE株、AyurK株、AyhdQ株和AglcT株。使用的引物显示于表1,并且使用的各引物与构建AsigF株使用的引物的对应关系显示于表2。另外，通过用氯霉素抗性基因置换实施例2中构建的AsigF株的基因组上的yacP基因、yvdE基因、yurK基因、yhdQ基因和glcT基因，分别构建AsigFAyacP株、AsigFAyvdE株、AsigFAyurK株、AsigFAyhdQ株和AsigFAglcT株。关于与本发明相关的基因，基因编号及其功能在表6中给出。<table>tableseeoriginaldocumentpage35</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>比较例4评价碱性纤维素酶的分泌和产生在比较例3中构建的AyacP株、AyvdE株、AyurK株、AyhdQ株和AglcT株的碱性纤维素酶的分泌生产率的评价通过与实施例5相同的方式进行。作为对照，对枯草杆菌168株也进行评价。结果，如表7所示，观察到AyacP株、AyvdE株、AyurK株和AglcT株的生产率高于野生株的生产率，而AyhdQ株的生产率则稍有下降。而且，在比较例3中构建的AsigFAyacP株、AsigFAyvdE株、AsigFAyurK株、AsigFAyhdQ株和AsigFAglcT株的碱性纤维素酶的分泌生产率的评价通过与实施例5相同的方式进行。作为对照，对枯草杆菌158株和实施例1中构建的AsigF株也进行评价。结果，如表8所示，任何构建的菌株的纤维素酶生产率均低于AsigF株的生产率。换句话说，有力地表明，当与芽孢形成相关基因的缺失结合时表现出产生异源蛋白质的协同作用，是与增强secY基因的表达结合的特征。<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>[表8]<table>tableseeoriginaldocumentpage37</column></row><table>权利要求1.一种重组微生物，其通过将对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因转染到微生物中而获得，所述微生物通过如下方法获得以遗传方式构建成过度表达枯草杆菌(Bacillussubtilis)的secY基因或与所述secY基因对应的基因，并使选自芽孢形成相关基因和与所述芽孢形成相关基因对应的基因中的一种或多种基因从基因组中缺失或灭活。2.—种重组微生物，其通过将对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因转染到微生物株中而获得，所述微生物株通过如下方法获得将在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点导入至枯草杆菌的secY基因或与所述secY基因对应的基因的基因组的上游，或者导入至含有枯草杆菌的secY基因或对应基因的基因组上的操纵子的先导基因的上游；或者所述微生物株通过如下方法获得导入一基因片段，并使选自芽孢形成相关基因和与所述芽孢形成相关基因对应的基因的一种或多种基因缺失或灭活，在所述基因片段中，在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点连接在枯草杆菌的secY基因或与所述secY基因对应的基因的上游。3.根据权利要求2所述的重组微生物，其中所述在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点来源于枯草杆菌的spoVG基因或与所述spoVG基因对应的基因。4.根据权利要求1-3中任意一项所述的重组微生物,其中所述芽孢形成相关基因和与所述芽孢形成相关基因对应的基因是选自kinA基因、kinB基因、kinC基因、spoOF基因、spoOB基因、spoOA基因、kapB基因、kipA基因、phrA基因、spoOJ基因、sigH基因、sigF基因、sigE基因、spoIIAA基因、spoIIAB基因、spol正基因、spoIIR基因、spoIIGA基因、sigG基因、spoIIIC基因、spoIVCB基因和与这些基因对应的基因的一种或多种基因。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的重组微生物，其中所述芽孢形成相关基因和与所述芽孢形成相关基因对应的基因是选自sigF基因、sigE基因、phrA基因和与这些基因对应的基因的一种或多种基因。6.根据权利要求1-5中任意一项所述的重组微生物，其中所述微生物是芽孢杆菌(Bacz7/w)属的细菌。7.根据权利要求6所述的重组微生物，其中所述芽孢杆菌属的细菌是枯草杆菌。8.根据权利要求1-7中任意一项所述的重组微生物，其中选自转录起始控制区、翻译起始控制区和分泌信号区的任何一个或多个区连接在对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因的上游。9.根据权利要求8所述的重组微生物，其中连接有所述转录起始控制区、翻译起始控制区和分泌信号区这三个区。10.根据权利要求8或9所述的重组微生物，其中所述分泌信号区来自芽孢杆菌属的细菌的纤维素酶基因，并且所述转录起始控制区和所述翻译起始控制区来自所述纤维素酶基因上游的大小为0.6-1kb的区。11.根据权利要求8-10中任意一项所述的重组微生物，其中所述转录起始控制区、翻译起始控制区和分泌信号区这三个区形成包括一定碱基序列的DNA片段，或者形成包括任意的所述一定碱基序列的一部分己缺失的碱基序列的DNA片段，其中所述一定碱基序列为具有由SEQIDNO:5所示的碱基序列的纤维素酶基因的1号碱基至659号碱基的碱基序列、具有由SEQIDNO:7所示的碱基序列的纤维素酶基因的1号碱基至696号碱基的碱基序列、或与任意所述碱基序列的同源性为至少70%的碱基序列。12.—种产生如权利要求1所述的重组微生物的方法，其包括在微生物中，将在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点，导入至枯草杆菌的secY基因或与所述secY基因对应的基因的基因组的上游，或者导入至含有枯草杆菌的secY基因或对应基因的基因组上的操纵子的先导基因的上游；或者导入一基因片段，在所述基因片段中，在微生物中具有功能的转录起始控制区或转录起始控制区-核糖体结合的位点连接在枯草杆菌的secY基因或与所述secY基因对应的基因的上游；使选自芽孢形成相关基因和与所述芽孢形成相关基因对应的基因的一种或多种基因缺失或灭活；和将对所需的蛋白质或多肽进行编码的基因转染到微生物株中。13.—种使用根据权利要求1-11中任意一项^f述的重组微生物产生所需的蛋白质或多肽的方法。全文摘要本发明提供了一种蛋白质或多肽生产率提高的重组微生物，以及使用该重组微生物产生蛋白质或多肽的方法。该重组微生物通过将编码所需的蛋白质或多肽的基因转染到微生物株中而获得，上述微生物株通过如下方法获得遗传构建以过度表达枯草杆菌secY基因或与secY基因对应的基因，并使选自芽孢形成相关基因和基因组中与芽孢形成相关基因对应的基因的一种或多种基因缺失或灭活。文档编号C12N1/20GK101652468SQ200880011110公开日2010年2月17日申请日期2008年4月8日优先权日2007年4月10日发明者刘生浩,荒胜俊,远藤圭二申请人:花王株式会社