用于治疗微生物病症的组合物和方法

专利名称：用于治疗微生物病症的组合物和方法
技术领域：
一般而言，本发明涉及通过调控宿主免疫应答来治疗微生物病症。
背景技术：
微生物病原体感染构成全世界的一项主要死因，而且继续构成全球健康的严重威 胁(WH0，The World Health R印ort (2004))。例如，粘附和抹消(attaching and effacing, Α/Ε)细菌病原体诸如肠出血性大肠杆菌(EHEC)和肠致病性大肠杆菌(EPEC)在引起腹泻、 发病和死亡的细菌之中，尤其是在发展中世界的婴儿和儿童中(2)。大肠杆菌0157:Η7( — 种EHEC菌株)去年在美国引起许多人住院和3例死亡(MMWR Morb Mortal Wkly Rep 55，1045 (S印29，2006))。还认为工业化国家所有腹泻后溶血尿毒综合征(HUS)病例中超 过 90%是由大肠杆菌 0157:H7 感染引起的(R. L. Siegler，Pediatr Clin North Am 42， 1505 (Dec, 1995))。其它EPEC菌株诸如大肠杆菌055:H7也在全世界的婴儿中引起肠病 (T. S. Whittam 等，Infect Immun 61，1619 (May，1993))。我们关于宿主如何控制 Α/Ε 病原 体感染的许多知识来自对啮齿类柠檬酸杆菌(Citrobacterrodentium)(小鼠中的一种天 然病原体)感染的研究(L. Eckmann, Ann NY AcadSci 1072，28 (August 1,2006)) 与人类 中EHEC或EHPC的发病机制相似，啮齿类柠檬酸杆菌对鼠结肠上皮细胞的紧密粘附导致刷 状缘微绒毛的抹消(称作附着和抹消(A/E)损害)及结肠增生(D. B. Schauer，S. Falkow, Infect Immun61，2486(Jun，1993))。肠上皮和免疫细胞都在宿主针对Α/Ε病原体的防御中发挥至关重要的作 用。肠上皮细胞的紧密连接构成阻止微生物离开肠腔的第一道屏障(T.T.MacDonald， G.Monteleone，Science 307，1920 (March 25，2005))。另外，上皮细胞分泌抗微生物肽来控 制胃肠(GI)道中的病原体(A. Takahashi 等，FEBSLett 508,484(Nov 23,2001)) 用啮齿 类柠檬酸杆菌感染期间的免疫缺陷小鼠品系进行的研究确立了 CD4+ T细胞、B细胞、和抗 啮齿类柠檬酸杆菌特异性抗体应答都是抑制和根除感染的适应性免疫的关键成分(L. Bry, M. B. Brenner,J Immunol 172，433 (January 1，2004))。感染期间由淋巴细胞生成的许多细 胞因子能增强上皮细胞的先天免疫应答。然而，仍然不清楚这些细胞因子在A/E病原体感 染期间的具体功能。IL_22(—种IL-10家族细胞因子)是由淋巴细胞(特别是Thl7细胞)生成的 (Y. Zheng 等，Nature 445,648 (Feb 8,2007)) Thl7 细胞属于最近发现的、也生成 IL-17 的⑶4+ T辅助细胞子集。IL-17在控制细胞外细菌感染中具有重要功能(K. I. Happel等， J. Exp. Med. 202，761 (September 19，2005))。然而，仍然不太知道IL-22在宿主防御中的作 用。肿瘤坏死因子(TNF)相关蛋白在本领域被认定为具有多种活性(范围自宿主防御至对 凋亡的免疫调节)的蛋白质大家族。TNF最初被鉴定为在体外对数种转化细胞系有细胞毒 性且在体内引起某些肿瘤坏死的血清衍生因子。在该超家族中鉴定到一种相似的因子，并 称作淋巴毒素(“LT")。由于二十世纪八十年代早期在TNF和LT之间观察到的相似性， 有人提出将TNF和LT分别称作TNF- α和TNF- β。如此，科学文献提到这两种命名。如本 申请中所使用的，术语“TNF”指TNF-α。稍后的研究揭示了淋巴毒素的两种形式，称作LT α和LT β。US 2005-0129614记载了基于结构和生物学相似性的TNF配体超家族的另一种多 肽成员，其被称作TL-5。TNF蛋白质家族的成员以膜结合的形式(其经由细胞-细胞接触 局部地起作用)或作为分泌蛋白存在。一个TNF相关受体家族与这些蛋白质起反应，并触 发多种信号传导途径，包括细胞死亡或凋亡、细胞增殖、组织分化、和促炎症应答。TNF-α自 己涉及炎性疾病、自身免疫性疾病、病毒、细菌、和寄生物感染、恶性肿瘤、和/或神经变性 性疾病，而且是诸如RA和克罗恩氏病等疾病中特定生物学疗法的有用靶物。发明概述本发明提供用于通过调控宿主免疫应答来治疗微生物病症的组合物和方法。例 如，可以通过提高或降低一种或多种介导抗微生物免疫应答的抗微生物多肽(AMP)的活性 来增强或抑制宿主中的抗微生物免疫应答。更具体地说，本发明提供AMP、其调控剂、及使用此类组合物来治疗微生物感染的 方法。所述微生物病症包括但不限于传染病例如由EHEC和EPEC引起的腹泻、炎性肠病 (IBD)和更具体的溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)。本发明的AMP是介导抗微生物免疫应答的多肽，而且包括但不限于LT、IL-6、 IL-18、IL-22、IL-23(包括例如IL-23 pl9或IL-23 p40)、和由Reg超家族的基因编码的 Reg或Reg相关蛋白质。Reg超家族包括来自人、大鼠、和小鼠的Reg和Reg相关基因，而且 分成四个亚类，即I型、II型、III型、和IV型。例如，I型包括人REG I α、人REG I β、大 鼠Regl、和小鼠RegI ；II型包括小鼠RegII ；III型包括人REG III、人HIP/PAP(在肝细胞 癌-肠_胰中表达的基因/编码胰腺炎相关蛋白的基因)、大鼠PAP/肽23、大鼠RegIII/ PAPII、大鼠PAP III、小鼠 RegIII α、RegIII β、RegIII γ、小鼠 RegIII δ、和仓鼠 INGAP (胰 岛新生相关蛋白)。IV型含有人REG IV。在一个方面，所述REG蛋白质由人REG基因家族 的成员编码，包括但不限于REG I α、REG I β、HIP/PAP、REG III、REG IV、和Reg相关序列 (RS)。在一些方面，本发明AMP的氨基酸序列包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO 2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18、SEQID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :36、SEQ IDNO 38,SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO 50, SEQ ID NO 52, SEQ ID NO :54、和 SEQ IDNO :56。在其它方面，编码本发明AMP的核酸序列包含选自下组的核酸序列SEQ ID NO USEQ ID N0:3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO =IUSEQ ID N0:13、 SEQ ID N0:15、SEQ ID NO : 17、SEQID NO : 19、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、 SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :35、SEQ IDNO 37、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO 49,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO :53、和 SEQ IDNO :55。本发明AMP的活性可以相对于另一种AMP或同一种AMP的活性提高或降低和/或 差异调节。本发明AMP的活性的例子包括但不限于AMP表达、结合至结合配偶、信号转导、 抗微生物活性、或其其它生物学或免疫学活性。在一个方面，一种或多种本发明AMP的活性的升高导致受试者中增强的抗微生物
5免疫应答。在一个方面，本发明的AMP包括但不限于与IL-22直接或间接相互作用的多肽，例 如位于介导宿主对微生物病原体(例如细菌或病毒)感染的抵抗力的IL-22信号转导途径 的上游或下游的多肽。此类AMP的例子包括但不限于LT、IL-6、IL-18、和IL-23 (包括例如 IL-23 pl9 或 IL-23 p40)。本发明的调控剂包括但不限于直接或间接调控AMP活性的多肽和核酸分子(例如 DNA分子或RNA分子)。所述调控的例子包括但不限于本发明AMP活性的升高、降低、诱导 或活化、抑制、或调节(例如上调或下调)。在一个方面，所述调控剂通过降低或抑制IL-22结合蛋白(BP)活性并由此提高 IL-22活性来间接调控IL-22活性。在一个具体的方面，所述调控剂降低或抑制IL-22 BP 结合IL-22并由此提高IL-22活性。在一些方面，所述调控剂是多肽，例如结合AMP或以其它方式与AMP相互作用以提 高、诱导、或调节AMP活性的多肽。在一个方面，所述调控剂是调控AMP活性的融合多肽。在一个方面，所述调控剂是结合AMP的抗体。在一个具体的方面，所述抗体是单克 隆抗体。在另一个方面，所述抗体是选自Fab、Fab，_SH、Fv、scFv、或(Fab，)2片段的抗体 片段。在另一个方面，所述抗体是融合多肽(例如Fc融合多肽)。在另一个方面，所述抗 体是嵌合抗体。在一个具体的方面，所述抗体是人源化的。在另一个方面，所述抗体是人抗 体。在另一个方面，所述抗体与选自人、非人灵长类、或其它哺乳动物(例如猪、绵羊、家兔、 土拨鼠、大鼠、或小鼠)的抗体结合相同表位。在一个具体的方面，所述抗体是AMP激动剂。在另一个具体的方面，所述调控剂是重组AMP或编码AMP的核酸分子(例如DNA 或RNA分子)。本发明进一步提供通过调控抗微生物免疫应答来治疗微生物病症的方法。在一个 方面，本发明提供治疗受试者中的微生物病症的方法，包括对所述受试者施用有效量的包 含AMP或AMP调控剂的药物组合物，其中所述AMP选自下组LT、IL_6、IL-18、IL-22、IL-23、 REG I α ,REG I β、HIP/PAP、REG III,REG IV 和 Reg 相关序列(RS)。在一个方面，所述病症 是传染病例如由EHEC或EPEC引起的腹泻、炎性肠病(IBD)或更具体的溃疡性结肠炎(UC) 或克罗恩氏病(⑶)。在具体的方面，本发明提供通过刺激或抑制由AMP介导的信号传导途径和/或 细胞功能来调控抗微生物免疫应答的方法。所述方法对于治疗微生物病症是有用的。
例如，在一个方面，本发明提供通过刺激由AMP介导的信号传导途径例如由IL-22和/或 IL-23介导的信号传导途径来增强抗微生物免疫应答的方法。在另一个方面，本发明提供通 过刺激或抑制由细胞因子介导的信号传导途径来调控抗微生物免疫应答的方法。例如，在 一个方面，本发明提供通过刺激由细胞因子介导的信号传导途径例如IL-22和/或IL-23 信号传导途径来增强抗微生物免疫应答的方法。此外，本发明提供通过刺激或抑制Tht17 细胞功能来调控抗微生物免疫应答的方法。在一个方面，本发明提供刺激生物学系统中由AMP介导的信号传导途径的方法， 该方法包括给所述生物学系统提供AMP激动剂。所述生物学系统的例子包括但不限于体外 细胞培养系统中的或生物体体内的哺乳动物细胞。在另一个方面，本发明提供抑制生物学 系统中由AMP介导的信号传导途径的方法，该方法包括给所述生物学系统提供AMP拮抗剂。
在一个具体的方面，本发明提供通过刺激生物学系统中由IL-23和/或IL-22介 导的信号传导途径来增强生物学系统中的抗微生物免疫应答的方法，该方法包括给所述生 物学系统提供IL-22或IL-22激动剂。在一个方面，所述IL-22激动剂是IL-22。在另一个 方面，所述IL-22激动剂是结合IL-22的抗体。在另一个方面，提供抑制生物学系统中由IL-23介导的信号传导途径的方法，该 方法包括给所述生物学系统提供IL-22拮抗剂。在一个方面，所述IL-22拮抗剂是抗体，例 如中和性抗IL-22抗体和/或中和性抗IL-22R抗体。在另一个方面，本发明提供刺激IV_17细胞功能的方法，该方法包括将IV_17细胞 暴露于AMP的激动剂，其中所述AMP介导由IL-23介导的信号传导途径(例如IL_23、IL_6、 或IL-22)。所述方法对于治疗微生物病症是有用的。在一个方面，IL-22激动剂是IL-22。 在另一个方面，所述IL-22激动剂是结合IL-22的抗体。在另一个方面，提供抑制细胞功能的方法，该方法包括将Tht17细胞暴露 于AMP的拮抗剂，其中所述AMP介导由IL-23介导的信号传导途径(例如IL-23、IL-6、或 IL-22)。在一个方面，所述拮抗剂是抗IL-22抗体，例如中和性抗IL-22抗体。例示性的Thiw7细胞功能包括但不限于刺激由细胞介导的免疫(迟发型超敏感 性)；募集先天免疫细胞，诸如髓样细胞(例如单核细胞和嗜中性粒细胞)至炎症部位；和 刺激炎症细胞浸润入组织中。在一个方面，Tht17细胞功能是由IL-23和/或IL-22介导 的。在又一个方面，本发明提供治疗受试者中的微生物病原体(例如细菌或病毒)感 染的方法，包括对所述受试者施用有效量的包含AMP或AMP调控剂的药物组合物，其中所述 八1^选自下组丄1\比-6、11^-18、比-22、比-23、1 6 I α ,REG I β、HIP/PAP、REG III,REG IV 和Reg相关序列(RS)。在另一个方面，本发明提供治疗受试者中的微生物病症的方法，包括使所述受试 者的细胞接触编码AMP或AMP调控剂的核酸分子(例如DNA或RNA分子)，其中所述AMP选 自下组LT、IL-6、IL-18、IL-22、IL-23、REGI α、REG I β、HIP/PAP、REG III,REG IV 和 Reg 相关序列(RS)。在一个方面，所述病症是传染病例如由EHEC或EPEC引起的腹泻、炎性肠病 (IBD)或更具体的溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩氏病(CD)。在另一个方面，本发明提供调控受到微生物病原体(例如细菌或病毒)感染的受 试者的细胞中AMP的活性的方法，包括使所述细胞接触编码AMP或AMP调控剂的核酸分子 (例如 DNA 或 RNA 分子)，其中所述 AMP 选自下组LT、IL-6, IL-18、IL-22、IL_23、REG I α、 REG I β、HIP/PAP、REG III (例如 REG III β ^ REGIII y) ,REG IV、和 Reg 相关序列(RS)。微生物病原体的例子包括但不限于细菌或病毒。在一个方面，所述微生物病原体 是细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。在一个具体的方面，所述细菌是革兰氏阴性细 菌。在另一个方面，所述细菌是粘附或抹消(A/E)细菌，而且更具体地是肠出血性大肠杆菌 (EHEC)或肠致病性大肠杆菌(EPEC)。在一个方面，所述细菌是肠致病性大肠杆菌(EHEC)， 是大肠杆菌0157: H7或大肠杆菌055: H7。在另一个方面，本发明提供编码本发明AMP或其调控剂的多核苷酸。在另一个方 面，本发明提供包含所述多核苷酸的载体。在另一个方面，本发明提供包含所述载体的宿主 细胞。在一个方面，所述宿主细胞是真核细胞。在另一个方面，所述宿主细胞是CHO细胞、
7酵母细胞、或细菌细胞(例如大肠杆菌)。在一个方面，本发明提供制备结合本发明AMP的抗体的方法，其中该方法包括在 适合于编码所述抗体的多核苷酸表达的条件下培养宿主细胞，并分离所述抗体。在一个具 体的方面，本发明提供制备作为本发明AMP激动剂的抗体的方法。在一个方面，本发明提供检测生物学样品中AMP的存在的方法，包括在容许下述 抗体结合AMP的条件下使所述生物学样品接触AMP的抗体，并检测是否形成所述抗体和AMP 之间的复合物。在另一个方面，本发明提供包含一种或多种本发明AMP和/或其调控剂的试剂盒。 在另一个方面，本发明提供包含一种或多种药物组合物的试剂盒，所述药物组合物每一种 包含本发明的AMP或其调控剂。附图简述

图1描绘的数据展示了针对啮齿类柠檬酸杆菌感染的宿主防御。图1㈧描绘了未 感染野生型小鼠GI道中IL-22受体亚基的实时RT-PCR分析的结果；图I(B-F)描绘了啮齿 类柠檬酸杆菌感染后野生型小鼠结肠中各种细胞因子表达的实时RT-PCR分析；图I(G)描 绘了 C57B1/6 (η = 5)、IL_23p40+(n = 5)、和IL_6+(n = 5)小鼠在啮齿类柠檬酸杆菌感 染后的存活；而图I(H)描绘了啮齿类柠檬酸杆菌感染后C57Bl/6、IL-23p40+、和IL-6+小 鼠结肠中IL-22和IL-17表达的时间过程实时RT-PCR分析。对于啮齿类柠檬酸杆菌感染， 小鼠口服接种2xl09CFU细菌。所有上述数据是两项独立实验的代表。图2描绘的数据展示了 IL-22缺陷使得小鼠对啮齿类柠檬酸杆菌感染易感。6_7 周龄 IL-22+(图 2 (A-C))、IL-17RC+(D)、IL_20Ri3 + 小鼠(图 2(F))或野生型小鼠(图 2(A-C，E)) 口服接种2xl09CFU啮齿类柠檬酸杆菌并在指定时间点称重。来自接种后8天 IL-22+和野生型小鼠的结肠的组织学分析，使用苏木精和曙红(H&E)染色(图2(B和C))。 箭指示粘膜下发炎(图2 (B))和细菌侵入粘液腺中(图2 (C))。显示了代表性数据(图2 (B) 的棒=100 μ m而图2 (C)的棒=25 μ m)。野生型C57B1/6小鼠自第0天或接种后第8天开 始隔天腹膜内接受150μ g抗IL-22单抗或同种型对照IgGl单抗(图2 (E))。< 0. 05， **P < 0. 01，***p < 0. 001。所有数据是两项独立实验的代表。图3描绘的数据展示了啮齿类柠檬酸杆菌感染期间小鼠中IL-22缺陷的影响。 C57B1/6小鼠(图3(A、B、和F))、IL-22+和野生型小鼠(图3(C-E、和G)) 口服接种2xl09CFU 啮齿类柠檬酸杆菌。小鼠还自啮齿类柠檬酸杆菌接种的同一天开始隔天腹膜内接受150 μ g 抗IL-22单抗或同种型对照IgGl单抗(图3 (A和B))。在第10天，对结肠照相，并测量各结 肠长度(图3(A))。使用苏木精和曙红(H&E)染色对结肠实施组织学分析(图3(B))。使用 H&E染色对来自受感染IL-22+和野生型小鼠的结肠和肝(第8天)实施组织学分析(图 3(C和E))。图3(C)中的箭指示结肠透壁性炎症和溃疡形成。图3(E)描绘了 IL-22+小 鼠中的肝脓毒性微脓疡。图3(C)显示了代表性数据，其中上部小图的棒= 500μπι，而下部 小图的棒=100 μ m。在3 (E)中，棒=25 μ m。图3 (D)描绘了结肠、肝、脾、和肠系膜淋巴结 中的啮齿类柠檬酸杆菌的log1(lCFU。图3(F-G)描绘了通过ELISA获得的血清抗啮齿类柠 檬酸杆菌IgG水平。*p<0.05。所有上述数据是两项独立实验的代表。图4描绘的数据展示了 IL-22在啮齿类柠檬酸杆菌感染后诱导抗微生物RegIII 家族蛋白质表达。将C57B1/6小鼠结肠的体外培养物用IOyg IL-22处理24小时，分离
8RNA，并用于微阵列分析(图4(A))和实时RT-PCR分析(图4(B))。在图4(C)中，IL-22+小 鼠和野生型同窝小鼠口服接种2xl09CFU啮齿类柠檬酸杆菌，并对自指定时间点收集的各小 鼠结肠分离的RNA实施实时RT-PCR。所有数据是两项独立实验的代表。图5描绘的数据展示了鼠IL-17RC基因的靶向破坏。图5 (A)描绘了用于生成 IL-17RC敲除小鼠的策略。将涵盖IL-17RC编码序列的外显子1-5(空心框)用新霉素抗 性盒置换。图5(B)描绘了使用指定引物集(P1、P2和P3)对来自野生型(WT)和敲除(KO) 小鼠的后代的基因分型。生成来自WT和KO小鼠的尾尖成纤维细胞，在体外用各种浓度的 IL-17A和IL-17F刺激24小时，并收集培养物上清液，用于IL_6ELISA(图5(C))。图6描绘了啮齿类柠檬酸杆菌感染后野生型小鼠结肠中IL-19、IL_20和IL-24表 达随时间的实时RT-PCR分析的数据。C57B1/6小鼠口服接种2xl09CFU啮齿类柠檬酸杆菌。 在指定时间点收集结肠，并将分离的RNA用于实时RT-PCR分析。图7描绘的数据展示了 GI道中的IL-20Rci和IL_20Ri3表达。未感染野生型小 鼠GI道中IL-19、IL-20和IL-24的受体亚基的实时RT-PCR分析。图8描绘的数据展示了鼠IL_20Ri3基因的靶向破坏。图8㈧描绘了用于生成 IL-20Ri3敲除小鼠的策略。将外显子1(空心框)用新霉素抗性盒置换。图8(B)描绘了 使用指定引物集(pl、p2和p3)对来自野生型(WT)、杂合(HET)和敲除(KO)小鼠的后代的 表型分型。图8(011~和1(0小鼠耳部皮内注射含5001^重组11^20的2(^1 PBS或单独的 20 μ 1 PBS。24小时后，收集小鼠耳，用于分离RNA。将分离的RNA用于对已知在IL-20信 号传导后上调的基因的实时RT-PCR分析。图9描绘了来自接种啮齿类柠檬酸杆菌、用抗IL-22单抗处理的野生型小鼠的小 鼠结肠的组织学分析的数据。C57B1/6小鼠口服接种2xl09CFU啮齿类柠檬酸杆菌。小鼠还 自接种啮齿类柠檬酸杆菌的同一天开始隔天腹膜内接受150μ g抗IL-22单抗或同种型对 照IgGl单抗。在第10天，使用苏木精和曙红(H&E)染色对结肠实施例行组织学分析。箭 指示粘膜溃疡形成及透壁性炎症。显示了代表性图像，上部小图的棒=500 μ m，而下部小图 的棒=250 μ m。图10描绘的数据展示了啮齿类柠檬酸杆菌感染期间IL-22+小鼠和野生型同窝 小鼠中的血清Ig水平。IL-22+和野生型同窝小鼠口服接种2xl09CFU啮齿类柠檬酸杆菌。 在指定时间点，收集小鼠血液。通过ELISA测定总血清IgM和IgG(图10(A))及血清抗啮 齿类柠檬酸杆菌IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3(图10(B))的水平。所有数据是两项独立实 验的代表。图11描绘的数据展示了啮齿类柠檬酸杆菌感染后C57B1/6、IL_23pl9+、和 IL-6+小鼠结肠中IL-22(图11(A))和IL_17(图11(B))表达的离体结肠培养物ELISA。 对于啮齿类柠檬酸杆菌感染，小鼠口服接种2xl09CFU细菌。所有数据是至少两项独立实验 的代表。图12描绘了分离的小鼠IEL、LPMC和结肠上皮细胞上的IL-22R表达的FACS分析 (图12(A))，及原代人结肠上皮细胞上的IL-22R表达的FACS分析(图12(B))。所有数据 是至少两项独立实验的代表。图13描绘的数据展示了由树突细胞(DC)生成的IL-22对于针对啮齿类柠檬酸杆 菌感染的先天性免疫应答是至关重要的。在图13(A)中，Rag2+和野生型Balb/c小鼠口服接种2xl09CFU啮齿类柠檬酸杆菌。在图13(B和C)中，小鼠还自接种细菌的同一天开始 隔天腹膜内接受150 μ g同种型对照IgGl单抗或抗IL-22单抗，并在指定时间点称重。图 13(B)描绘了时间过程实时RT-PCR分析，而图13(C)描绘了啮齿类柠檬酸杆菌感染后野生 型Balb/c和Rag2+小鼠的结肠中的IL-22和IL-17表达的离体结肠培养物ELISA。图13 (D) 描绘了来自受到啮齿类柠檬酸杆菌感染的Rag2+小鼠的第4天结肠中的IL-22、⑶11c、和 DAPI免疫组织化学染色。放大倍数400x。图13(E)描绘的数据证明了在体外IL-23直接 诱导分离的鼠⑶Ilc+ DC生成IL-22，通过ELISA测量。所有数据是两项独立实验的代表。图14描绘的数据展示了 IL-22能在人结肠细胞系中诱导STAT3活化。在图14㈧ 中，IL-22+小鼠和野生型同窝小鼠口服接种2xl09CFU啮齿类柠檬酸杆菌。一组IL-22+小 鼠还接受mRegllI y -Ig融合蛋白。在指定时间点对动物称重并监测Zp <0. 05广ρ <0. 01。 在图14(B)中，IL-23直接诱导分离的人DC生成IL-22，通过ELISA测量。图14(C)描绘 了通过FACS获得的人结肠细胞系上的IL-22R表达。图14(D)描绘的Western印迹显示了 IL-22能在人结肠细胞系中诱导STAT3活化。图14(E)描绘了用IL-22处理的人结肠上皮 细胞系中RegIII β和RegIII Y表达的实时RT-PCR分析。所有数据是两项独立实验的代 表。图15描绘了用于免疫组织化学的抗IL-22单抗的表征。图15㈧描绘了来自第 4天的受到啮齿类柠檬酸杆菌感染的IL-22+和野生型小鼠或未受感染的野生型小鼠的结 肠切片，用偶联有Alexa555的抗IL-22单抗(8E11)或同种型对照染色。图15(B)描绘了 表达IL-22的293细胞的细胞团，用偶联有Alexa555的抗IL-22单抗(8E11)或同种型对 照染色。放大倍数为200x。图16描绘了啮齿类柠檬酸杆菌感染后C57B1/6和IL_23pl9+小鼠结肠中 RegIII γ和RegIII β表达的时间-过程分析。C57B1/6和IL_23pl9+小鼠口服接种 2xl09CFU啮齿类柠檬酸杆菌。在指定时间点，收集小鼠结肠，用于提取RNA和后续小鼠 RegIII γ和RegIII β表达的实时RT-PCR分析。图17描绘了啮齿类柠檬酸杆菌感染后IL-22+和野生型小鼠结肠中其它Reg家 族成员表达的时间_过程分析。IL-22+和野生型同窝小鼠口服接种2x109CFU啮齿类柠檬 酸杆菌。在指定时间点，收集小鼠结肠，用于提取RNA和后续实时RT-PCR分析。图18描绘的数据展示了重组人RegI11_融合蛋白能在啮齿类柠檬酸杆菌感染后 部分保护IL-22+。IL-22+小鼠和野生型同窝小鼠口服接种2xl09CFU啮齿类柠檬酸杆菌。 一组IL-22+小鼠还接受人RegIII_-CFlag融合蛋白。在指定时间点对动物称重并监测。 *p < 0. 05。图19A-C描绘了 161种在来自IL-22处理的结肠中差异表达的基因。图20描绘了 161种在来自IL-22处理的结肠中差异表达的基因的2D分级聚类， 其中通过根据Pearson相关系数有最高联系的矢量的迭代凝聚对选定基因聚类，凝聚矢 量的数据通过平均联系来汇总(where selected genes wereclustered by iterative agglomeration of vectors most highly linked by Pearsoncorrelation coefficient， with data for agglomerated vectors summarized byaverage linkage)。图21描绘的数据展示了 LTbRFc和抗IL-22单抗都在啮齿类柠檬酸杆菌感染后导 致死亡。
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图22描绘的数据展示了 IL-22生成所涉及的多个上游方面的LT途径调节。图23描绘的数据展示了 IL-22部分挽救在用LTbR处理的小鼠中看到的缺陷。图24描绘的数据展示了抗IL-22单抗处理导致结肠滤泡减少、B/T组构受损、及 结肠中DC、T细胞和B细胞数目减少。发明详述本发明提供用于通过调控宿主免疫应答来治疗微生物病症的组合物和方法。本发明人发现了一种介导免疫应答和哺乳动物对传染性微生物病原体的抵抗力 的新细胞因子途径。具体而言，本发明人发现了 IL-22是在粘附或抹消(A/E)细菌病原体 感染早期期间连接适应性免疫应答和先天性上皮防御的关键细胞因子之一。如本文中所显示的，在感染早期阶段期间由免疫细胞生成的细胞因子诸如IL-22 是肠上皮细胞引发完全抗微生物应答和伤口愈合应答以阻止病原性微生物系统性侵入宿 主所必需的。本文中的研究显示IL-22保护肠上皮屏障的完整性并阻止细菌侵入及系统性 扩散。另外，本文中的研究指示IL-22涉及早期抗细菌IgG应答的引发，而且是在细菌感染 期间自结肠上皮细胞诱导抗微生物凝集素诸如RegIII β和RegIII Y不可缺少的。在啮齿 类柠檬酸杆菌感染期间的IL-22+小鼠中，这两种机制之一或二者的缺失可促成宿主防御 应答受损及系统性扩散和死亡升高。如本文中所显示的，对RegIII β和RegIII γ的诱导指示IL-22在控制各种细菌 感染中可具有更宽的功能。本文中的研究进一步支持细胞及其效应器细胞因子在传 染性病症和自身免疫性病症中的作用。另外，本文中的研究指示IL-22及其下游产物诸如 RegIIIii和RegIII γ对于治疗传染性病症可以是有益的。因此，本发明提供通过调控宿主免疫应答来治疗此类微生物病症的方法。例如，可 以通过提高或降低一种或多种介导抗微生物免疫应答的抗微生物多肽(AMP)的活性来增 强或抑制受试者中的抗微生物免疫应答。更具体地说，本发明提供AMP、其调控剂、及使用此类组合物来治疗微生物病症的 方法。所述微生物病症包括但不限于传染病例如由EHEC和EPEC引起的腹泻、炎性肠病 (IBD)和更具体的溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)。通过述及将本文中所引用的所有参考文献包括专利、申请、和科学文献完整收入 本文。通用技术本文中所描述或提到的技术和规程一般得到本领域技术人员的充分理解，而且通 常使用常规方法得以采用，诸如例如下列文献中所记载的广泛应用的方法Sambrook等， Molecular Cloning :A Laboratory Manual第 3片反(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，N. Y. ；CurrentProtocoIs in Molecular Biology (F. M. Ausubel 等㈱，2003) ； JA 书 Methods inEnzymology (Academic Press, Inc.) :PCR 2 A Practical Approach (M. J. MacPherson, B. D. Hames 禾口 G.R.Taylor 编，1995)，Harlow 禾口 Lane 编(1988)Antibodies， A Laboratory Manual， and Animal Cell Culture(R. I. Freshney 1987) ；Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait 1984) ；Methods in MolecularBiology, Humana Press ；Cell Biology :A Laboratory Notebook(J. E. Cellis 编，1998) Academic Press ；Animal Cell Culture (R. I. Freshney 编，1987) ；Introductionto Cell and Tissue Culture(J. P. Mather 和P. Ε· Roberts，1998)Plenum Press ；Cell and Tissue Culture :Laboratory Procedures(A. Doyle, J. B. Griffiths和 D.G. Newell 编，1993-8)J. Wiley and Sons ；Handbook ofExperimental Immunology(D. M. Weir 和 C.C.Blackwell 编)；Gene TransferVectors for Mammalian Cells(J. M. Miller 和 Μ. P. Calos He, 1987) ；PCR =ThePolymerase Chain Reaction, (Mullis 1994) ；Current Protocols inlmmunology(J. E. Coligan 等 编，1991) ；Short Protocols in Molecular Biology(Wiley and Sons,1999) ；Immunobiology(C. A. Janeway 和 P. Travers,1997)； Antibodies (P. Finch,1997) ；Antibodies :A Practical Approach(D. Catty 编，IRLPress, 1988-1989) ；Monoclonal Antibodies :A Practical Approach(P. Shepherd 和 C. Dean 编， Oxford University Press,2000) ；Using Antibodies :A LaboratoryManual (E. Harlow 和 D.Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press,1999) ； TheAntibodies (M. Zanetti 和J. D. Capra 编，Harwood Academic Publishers,1995)；及 Cancer !Principles and Practice of Oncology (V. T. DeVita 等编，J. B. LippincottCompany, 1993)。I.定义为了解释本说明书的目的，应用以下定义，而且在任何适宜的时候，以单数使用的 术语也会包括复数，反之亦然。在下文所列任何定义与通过述及收入本文的任何文件抵触 的情况中，应当以下文所列定义为准。“抗微生物多肽”或“AMP”指介导或以其它方式影响对微生物病原体的抗微生物免 疫应答的多肽，而且涵盖其保留AMP活性(例如抗微生物活性或调控抗微生物免疫应答的 活性)的片段、变体、类似物、衍生物或模拟物。这些方法可用于治疗感染了或有风险感染 传染性微生物病原体(例如病毒或细菌)的受试者。AMP的活性可以相对于另一种AMP或 同一种AMP调控或差异调节(例如上调或下调)。本发明的AMP涵盖天然AMP及其变体形式(在本文中有进一步定义)，而且可 以从多种来源分离，诸如人的组织或其它来源，或者可以通过重组或合成方法制备。天然 AMP可以来自任何物种，例如鼠或人。本发明的AMP包括但不限于LT、IL-6、IL-18、IL-22、 IL-23(包括例如IL-23 pl9或IL-23 p40)、和由Reg超家族的基因编码的Reg或Reg相关 蛋白。Reg超家族包括来自人、大鼠、和小鼠的Reg和Reg相关基因，而且分成四个亚类，即I 型、II型、III型、和IV型。例如，I型包括人REG Ια、人REG I β、大鼠Regl、和小鼠RegI ； II型包括小鼠RegII ；III型包括人REG III、人HIP/PAP (在肝细胞癌-肠-胰中表达的基 因/编码胰腺炎相关蛋白的基因)、大鼠PAP/肽23、大鼠RegIII/ΡΑΡΙΙ、大鼠PAP III、小 鼠RegIII α、RegIII β、RegIII γ、小鼠RegIII δ、和仓鼠INGAP(胰岛新生相关蛋白)。IV 型含有人REG IV。另外，人Reg相关序列(RS)据报告是假基因。在一个实施方案中，所述 REG蛋白质由人REG基因家族的成员编码，包括但不限于REG I α、REG I β、HIP/PAP、REG III、REG IV、和 Reg 相关序列(RS)。淋巴毒素(LT)是肿瘤坏死家族中的一种三聚体细胞因子；由活化的Τ、B、和NK 细胞表达；且涉及炎症应答信号传导和次级淋巴样器官体系结构。“淋巴毒素_”或“LT” 在本文中定义为具有美国专利No. 5，824，509图2Α所示氨基酸序列的生物学活性多肽。 “LT”定义为明确排除人TNFa或其天然动物类似物(Permica等，Nature 312:20/27: 724-729(1984)及 Aggarwal 等，J. Biol. Chem. 260 :2345_2354 (1985))。如本文中所使用的，“LT”指一种或多种如本文中所描述的LT亚基。“淋巴毒素-α ”或“LTa ”定义为明确排除人LT β，例如US 5，661，004中所定义 的。“淋巴毒素α-3三聚体”或“LT α 3”指LT α单体的同三聚体。此同三聚体通过LTiK 跨膜和胞质结构域锚定至细胞表面。“淋巴毒素-α β ”或“ LT α β ”或“ LT α β复合物”指LT α与LT β异三聚体。这 些异三聚体含有两个LT α亚基和一个LT β亚基(LT α 2 β 1)或一个LT α亚基和两个LT β 亚基(LT α 1 β 2) 0如本文中所使用的，术语“LT α β ”或“LTab”指由一个LT α亚基和两个 LT β亚基构成的异三聚体(LR α 1 β 2)。“肿瘤坏死因子受体-I”或“TNFRI”和“肿瘤坏死因子受体-II”或“TNFRII”指 LT α 3同三聚体的细胞表面TNF受体，分别也称作ρ55和ρ75。“淋巴毒素-β受体”或“1^^-1 ”指1^^ β异三聚体所结合的受体。在一些实施方案中，本发明AMP的氨基酸序列包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO :2(人 IL-6)、SEQ ID NO :4 (人 IL-12B)、SEQ ID NO :6 (人 IL-18)、SEQ ID NO 8( A IL-22)、SEQ ID NO 10 (人 IL_23pl9 或 IL-23A)、SEQID NO 12 (人 REG1A)、SEQ ID NO 14(人 REG1B)、SEQ ID NO 16 (人 REG3A，变体 1)、SEQ ID NO 18 (人 REG3A，变体 2)、SEQ ID NO :20(人 REG3A，变体 3)、SEQ ID NO :22 (人 REG3G，变体 2)、SEQ ID NO :24 (人 REG3G，变体 1)、SEQ ID NO 26 (人 REG4)、SEQ ID NO 28 (鼠 IL-6)、SEQID NO 30(鼠 IL-12B)、SEQ ID NO 32(鼠 IL-18)、SEQ ID NO 34(鼠 IL-22)、SEQ ID NO 36(鼠 IL_23pl9 或 IL-23A)、SEQ ID NO 38(鼠 PAP)、SEQ ID NO 40(鼠 REG1)、SEQ ID NO 42(鼠 REG2)、SEQ ID NO 44(鼠 REG3A)、SEQ IDNO :46 (鼠 REG3D)、SEQ ID NO :48 (鼠 REG4)、SEQ ID NO :50 (人LT α )、SEQID NO :52 (人 LT β )、SEQ ID NO :54 (鼠 LT α )、禾口 SEQ ID NO :56 (鼠 LT β )。在其它实施方案中，编码本发明AMP的核酸序列包含选自下组的核酸序列SEQ ID NO :1(人 IL-6)、SEQ ID NO :3 (人 IL-12B)、SEQ ID NO :5 (人 IL-18)、SEQ ID N0:7(人 IL-22)、SEQ ID NO :9 (人 IL_23pl9 或 IL-23A)、SEQID NO :11 (人REG1A)、SEQ ID N0:13(人 REG1B)、SEQ ID NO :15(人 REG3A，变体 1)、SEQ ID NO :17(人 REG3A，变体 2)、SEQ ID NO 19(人 REG3A，变体 3)、SEQ ID NO :21 (人 REG3G，变体 2)、SEQ ID NO :23 (人 REG3G，变体 1)、 SEQ ID NO 25 (人 REG4)、SEQ ID NO 27 (鼠 IL-6) ,SEQID NO 29 (鼠 IL-12B)、SEQ ID NO 31 (鼠 IL-18)、SEQ ID NO 33(鼠 IL-22)、SEQ ID NO 35(鼠 IL-23 pl9 或 IL-23A)、SEQ ID NO 37 (鼠 PAP)、SEQ ID NO 39 (鼠 REG1)、SEQ ID NO 41 (鼠 REG2)、SEQ ID NO 43 (鼠 REG3A)、SEQ IDNO :45 (鼠 REG3D)、SEQ ID NO :47 (鼠 REG4)、SEQ ID NO :49 (人LT α )、SEQID NO :51 (人 LT β )、SEQ ID NO :53 (鼠 LT α )、禾口 SEQ ID NO :55 (鼠 LT β )。“天然序列AMP多肽”或“天然序列AMP多肽”指与衍生自自然界的相应AMP多肽 包含相同氨基酸序列的多肽。此类天然序列AMP多肽可以从自然界分离，或者可以通过重 组或合成手段生成。该术语明确涵盖天然存在的截短或分泌形式的特定AMP多肽(例如缺 少其相关信号肽的IL-22)、该多肽的天然存在变体形式(例如可变剪接形式)和天然存在 等位变体。在本发明的各种实施方案中，本文中所公开的天然序列AMP多肽是成熟的或全 长的天然序列多肽。多肽“变体”指与全长天然多肽序列具有至少约80%氨基酸序列同一性的活性多 肽。通常，多肽变体与全长的或成熟的天然多肽序列将具有至少约80%的氨基酸序列同一性、或者至少约81%的氨基酸序列同一性、或者至少约82%的氨基酸序列同一性、或者 至少约83%的氨基酸序列同一性、或者至少约84%的氨基酸序列同一性、或者至少约85% 的氨基酸序列同一性、或者至少约86%的氨基酸序列同一性、或者至少约87%的氨基酸序 列同一性、或者至少约88%的氨基酸序列同一性、或者至少约89%的氨基酸序列同一性、 或者至少约90%的氨基酸序列同一性、或者至少约91%的氨基酸序列同一性、或者至少约 92%的氨基酸序列同一性、或者至少约93%的氨基酸序列同一性、或者至少约94%的氨基 酸序列同一性、或者至少约95%的氨基酸序列同一性、或者至少约96%的氨基酸序列同一 性、或者至少约97%的氨基酸序列同一性、或者至少约98%的氨基酸序列同一性、和或者 至少约99%的氨基酸序列同一性。“百分比(％ )氨基酸序列同一性”定义为对比序列并在必要时引入缺口以获取最 大百分比序列同一性后，且不将任何保守替代视为序列同一性的一部分时，候选序列中与 特定或参照多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分率。为测定百分比氨基酸序 列同一性目的的对比可以本领域技术范围内的多种方式进行，例如使用公众可得到的计算 机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign (DNASTAR)软件。本领域技术人员可决定 用于测量对比的适宜参数，包括对所比较序列全长获得最大对比所需的任何算法。对于氨 基酸序列比较，给定氨基酸序列A相对于(to)、与(with)、或针对(against)给定氨基酸序 列B的％氨基酸序列同一性(或者可表述为具有或包含相对于、与、或针对给定氨基酸序列 B的某一％氨基酸序列同一性的给定氨基酸序列A)如下计算分数 X/Y 乘 100其中X是由序列对比程序在该程序的A和B对比中评分为相同匹配的氨基酸残基 数，且其中Y是B中的氨基酸残基总数。可以领会，若氨基酸序列A的长度与氨基酸序列B 的长度不相等，则A相对于B的％氨基酸序列同一性将不等于B相对于A的％氨基酸序列 同一性。作为使用这种方法计算％氨基酸序列同一性的例子，下文表1和2演示了如何计 算指派为“参照蛋白质”的氨基酸序列相对于指派为“IL-22”的氨基酸序列的％氨基酸序 列同一性，其中“IL-22”代表感兴趣IL-22多肽的氨基酸序列，“参照蛋白质”代表感兴趣 “IL-22”多肽针对其进行比较的多肽的氨基酸序列，而“X”、“Y”和“Z”各自代表不同氨基 酸残基。表 1IL-22XXXXXXXXXXXXXXX (长度=15 个氨基酸)参照蛋白质 XXXXXYYY YYYY (长度=12个氨基酸)%氨基酸序列同一性=(两种多肽序列间相同匹配的氨基酸残基的数目)除以 (IL-22多肽的氨基酸残基的总数)=5除以15 = 33. 3%表2IL-22XXXXXXXXXX(长度=10 个氨基酸)参照蛋白质 XXXXXYYYYYYZZYZ (长度=15个氨基酸)%氨基酸序列同一性=(两种多肽序列间相同匹配的氨基酸残基的数目)除以 (IL-22多肽的氨基酸残基的总数)=5除以10 = 50%“分离的”生物学分子，诸如本文中所披露的各种多肽、多核苷酸、和抗体，指已经 鉴定且自其天然环境的至少一种成分分开和/或回收的生物学分子。
“有活性的”或“活性”涉及多肽时指天然多肽的生物学和/或免疫学活性，其中 “生物学”活性指除诱导针对天然多肽所拥有的抗原性表位的抗体生成的能力外的天然多 肽生物学功能。“免疫学”活性指诱导针对天然多肽所拥有的抗原性表位的抗体生成的能 力。术语“拮抗剂”以最广义使用，而且包括部分地或完全的阻断、抑制、或中和多肽生 物学活性的任何分子。“拮抗剂”还涵盖完全地或部分地抑制编码多肽的mRNA转录或翻译 的分子。合适的拮抗剂分子包括例如拮抗性抗体或抗体片段；天然多肽的片段或氨基酸序 列变体；肽；反义寡核苷酸；有机小分子；及编码多肽拮抗剂或拮抗性抗体的核酸。提及“一 种”拮抗剂涵盖单一拮抗剂或者两种或更多种不同拮抗剂的组合。术语“激动剂”以最广义使用，而且包括部分地或完全地模拟多肽(例如天然AMP) 生物学活性的任何分子。“激动剂”还涵盖刺激编码多肽的mRNA转录或翻译的分子。合适 的激动剂分子包括例如激动性抗体或抗体片段；天然多肽；天然多肽的片段或氨基酸序列 变体；肽；反义寡核苷酸；有机小分子；及编码多肽激动剂或抗体的核酸。提及“一种”激动 剂涵盖单一激动剂或者两种或更多种不同激动剂的组合。“抗微生物免疫应答”包括但不限于对微生物病原体感染的抵抗或防御。所述抵抗 或防御可导致对微生物病原体的微生物感染性、复制、增殖或其它活性的抑制或降低。具体 而言，导致抗微生物免疫应答的治疗可导致微生物病症或微生物病症症状的缓解。“缓解”、“减轻”或其等同表述指治疗性处理和预防性或防范性措施二者，其中目 标是缓解、预防、减缓(减轻)、降低/减少或抑制所针对的微生物病症或其症状。需要治疗 的受试者包括那些早就患有病症的以及倾向于患上病症的或者要预防病症的。关于治疗微生物病症，“治疗”、“处理”、或其等同表述指改善具有病症的受试者中 的微生物病症或微生物病症症状。“长期”施用指与短期模式相反，以连续模式施用药剂，从而将初始治疗效果维持 较长一段时间。“间歇”施用指不是无间断连续进行的治疗，而是本质上周期性的。为了治疗的目的，“哺乳动物”指归入哺乳类的任何动物，包括人，啮齿类(例如小 鼠和大鼠)，和猴；家畜和牲畜；及动物园、运动、实验或宠物动物，诸如犬、猫、牛、马、绵羊、 猪、山羊、家兔、等。在有些实施方案中，哺乳动物选自人、啮齿类、或猴。类似地，为了治疗 的目的，“受试者”指哺乳动物受试者，而且包括人类和兽医受试者。“联合”一种或多种其它治疗剂的施用包括同时(共同)施用和任意次序的序贯施 用。如本文中所使用的，“载体”包括药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采 用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受载体是PH缓 冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗 氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明 胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天 冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合 剂，诸如EDTA ；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性 剂，诸如 TTOEN 、聚乙二醇(PEG)和 PLUR0NICS 。“抗体” (Ab)和“免疫球蛋白”(Ig)是具有相似结构特征的糖蛋白。虽然抗体展现出对特定抗原的结合特异性，但是免疫球蛋白包括抗体和一般缺乏抗原特异性的其它抗体 样分子二者。后一类多肽例如由淋巴系统以低水平生成及由骨髓瘤以升高的水平生成。术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义可互换使用，而且包括单克隆抗体(例如 全长或完整单克隆抗体)、多克隆抗体、单价抗体、多价抗体、多特异性抗体(例如双特异性 抗体，只要它们展现出期望的生物学活性)，而且还可以包括某些抗体片段(如本文中更为 详细描述的)。抗体可以是嵌合的、人的、人源化的和/或亲和力成熟的。特异性结合特定抗原的抗体指能够以足够亲和力结合抗原，使得该抗体在靶向抗 原中可用作诊断剂和/或治疗剂的抗体。优选的是，根据例如放射免疫测定法(RIA)的测 量，此类抗体与非靶多肽的结合程度小于该抗体对靶抗原的结合的约10%。在某些实施 方案中，结合靶抗原的抗体具有彡luM,^ lOOnM、彡lOnM、彡InM、或彡0. InM的解离常数 (Kd)。抗体的“可变区”或“可变域”指抗体重链或轻链的氨基末端结构域。重链的可变 域可称为“VH”。轻链的可变域可称为“VL”。这些结构域一般是抗体的最易变部分且包含 抗原结合位点。术语“可变的”指可变域中的某些部分在抗体间序列差异广泛且用于每种特定抗 体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均勻分布于抗体的整个可变域。 它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区(CDR)或高变区(HVR)的三个区段。可变域 中更加高度保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR区， 它们大多采取折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成折叠片结构一 部分的三个⑶R连接。每条链中的⑶R通过FR区非常接近的保持在一起，并与另一条链 的⑶R—起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等，Sequences ofProteins of Immunological Interest,第5版，National Institute of Health,Bethesda,MD(1991))。 恒定域不直接涉及抗体对抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的 细胞毒性中抗体的参与。根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体(免疫球蛋白)的“轻 链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(K)和拉姆达(入)。根据其重链恒定域氨基酸序列，抗体(免疫球蛋白)可归入不同的类。免疫球蛋白 分成五大类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGp IgG2、IgG3、IgG4、化~和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作a、 S、￡、y和P。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的，而且一般性记 载于例如Abbas等，Cellular and Mol. Immunology，第4版(2000)。抗体可以是抗体与一 种或多种其它蛋白质或肽共价或非共价关联而形成的更大融合分子的一部分。术语“全长抗体”和“完整抗体”在本文中可互换使用，指基本上完整形式的抗体 而非如下文所定义的抗体片段。该术语具体指重链包含Fc区的抗体。“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分保留该部分存在于完整抗体 中时通常与之有关的至少一项、多至大多数或所有功能。在一个实施方案中，抗体片段包含 完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例 如包含Fc区的抗体片段，保留Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学 功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片
16段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗 原结合臂，其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连接。用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有 一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶 处理产生一个F(ab' )2片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。“Fv”是包含完整抗原结合位点的最小抗体片段。在一个实施方案中，双链Fv种类 由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv(SCFv) 种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连接，使得轻链和 重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，各可变域的三 个CDR相互作用而在VH-VL 二聚体表面上确定一个抗原结合位点。六个CDR共同赋予抗体 以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域(或只包含对抗原特异的三个CDR的半个Fv) 也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。Fab片段包含重链和轻链可变域，而且还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域 (CHl)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CHI结构域的羧基末端增加了少数残基， 包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab' -SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸 残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab' )2抗体片段最初是作为在Fab‘片段之间有 铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联形式。“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的VH和VL结构域，其中这些结构域存在于 一条多肽链上。一般而言，scFv多肽在VH与VL结构域之间还包含多肽接头，使得scFv能 够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Pluckthun，于The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg 禾口 Moore 编，Springer-Verlag, New York, pp.269-315(1994)。术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小型抗体片段，该片段在同一条多肽链 (VH-VL)中包含相连接的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)。通过使用过短的接头使得同 一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从 而产生两个抗原结合位点。双抗体可以是二价的或双特异性的。双抗体更完整地记载于例 如 EP 404，097 ；W093/1161 ；Hudson 等(2003)Nat. Med. 9 :129_134 ；及 Hollinger 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 :6444_6448 (1993)。三抗体(triabody)和四抗体(tetrabody)也 记载于 Hudson 等(2003) Nat. Med. 9 :129-134。如本文中所使用的，术语“单克隆抗体”指从一群基本上同质的抗体获得的抗体， 即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的突变，例如天然存在的突变。 如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是分立的抗体的混合物的特征。在某些实施方案中，此 类单克隆抗体典型地包括包含结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过 包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程获得的。例如，选择过程可 以是从众多克隆诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合中选择独特克隆。应 当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合 序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体 等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型地包含针对 不同决定簇(表位)的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克
17隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性外，单克隆抗体制备物的优势在于它们 通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修饰语“单克隆”表明抗体从一群基本上同质的抗体获得的特征，不应解释为要求 通过任何特定方法来生成抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来 生成，包括例如杂交瘤法(例如 Kohler 等，Nature256 495(1975) ；Harlow 等，Antibodies A Laboratory Manual, Cold SpringHarbor Laboratory Press,第 2 版 1988 ；Hammerling 等，于MonoclonalAntibodies and T-Cell Hybridomas, 563-681, Elsevier, N. Y. , 1981) > 重组DNA法(参见例如美国专利No. 4,816, 567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson 等，Nature 352 :624_628 (1991) ；Marks 等，J. Mol. Biol. 222 :581_597 (1992) ；Sidhu 等， J. Mol. Biol. 338(2) :299_310 (2004) ；Lee 等，J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093 (2004)； Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34) 12467-12472 (2004)；及 Lee 等，J. Immunol. Methods 284(1-2) : 119-132 (2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编 码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如W0 98/24893 ； W0 96/34096 ；W0 96/33735 ；W091/10741 ；Jakobovits Proc.Natl. Acad. Sci. USA 90 2551 (1993) Jakobovits 等，Nature 362 :255_258 (1993) ；Bruggemann 等，Year in Immuno. 7 33 (1993)；美国专利 No. 5，545，807 ；5，545，806 ；5，569，825 ；5，625，126 ； 5, 633, 425 ；5, 661, 016 ；Marks 等，Bio. Technology 10:779-783(1992) ；Lonberg 等， Nature 368 856-859 (1994) ；Morrison, Nature 368 812-813 (1994) ；Fishwild 等， Nature Biotechnol. 14 845-851 (1996) ；Neuberger, Nature Biotechnol. 14 826(1996) 及 Lonberg 禾口 Huszar, Intern. Rev. Immunol. 13 :65_93(1995))。单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍 生自特定物种或属于特定抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分 与衍生自另一物种或属于另一抗体类或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗 体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(美国专利No. 4，816，567 ；及Morrison等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA81 :6851_6855 (1984))。非人(例如鼠)抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白(受体抗体)中的高变 区残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种(供体抗体)诸如小鼠、大鼠、家 兔或非人灵长类的高变区残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的框架 区(FR)残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没 有找到的残基。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体 将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中所有或基本上所有高变环对应于 非人免疫球蛋白的高变环，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗 体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细 节参见 Jones 等，Nature321 :522-525 (1986) ；Riechmann 等，Nature 332:323-329(1988)； 及Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596 (1992)。还可参见以下综述及其引用的参考 文献:Vaswani 禾口 Hamilton, Ann. Allergy, Asthma & Immunol. 1 :105_115 (1998) ；Harris, Biochem. Soc. Transactions 23 :1035-1038 (1995) ；Hurle 禾口 Gross, Curr. Op. Biotech. 5 428-433(1994)。
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“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本 文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人 抗原结合残基的人源化抗体。根据其重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。免疫球蛋白有五 大类IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类(同种型)，例如IgGl、IgG2、 IgG3、IgG4、IgAl 和 IgA2。“亲和力成熟的”抗体指在抗体的一个或多个HVR中具有一处或多处改变、导致 该抗体对抗原的亲和力与没有这些改变的亲本抗体相比有所改进的抗体。在一个实施方 案中，亲和力成熟的抗体具有纳摩尔或甚至皮摩尔量级的对靶抗原的亲和力。亲和力成 熟的抗体可通过本领域已知规程来生成。Marks等，Bio/Technology 10:779-783(1992) 记载了通过VH和VL结构域改组进行的亲和力成熟。以下文献记载了 HVR和/或框架残 基的随机诱变:Barbas 等，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809_3813 (1994) ；Schier 等， Gene 169 147-155 (1995) ；Yelton 等，J. Immunol. 155 1994-2004 (1995) Jackson 等， J. Immunol. 154 (7) :3310_9 (1995)；及 Hawkins 等，J. Mol. Biol. 226 :889_896 (1992)。“阻断性”抗体、“中和性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的 生物学活性的抗体。此类抗体可实质性地或完全地抑制抗原的生物学活性。如本文中所使用的，“激动性抗体”指部分地或完全地模拟感兴趣多肽的生物学活 性的抗体。抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体 Fc区)且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括Clq结合和补 体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细 胞表面受体(例如B细胞受体)下调；和B细胞活化。“结合亲和力”通常指分子(例如抗体)的单一结合位点与其结合配偶(例如抗 原)之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，如本文中所使用的，“结合亲和 力”指反映结合对的成员(例如抗体与抗原)之间1 1相互作用的内在结合亲和力。分 子X对其配偶Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常 用方法来测量，包括本文中所描述的。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原且趋于容易解离， 而高亲和力抗体通常更快速地结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合 亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方 案。在一个实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab 型式的目的抗体及其抗原实施的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的。通过在存在 未标记抗原的滴定系列的情况中，用最小浓度的1251标记抗原平衡Fab，然后用抗Fab抗体 包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen，等(1999)J Mol Biol 293:865-881)。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5iig/ml捕捉用 抗Fab抗体(CappelLabs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2% (w/v)牛血 清清蛋白于室温(大约23°C )封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc #269620)中，将100pM 或26pM[125I]_抗原与连续稀释的目的Fab混合(例如与Presta等(1997) CancerRes. 57 4593-4599中抗VEGF抗体，Fab_12的评估一致)。然后将目的Fab温育过夜；然而，温育可持续更长时间(例如约65个小时)以确保达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉平板以进 行室温温育(例如1小时)。然后除去溶液，并用含0. 1 % Tween-20的PBS洗板8次。平 板干燥后，加入150 u 1/孔闪烁液(MicroScint-20 ；Packard)，然后在Topcount伽马计数 器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度 用于竞争性结合测定法。依照另一个实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用 BIAcore -2000 或 BIAcore -3000(BIAcore，Inc.，Piscataway, NJ)在 25°C使用固定化抗 原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙 基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基 化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5，BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4. 8将抗原稀释至 5 u g/ml (约0. 2 y M)，然后以5 ill/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋 白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25°C以约 25 u 1/分钟的流速注入在含0. 05% Tween-20的PBS (PBST)中两倍连续稀释的Fab (0. 78nM 至 500nM)。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore EvaluationSoftware version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图来计算结合速率(k。n)和解离速率(k。ff)。 平衡解离常数(Kd)以比率k。ff/k。n计算。参见例如Chen，Y.等(1999) J Mol Biol 293 865-881。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过KfM—s—1，那么结合速率可 使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flow equippedspectrophometer) (Aviv Instruments)或 8000 系列 SLM-Aminco 分光光度计 (ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的情况中，测量PBS pH 7. 2中的20nM抗抗原抗体(Fab形式)在25°C的荧光发射强度(激发=295nm ；发射= 340nm, 16nm带通)的升高或降低。白勺(on-rate, rate of association, association rate) 或“k。n” 也可如上所述使用 BIAcoreTM-2000 或 BIAcoreTM-3000 系统(BIAcore，Inc.， Piscataway, NJ)来测定。“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其 天然环境的污染性成分指会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，而且可以包括酶、激素、 和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据 Lowry法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序 仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性 条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选的银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少 一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将 通过至少一个纯化步骤来制备。术语“标记物”在用于本文时指与某分子(诸如核酸、多肽、或抗体)直接或间接 偶联以生成“经过标记的/带标记物的”分子的可检测化合物或组合物。标记物可以是自 身可检测的(例如放射性同位素标记物或荧光标记物)，或者在酶标记物的情况中，可催化 底物化合物或组合物发生化学改变，产生可检测的产物。“固相”意指某分子(诸如核酸、多肽、或抗体)可粘着其上的非水性基质。本文中 所涵盖的固相的例子包括那些部分或完全由玻璃(例如可控孔径玻璃)、多糖(例如琼脂
20糖)、聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、聚乙烯醇和聚硅氧烷(silicone)制成的固相。在某些实施方 案中，根据语境，固相可包括测定板的孔；在其它实施方案中，它指纯化柱(例如亲和层析 柱)。此术语还包括离散颗粒的不连续固相，诸如美国专利No. 4，275，149中所记载的。“脂质体”指由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物 投递药物(诸如核酸、多肽、抗体、激动剂或拮抗剂)的小囊泡。脂质体的成分通常排列成 双层形式，与生物膜的脂质排列相似。“小分子”或“有机小分子”在本文中定义为分子量小于约500道尔顿的有机分子。结合靶多肽的“寡肽”指能够以足够亲和力结合靶多肽，使得该寡肽在靶向多肽中 可用作诊断剂和/或治疗剂的寡肽。在某些实施方案中，根据例如表面等离振子共振测定 法的测量，寡肽对无关非靶多肽的结合程度小于该寡肽对靶多肽的结合的约10%。在某些 实施方案中，寡肽以彡ΙμΜ、彡IOOnM,^ ΙΟηΜ、彡InM、或彡0. InM的解离常数(Kd)结合靶 多肽。结合靶多肽的“有机分子”指除本文中所定义的寡肽或抗体以外，能够以足够亲 和力结合靶多肽，使得该有机分子在靶向多肽中可用作诊断剂和/或治疗剂的有机分子。 在某些实施方案中，根据例如表面等离振子共振测定法的测量，有机分子对无关非靶多肽 的结合程度小于该有机分子对靶多肽的结合的约10%。在某些实施方案中，有机分子以 彡ΙμΜ、彡ΙΟΟηΜ、彡ΙΟηΜ、彡InM、或彡0. InM的解离常数(Kd)结合靶多肽。“生物学系统”指包含享有共同信号传导途径的哺乳动物细胞的体外、离体/回体 (ex vivo)、或体内系统。“微生物病症”指其中微生物病原体引起、介导、或以其它方式促成疾病或状况的 发病的疾病或状况。还包括其中刺激或干预抗微生物应答对疾病进展具有改善效果的疾 病。此术语内包括传染性疾病或状况，和源自微生物病原体原发性感染的机会性疾病。此 类传染病的例子包括但不限于由EHEC和EPEC引起的腹泻、炎性肠病(IBD)和更具体的溃 疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)。术语“Τ细胞介导的疾病”指其中T细胞直接或间接介导或以其它方式促成哺乳动 物发病的疾病。T细胞介导的疾病可能与细胞介导的效应、淋巴因子介导的效应等有关，甚 至与B细胞有关的效应，如果B细胞得到刺激的话，例如受到由T细胞分泌的淋巴因子的刺激。“自身免疫性病症”或“自身免疫(性)，，指其中发生了针对身体自己组织的体液 或细胞介导的免疫应答的任何疾患。“IL-23介导的自身免疫性病症”指由IL-23活性引起 的、维持的、或加剧的任何自身免疫性病症。“炎症”指损伤或感染部位白细胞的积累和血管的扩张，典型地引起疼痛、肿胀、和 发红。“慢性炎症”指引起炎症的原因持续存在且难以或不可能消除的炎症。“自身免疫性炎症”指与自身免疫性病症有关的炎症。“关节炎炎症”指与关节炎有关的炎症。“炎性肠病”或“IBD”指特征为胃肠道炎症的慢性病症。IBD涵盖溃疡性结肠炎， 其影响大肠和/或直肠，及克罗恩氏病，其可以影响整个胃肠系统，但更常见的是影响小肠 (回肠)和可能的大肠。
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术语“有效量”指某分子(例如核酸、多肽、激动剂、或拮抗剂)导致具体所述目的 实现的浓度或量。“有效量”可以凭经验来确定。“治疗有效量”指某分子有效实现所述治 疗效果的浓度或量。此量也可以凭经验来确定。如本文中所使用的，术语“细胞毒剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏 的物质。该术语意图包括放射性同位素(例如Ι131、1125、γ9°和Re186)、化疗剂、和毒素诸如细 菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素或其片段。“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞，尤其是过表达任何基因 的细胞生长的化合物或组合物。如此，生长抑制剂是显著降低处于S期的过表达所述基因 的细胞百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进(处于S期以外的位置) 的药剂，诸如诱导Gl停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(Vincas) (长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine))、泰素(taxol)、和拓扑异构酶II抑制 剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(印irubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托 泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞Gl的药剂也溢出进入S期停滞，例如 DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、 双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺钼(cisplatin)、甲氨喋呤(methotrexate)、5-氟 尿啼唆(5-fluorouracil)禾口 ara_C。更多信息可参见 TheMolecular Basis of Cancer, Mendelsohn 禾口 Israel 编，第 1 章， 题 为 ‘‘Cell eyeleregulation, oncogenes, and antineoplastic drugsMurakami ^,WB Saunders, Philadelphia (1995)，jtMMM 13术语“细胞因子”是由一种细胞群释放，作为细胞间介质作用于另一种细胞群的 蛋白质的通称。此类细胞因子的例子有淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子 中包括生长激素，诸如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素和牛生长激素；甲状旁腺素； 甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松驰素；松驰素原；糖蛋白激素类，诸如促卵泡激素(FSH)、 促甲状腺激素(TSH)和促黄体激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；促乳素；胎 盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β ；淋巴毒素-α和-β ；穆勒氏(Mullerian)抑制 性物质；小鼠促性腺激素相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小 板生成素(TPO)；神经生长因子，诸如NGF-β ；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)，诸 如TGF-α和TGF-β ；胰岛素样生长因子_1和-II ；促红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子 (osteoinductive factor)；干扰素，诸如干扰素-α、-β和-γ ；集落刺激因子(CSF)，诸如 巨噬细胞CSF (M-CSF)、粒细胞-巨噬细胞CSF (GM-CSF)和粒细胞CSF (G-CSF)；白介素(IL)， 诸如 IL-U IL-I α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-IU IL-12、 IL-6、IL-17、IL-18、IL-22、IL-23 ；肿瘤坏死因子，诸如TNF-α或TNF-β ；及其它多肽因子， 包括LIF和kit配体(KL)。如本文中所使用的，术语细胞因子包括来自天然来源或来自重 组细胞培养物的蛋白质及天然序列细胞因子的生物学活性等效物。如本文中所使用的，术语“炎症细胞”指增强炎症应答的细胞，诸如单个核细胞、嗜 曙红细胞、巨噬细胞和多形核嗜中性细胞(PMN)。II.本发明的组合物和方法A.抗微生物多肽(AMP)及其调控剂本发明的抗微生物多肽(AMP)指介导或以其它方式影响对微生物病原体的抗微 生物免疫应答的多肽。本发明的AMP包括但不限于LT、IL-6、IL-22、IL-23 (包括例如IL-23pl9或IL-23 p40)、和由Reg超家族的基因编码的Reg或Reg相关蛋白。Reg超家族包括来 自人、大鼠、和小鼠的Reg和Reg相关基因，而且分成四个亚类，即I型、II型、III型、和IV 型。例如，I型包括人REGI α、人REG I β、大鼠Regl、和小鼠RegI ；II型包括小鼠RegII ； III型包括人REGIII、人HIP/PAP(在肝细胞癌-肠-胰中表达的基因/编码胰腺炎相关蛋 白的基因)、大鼠 PAP/ 肽 23、大鼠 RegIII/ΡΑΡΙΙ、大鼠 PAP III、小鼠 RegIII α ,RegIII β、 RegIII Y、小鼠RegIII δ、和仓鼠INGAP(胰岛新生相关蛋白)。IV型含有人REGIV。另外， 人Reg相关序列(RS)据报告是假基因。在一个实施方案中，所述REG蛋白质由人REG基因 家族的成员编码，包括但不限于REG Ia、REG I β、HIP/PAP、REG III, REG IV、和Reg相关 序列(RS)。在一些方面，本发明AMP的氨基酸序列包含选自下组的氨基酸序列SEQ ID NO 2、SEQ ID NO :4、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :8、SEQ ID NO :10、SEQ ID NO :12、SEQ ID NO 14、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18、SEQID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ ID NO :26、SEQ ID NO :28、SEQ ID NO :30、SEQ ID NO :32、SEQ ID NO :34、SEQ ID NO :36、SEQ IDNO 38,SEQ ID NO :40、SEQ ID NO :42、SEQ ID NO :44、SEQ ID NO :46、SEQ ID NO :48、SEQ ID NO :50、SEQ ID NO :52、SEQ ID NO :54、禾口 SEQ IDNO :56。在其它方面，编码本发明AMP的核酸序列包含选自下组的核酸序列SEQ ID NO USEQ ID N0:3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :7、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO =IUSEQ ID N0:13、 SEQ ID N0:15、SEQ ID NO : 17、SEQID NO : 19、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、 SEQ ID NO :27、SEQ ID NO :29、SEQ ID NO :31、SEQ ID NO :33、SEQ ID NO :35、SEQ IDNO 37、SEQ ID NO :39、SEQ ID NO :41、SEQ ID NO :43、SEQ ID NO :45、SEQ ID NO :47、SEQ ID NO 49,SEQ ID N0:51、SEQ ID NO :53、和 SEQ IDNO :55。本发明AMP的活性可以相对于另一种AMP或同一种AMP的活性提高或降低和/或 差异调节。本发明AMP的活性的例子包括但不限于AMP表达、信号转导、结合至结合配偶、 抗微生物应答、或其其它生物学或免疫学活性。在一个实施方案中，一种或多种本发明AMP的活性的升高导致受试者中抗微生物 免疫应答的增强或诱导。在一个实施方案中，本发明的AMP包括但不限于与IL-22直接或间接相互作用的 多肽，例如位于介导宿主对微生物病原体(例如细菌或病毒)感染的抵抗力的IL-22信号 转导途径的上游或下游的多肽。此类AMP的例子包括但不限于LT、IL-6、IL-18、和IL-23(包 括例如 IL-23 ρ 19 或 IL-23 p40)。本发明的调控剂包括但不限于直接或间接调控AMP活性的多肽和核酸分子(例如 DNA分子或RNA分子)。所述调控的例子包括但不限于本发明AMP活性的升高、降低、诱导 或活化、抑制、或调节(例如上调或下调)。在一个具体的实施方案中，所述调控剂通过降低或抑制IL-22结合蛋白(BP)活性 并由此提高IL-22活性来间接调控IL-22活性。在又一个实施方案中，所述调控剂降低或 抑制IL-22BP结合IL-22并由此提高IL-22活性。在一些实施方案中，所述调控剂是多肽，例如结合AMP或以其它方式与AMP相互作 用以提高、诱导、或调节AMP活性的多肽。在一个实施方案中，所述调控剂是调控AMP活性 的融合多肽。
在一个实施方案中，所述调控剂是结合AMP的抗体。在一个具体的实施方案中， 所述抗体是单克隆抗体。在另一个实施方案中，所述抗体是选自Fab、Fab' _SH、Fv、scFv、 或(Fab’)2片段的抗体片段。在另一个实施方案中，所述抗体是融合多肽(例如Fc融合多 肽)。在另一个实施方案中，所述抗体是嵌合抗体。在一个具体的实施方案中，所述抗体是 人源化的。在另一个实施方案中，所述抗体是人抗体。在另一个实施方案中，所述抗体与选 自人、非人灵长类、或其它哺乳动物(例如猪、绵羊、家兔、土拨鼠、大鼠、或小鼠)的抗体结 合相同表位。在一个具体的实施方案中，所述抗体是AMP激动剂。在一个具体的实施方案中，所述调控剂是重组AMP或编码AMP的核酸分子(例如 DNA或RNA分子)。在另一个具体的实施方案中，所述调控剂是重组AMP或编码AMP的核酸分子(例 如DNA或RNA分子)，其能在细胞中表达。本发明的AMP涵盖天然全长或成熟AMP及其变体。AMP变体可以通过向编码AMP 的DNA中引入适宜核苷酸变化和/或通过合成期望的抗微生物多肽来制备。本领域技术人 员会领会，氨基酸变化可能改变本发明多肽的翻译后加工，诸如改变糖基化位点的数目或 位置或改变膜锚定特征。如本文中所描述的，在天然AMP中或在AMP的各个结构域中的变异可以通过，例 如，使用保守性和非保守性突变的任何技术和原则，例如美国专利No. 5，364，934中所列举 的来产生。变异可以是编码AMP的一个或多个密码子的替代、删除或插入，其导致与天然序 列AMP相比AMP的氨基酸序列中的变化。任选的，所述变异是在AMP的一个或多个结构域中 至少一个氨基酸用任何其它氨基酸替代。确定哪个氨基酸残基可以被插入、替代或删除而 不会不利地影响期望活性的指导可以通过比较AMP的序列与同源的已知蛋白质分子的序 列并最小化在高同源性区域中进行的氨基酸序列改变的数目来发现。氨基酸替代可以是一 个氨基酸用具有相似结构和/或化学性质的另一个氨基酸替换的结果，诸如用丝氨酸替换 亮氨酸，即保守性氨基酸替换。插入或删除可以任选地在约1到5个氨基酸的范围内。通 过在序列中系统性地产生氨基酸的插入、删除或替代并对使得变体测试由全长或成熟天然 序列展现的活性，可以确定容许的变异。在特定的实施方案中，感兴趣的保守性替代在表3中优选替代表头下显示。如果 这种替代导致生物学活性的改变，那么引入更为实质性的改变，在表6中称为例示替代，或 如下文对于氨基酸种类所进一步描述的，并筛选产物。表3
初始残基例示替代优选替代
Ala(A)val ；Ieu ；ileval
Arg(R)Iys ；gin ；asnIys
Asn(N)gin ；his ；Iys ；arggin
Asp (D)gluglu
Cys(C)serser
Gln(Q)asnasn
Glu(E)aspasp
240182]Gly(G)pro ；alaala0183]His(H)asn ；gin ；Iys ；argarg0184]Ile(I)Ieu ；val ；met ；ala ；phe ；正亮氨酸Ieu0185]Leu(L)正亮氨酸；ile ；val ；met ；ala ；pheile0186]Lys(K)arg ；gin ；asnarg0187]Met (M)Ieu ；phe ；ileIeu0188]Phe (F)Ieu ；val ；ile ；ala ；tyrIeu0189]Pro (P)alaala0190]Ser(S)thrthr0191]Thr(T)serser0192]Trp (W)tyr ；phetyr0193]Tyr(Y)trp ；phe ；thr ； serphe0194]Val(V)ile ；Ieu ；met ；phe ；ala ；正亮氨酸Ieu0195]AMP多肽的功能或免疫学身份中的实质性修饰可通过选择对保持下述各项的影
响差异显著的替代来完成(a)替代区域的多肽主链的结构，例如作为折叠片或螺旋构象， (b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(C)侧链的体积。基于共同的侧链特性，可以将天然 存在残基分组(1)疏水性的正亮氨酸、met、ala、val、leu、ile ；(2)中性、亲水性的cys、ser、thr ；(3)酸性的asp、glu ；(4)喊个生的:asn> gln>his> lys> arg ；(5)影响链取向的残基gly、pro ；和(6)芳香族的:trp、tyr、phe。非保守性替代需要交换这些类别或其它类别之一的成员。这种替代的残基也可以 被导入保守性替代位点，或更优选的，导入其余的(非保守性)位点。可以使用本领域已知的方法产生变异，诸如寡核苷酸介导的(定点)诱变、丙氨 酸扫描和PCR诱变。可以对克隆的DNA实施定点诱变[Carter等，Nucl. Acids Res. ,13 4331(1986) ；Zoller 等，Nucl. Acids Res.，10 :6487 (1987)]、盒式诱变[Wells 等，Gene, 34 315 (1985)]、限制性选择诱变[Wells 等，Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317 415 (1986)]或其它已知的技术来产生编码AMP变体的DNA。本文中还提供了 AMP或本发明其它多肽的片段。这些片段可以是在N-末端或 C-末端截短的，或可以缺少内部残基，例如，当与全长天然蛋白质相比较时。某些片段缺乏 对于AMP或本发明多肽的期望生物学活性非关键的氨基酸残基。因而，在某些实施方案中， AMP或本发明其它多肽的片段是有生物学活性的。在某些实施方案中，全长AMP的片段缺少 N-末端信号肽序列。在某些实施方案中，全长AMP的片段是膜结合的AMP的可溶形式。例 如，AMP的可溶形式可以缺少所有的或实质性部分的跨膜结构域。AMP或本发明其它多肽的共价修饰被包括在本发明的范围内。一种类型的共价修 饰包括使本发明多肽的目标氨基酸残基与有机衍生化试剂起反应，所述试剂能够与多肽的 选定的侧链或N-或C-末端残基起反应。使用双功能试剂衍生化是有用的，例如，对于将多肽交联至水不溶性的支持基质或表面，用于纯化多肽的抗体的方法，反之亦然。通常使用的 交联剂包括，例如，1，1_ 二(重氮乙酰基)-2-苯乙烷、戊二醛、N-羟基琥珀酰亚胺酯例如与 4_叠氮水杨酸的酯、同双功能亚氨酸酯包括双琥珀酰亚氨基酯诸如3，3' -二硫代二(琥 珀酰亚氨基丙酸酯)、双功能马来酰亚胺诸如二 -N-马来酰亚氨基-1，8-辛烷、和试剂诸如 3-[(p_叠氮苯基)二硫代]亚氨基丙酸甲酯。其它修饰包括谷氨酰胺酰基和天冬酰胺酰基残基分别向相应的谷氨酰和天 冬氨酰残基的脱酰胺作用，脯氨酸和赖氨酸的羟基化作用，丝氨酰或苏氨酰残基的 羟基的磷酸化，赖氨酸、精氨酸和组氨酸侧链的α氨基的甲基化[T.E.Creighton， Proteins Structure and Molecular Properties, W. H. Freeman &Co. , San Francisco, PP. 79-86 (1983) ]，N-末端胺的乙酰化和任何C-末端羧基的酰胺化。包括在本发明的范围内的本发明多肽的另一类共价修饰包含改变多肽的天然糖 基化模式。“改变天然的糖基化模式”在此意指删除本发明多肽的天然序列中发现的一个或 多个碳水化合物模块(通过除去潜在的(underlying)糖基化位点，或通过化学的和/或酶 学的方法删除糖基化)，和/或添加多肽天然序列中不存在的一个或多个糖基化位点。此 外，该用语包括在天然蛋白质的糖基化方面的定性改变，包括在存在的各种碳水化合物模 块的性质和比例方面的改变。本发明的多肽也可以以一定方式修饰来形成嵌合分子，其包含与另一个异源 多肽或氨基酸序列融合的所述多肽。在一个实施方案中，嵌合分子包含所述多肽与标 签多肽的融合物，该标签多肽提供抗标签抗体能选择性结合的表位。表位标签一般置 于所述多肽的氨基或羧基末端。所述多肽的这种带表位标签的形式的存在可以使用针 对所述带标签多肽的抗体来检测。并且，提供表位标签使AMP能够容易地使用抗标签 抗体或其它类型结合表位标签的亲和基质通过亲和纯化来纯化。各种标签多肽和它 们相应的抗体是本领域公知的。例子包括聚组氨酸(poly-his)或聚组氨酸-甘氨酸 (poly-his-gly)标签；流感 HA 标签多肽和它的抗体 12CA5 [Field 等，Mol. Cell. Biol, 8 2159-2165(1988)] ；c-myc 标签和它的抗体 8F9、3C7、6E10、G4、B7 禾Π 9E10[Evan 等， Molecular and Cellular Biology，5 :3610_3616 (1985)]；及单纯疱疹病毒糖蛋白 D (gD) 标签和它的抗体[Paborsky 等，Protein Engineering, 3 (6) :547_553 (1990)]。其它的标 签多肽包括 Flag 肽[Hopp 等，BioTechnology, 6 1204-1210 (1988) ] ；KT3 表位肽[Martin 等，Science, 255 192-194 (1992) ] ； α -微管蛋白表位肽[Skinner 等，J. Biol. Chem.，266 15163-15166(1991)]；和 T7 基因 10 蛋白肽标签[Lutz-Freyermuth 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA,87 6393-6397(1990)]。在另一个实施方案中，嵌合分子可以包含本发明多肽与免疫球蛋白或免疫球蛋白 的特定区的融合物。对于二价形式的嵌合分子(也称为“免疫粘附素”)，这种融合物可以 是IgG分子的Fc区。Ig融合物优选的包括可溶形式的本发明多肽(例如AMP或其多肽调 控剂)代替Ig分子内至少一个可变区的替代。在一个特别优选的实施方案中，免疫球蛋白 融合物包括IgGl分子的铰链、CH2和CH3，或铰链、CHl、CH2和CH3区。关于免疫球蛋白融 合物的生成也参见1995年6月27日公告的美国专利No. 5，428，130。1.多肽的制备本发明的多肽可以通过常规的重组方法来制备，例如，培养用含编码AMP或其多肽调控剂的核酸的载体转化或转染的细胞。还提供了包含任何这样的载体的宿主细胞。举 例来说，宿主细胞可以是CHO细胞、大肠杆菌或酵母。进一步提供了生产任何在此描述的多 肽的方法，包括在适合于表达期望的多肽的条件下培养宿主细胞，并从细胞培养物回收期 望的多肽。在其它实施方案中，本发明提供了嵌合分子，其包含融合有异源多肽或氨基酸序 列的任何在此描述的多肽。这种嵌合分子的例子包括但不限于融合有表位标签序列或免疫 球蛋白Fc区的任何在此描述的多肽。本领域公知的可选择的方法也可被用来制备本发明的多肽。例如，编码多 肽或其部分的序列可以通过利用固相技术的直接肽合成来产生[参见，例如Stewart 等，Solid-Phase Peptide Synthesis, W. H. Freeman Co. , San Francisco, CA(1969)； Merrifield, J. Am. Chem. Soc，85 =2149-2154 (1963) ] 可以利用人工技术或通过自动化进 行体外蛋白质合成。举例来说，可以利用AppliedBiosystems肽合成仪(Foster City,CA) 利用厂商的说明实现自动化合成。可以分别化学合成本发明多肽或其部分的各个部分并利 用化学的或酶学的方法组合来产生全长多肽或其部分。重组表达的本发明多肽可以从培养液或从宿主细胞溶胞物回收。以下规程是适 合的纯化规程的示范在离子交换柱上的分级；乙醇沉淀；反相HPLC ；在硅土上或在阳离子 交换树脂诸如DEAE上的层析；层析聚焦；SDS-PAGE ；硫酸铵沉淀；利用例如S印hadex G-75 的凝胶过滤；蛋白A Sepharsoe柱以除去污染物诸如IgG ；和金属螯合柱来结合带表位标 签形式的本发明多肽。可以使用蛋白质纯化的各种方法，这样的方法是本领域已知的，在 例如 Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990) ；Scopes, Protein Purification Principles andPractice, Springer-Verlag, New York (1982)中有记载。选择的纯化步骤 将取决于，例如，采用的生产方法和生产的特定多肽的性质。LT多肽可以通过表达带标签的 LT多肽(诸如例如LT α标签多肽(SEQ ID NO 61))来纯化。2.基因表达的检测编码本发明多肽的基因的表达可以通过本领域的各种方法来检测，例如，通过检 测编码多肽的mRNA的表达。如在此使用的，术语“检测”涵盖定量的或定性的检测。通过 检测本发明多肽的基因表达，能鉴定例如表达此基因的那些组织。基因表达可以使用本领 域技术人员已知的某些方法来测量，例如，Northern印迹(Thomas，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 5201-5205[1980])；定量PCR ；或原位杂交，其利用根据在此提供的序列的适当标 记的探针。或者，基因表达可以通过免疫学的方法来测量，诸如对组织切片的免疫组织化学 染色，和对细胞培养物或体液的测定法，来直接对基因产物的表达定量。对样品液体的免疫 组织化学染色和/或测定法有用的抗体涵盖在此提供的任何抗体。方便地，抗体可以针对 编码例如本发明AMP的天然序列；针对包含AMP序列的片段的合成肽；或针对融合至AMP多 肽或其片段的外源序列(包括合成肽)来制备。B.抗体提供了结合任何上述或下述多肽的抗体。在一个实施方案中，提供了结合本发明 AMP并由此调控AMP活性(例如提高AMP活性)的分离的抗体。例示性的抗体包括多克隆 的、单克隆的、人源化的、人的、双特异性的、和异源偶联的抗体。抗体可以是抗体片段，例如 Fab、Fab' _SH、Fv、scFv、或(Fab' )2片段。在一个实施方案中，提供了结合IL-22的分
27离的抗体。在一个这样的实施方案中，抗体部分地或完全地提高本发明AMP的活性。结合本发明AMP的例示性单克隆抗体在本文中有描述。这些抗体包括抗IL-22抗 体，称为 3F11.3(〃 3F11" )、11Η4·4(" 11Η4")、和 8Ε11.9(〃 8Ε11")，及抗 IL-22R 抗 体，称为 7Ε9. 10. 8(" 7Ε9" )、8Α12. 32(" 8Α12" )、8Η11. 32. 28 (“ 8Η11")、和 12Η5。在一 个实施方案中，提供了生成任何那些抗体的杂交瘤。在一个实施方案中，提供了与3F11. 3、 11Η4. 4、或8Ε11. 9竞争IL-22结合的单克隆抗体。在另一个实施方案中，提供了与3F11. 3、 11Η4.4、或8Ε11.9结合相同表位的单克隆抗体。在另一个实施方案中，提供了与7Ε9、8Α12、 8Η11、或12Η5竞争IL-22R结合的单克隆抗体。在一个实施方案中，提供了与7Ε9、8Α12、 8Η11、或12Η5结合相同表位的单克隆抗体。下文提供了抗体的各种实施方案1.多克隆抗体抗体可包括多克隆抗体。用于制备多克隆抗体的方法是熟练技术人员已知的。多 克隆抗体可在哺乳动物中生成，例如通过一次或多次注射免疫剂和根据需要的佐剂。通常， 免疫剂和/或佐剂将通过多次皮下或腹膜内注射而注射到哺乳动物中。免疫剂可包括感兴 趣多肽或其融合蛋白。将免疫剂与已知在所免疫哺乳动物中有免疫原性的蛋白质偶联可能 是有用的。此类免疫原性蛋白质的例子包括但不限于匙孔i威血蓝蛋白、血清清蛋白、牛甲状 腺球蛋白和大豆胰蛋白酶抑制剂。可采用的佐剂的例子包括弗氏完全佐剂和MPL-TDM佐剂 (单磷酰基脂质A、合成的二棒分枝菌酸海藻糖)。免疫方案可以由本领域技术人员无需过 多实验做出选择。2.单克隆抗体或者，抗体可以是单克隆抗体。单克隆抗体可使用杂交瘤法制备，诸如Kohler和 Milstein,Nature 256 =495(1975)所述。在杂交瘤法中，小鼠、仓鼠或其它适宜的宿主动物 通常用免疫剂免疫以引发生成或能够生成将特异性结合免疫剂的抗体的淋巴细胞。或者， 可以在体外免疫淋巴细胞。免疫剂将通常包括感兴趣多肽或其融合蛋白。通常，或是使用外周血淋巴细胞 (“PBL”)，若希望人起源的细胞，或是使用脾细胞或淋巴结细胞，若希望非人哺乳动物来源。 然后，使用合适的融合剂，诸如聚乙二醇，将淋巴细胞与永生化细胞系融合以形成杂交瘤细 胞(Goding,Monoclonal Antibodies :Principles and Practice,Academic Press(1986), PP. 59-103)。永生化细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，特别是啮齿类、牛和人起源的骨髓 瘤细胞。通常，采用大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。杂交瘤细胞可在合适的培养基中培养，所述 培养基优选含有抑制未融合的永生化细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，如果亲本 细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，那么用于杂交瘤的培养基通 常将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷(“HAT培养基”)，这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。优选的永生化细胞系是那些高效融合、支持选定的抗体生成细胞稳定的高水平 的表达抗体、并对诸如HAT培养基等培养基敏感的细胞系。更优选的永生化细胞系是鼠 源骨髓瘤系，可从例如索尔克研究所细胞分配中心(Salklnstitute Cell Distribution Center, San Diege, California)和美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection, Manassas, Virginia)获得。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人 异源骨髓瘤细胞系也已有记载(Kozbor，J. Immunol. 133 3001 (1984) ；Brodeur等， Monoclonal Antibody ProductionTechniques and Applications, Marcel Dekker, Inc.,
28New York(1987)pp. 51—63)。然后可对杂交瘤细胞在其中培养的培养基测定结合感兴趣多肽的单克隆抗体的 存在。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联 免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。此类技术和 测定法是本领域已知的。单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson和Pollard，Anal. Biochem. 107 220(1980)的 Scatchard 分析来测定。在鉴定得到期望的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆，并通 过标准方法进行培养(Goding，见上文)。适于这一目的的培养基包括例如Dulbecco氏改 良的Eagle氏培养基和RPMI-1640培养基。或者，杂交瘤细胞可在哺乳动物中作为腹水进 行体内培养。可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-S印harose、羟磷灰石层析、凝 胶电泳、透析或亲和层析，自培养液或腹水分离或纯化亚克隆分泌的单克隆抗体。单克隆抗体可以通过使用组合文库筛选具有期望活性的抗体来创建。例如，本领 域知道用于生成噬菌体展示文库和对此类文库筛选具有所需结合特征的抗体的多种方法。 此类方法一般性的记载于Hoogenboom等(2001)于Methods in Molecular Biology 178 1-37(0' Brien 等，编，Human Press, Totowa，NJ)及(在某些实施方案中)Lee 等(2004) J. Mol. Biol. 340 :1073_1093。在原理上，通过筛选噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示 融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区(Fv)片段的噬菌体。通过针对期望抗原的亲和 层析淘选此类噬菌体文库。表达能够结合期望抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而 与文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原 吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规 程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等， Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版，NIH Pub1ication91-3242, Bethesda MD(1991), vols. 1-3中记载的合适的恒定区(Fe)序列构建全长抗体克隆。单克隆抗体还可通过重组DNA方法来生成，诸如美国专利No. 4，816，567中所述。 编码本发明单克隆抗体的DNA易于使用常规规程分离和测序(例如使用能够特异性结合编 码鼠源抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。本发明的杂交瘤细胞是此类DNA的优选 来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到不另外产生免疫球蛋 白蛋白质的宿主细胞中，诸如猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重 组宿主细胞中获得单克隆抗体的合成。还可以修饰DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链 恒定域的编码序列代替同源鼠源序列(美国专利No. 4，816，567 ；Morrison等，见上文)，或 者通过共价接合免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列。可用此 类非免疫球蛋白多肽替代本发明抗体的恒定域，或者可用它替代本发明抗体的一个抗原结 合位点的可变域以产生嵌合二价抗体。3.单价抗体还提供了单价抗体。用于制备单价抗体的方法是本领域众所周知的。例如，一种 方法牵涉免疫球蛋白轻链和经过修饰的重链的重组表达。重链被截短了，一般在Fc区内的 任何点，用以预防重链交联。或者，相关半胱氨酸残基被另一氨基酸残基替代或者被删除，用以预防交联。体外方法也适于制备单价抗体。消化抗体以生成其片段，特别是Fab片段，可以使 用本领域知道的常规技术来实现。4.抗体片段还提供了抗体片段。抗体片段可以通过传统手段，诸如酶促消化，或者通过重组技 术来生成。在某些情况中，使用抗体片段有优势，而不是完整抗体。片段的较小尺寸容许快 速清除，而且可导致更易于接近实体瘤。关于某些抗体片段的综述参见Hudson等(2003) Nat. Med. 9 129-134。已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗 体来衍生这些片段(参见例如 Morimoto 等，Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107—117(1992)；及 Brennan 等，Science 229:81(1985))。然而，现在可直接 由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达及由大 肠杆菌分泌，如此容许容易的生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离 抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab' -SH片段并化学偶联以形成F(ab' )2片段 (Carter等，Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主 细胞培养物分离F(ab' )2片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的 Fab和F(ab' )2片段记载于美国专利No. 5，869，046。用于生成抗体片段的其它技术对于 熟练从业人员将是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185 ；美国专利No. 5，571，894 ；及5，587，458。Fv和scFv是具有完整结合位点、缺少恒 定区的唯一类型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合 蛋白以生成效应器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering, Borrebaeck编，见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No. 5，641，870中 所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。5.人源化抗体还提供了人源化抗体。本领域知道用于将非人抗体人源化的多种方法。例如，人源 化抗体可以具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称作 “输入”残基，它们典型的取自“输入”可变域。人源化可基本上遵循Winter及其同事的方 法进行(Jones 等(1986)Nature321 :522_525 ；Riechmann 等(1988)Nature 332 :323_327 ； Verhoeyen等(1988) Science 239 :1534_1536)，通过用高变区序列替代人抗体的相应序 列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体(美国专利No. 4，816，567)，其中基本上少于整个 人可变域用来自非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体典型的是其中一些高变 区残基和可能的一些FR残基用来自啮齿类抗体中类似位点的残基替代的人抗体。用于构建人源化抗体的人可变域的选择，包括轻链和重链二者，对于降低抗原性 可以是重要。依照所谓的“最适”(best-fit)方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知的人 可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类序列最接近的人序列作为人源化抗体 的人框架(Sims 等(1993) J. Immunol. 151 2296 ；Chothia 等(1987) J. Mol. Biol. 196 :901)。 另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。同一 框架可用于数种不同的人源化抗体(Carter等(1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 4285 ； Presta 等(1993)J. Immunol. 151 :2623)。
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一般还希望抗体在人源化后保持对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为 了实现这一目标，依照一种方法，通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和 各种概念性人源化产物的方法来制备人源化抗体。三维免疫球蛋白模型是公众可获得的且 为本领域技术人员所熟悉。可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结 构的计算机程序。检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列行使功能中的可 能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体和输入序 列选出FR残基并进行组合，从而获得期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力提高。一般 而言，高变区残基直接且最实质的涉及对抗原结合的影响。6.人抗体还提供了人抗体。人抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv 克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成本发 明的人单克隆抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已 有记载，例如 Kozbor J. Immunol. ，133 3001 (1984) ；Brodeur 等，Monoclonal Antibody Production Techniques andApplications, pp. 51-63(Marcel Dekker, Inc. , New York, 1987)；及 Boerner 等，J. Immunol.，147 86 (1991) ·现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体 完整全集的转基因动物(例如小鼠)。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链 连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移 大量人种系免疫球蛋白基因将导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等， Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551(1993) Jakobovits 等，Nature 362:255-258(1993)； Bruggermann 等，Year inlmmunol. 7 33 (1993)。基因改组也可用于自非人(例如啮齿类)抗体衍生人抗体，其中人抗体具有 与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(印itope imprinting)，如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变区 用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择 导致非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中恢复消除相 应的非人链时遭到破坏的抗原结合位点，即表位决定(印记，imprint)人链配偶的选择。在 重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体(参见PCT WO 93/06213，公布于1993年4月 1日)。与传统的通过CDR移植进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体， 它们不含非人起源的FR或CDR残基。7.双特异性抗体还提供了双特异性抗体。双特异性抗体指对至少两种不同抗原具有结合特异性的 单克隆抗体。在某些实施方案中，双特异性抗体是人抗体或人源化抗体。在某些实施方案 中，结合特异性之一针对感兴趣的多肽，结合特异性之另一针对任何其它抗原。在某些实施 方案中，双特异性抗体可结合感兴趣的多肽的两种不同表位。双特异性抗体还可用于将细 胞毒剂定位于表达感兴趣多肽诸如细胞表面多肽的细胞。这些抗体拥有TAT226结合臂和 结合细胞毒剂(诸如例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素_α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、 甲氨喋呤或放射性同位素半抗原)的臂。可将双特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段 (例如F(ab' )2双特异性抗体)。
用于构建双特异性抗体的方法是本领域已知的。传统的是，双特异性抗体的 重组生产基于两对免疫球蛋白重链_轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性 (Millstein和Cuello，Nature 305 =537(1983)) 由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配， 这些杂交瘤(四源杂交瘤(quadroma))生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一 种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产 物收率低。类似的规程披露于1993年5月13日公布的WO 93/08829及Traunecker等， EMBO J. 10 3655(1991)。依照一种不同的办法，将具有期望结合特异性(抗体_抗原结合位点)的抗体可 变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。例如，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋 白重链恒定域进行融合。在某些实施方案中，在至少一种融合物中存在包含轻链结合所必 需的位点的第一重链恒定区(CHl)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋 白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染到合适的宿主生物体中。在用于构建的三种 多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了 极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特 别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂 合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对(提供第二结合特异 性)构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径， 因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性复合物与不想要的免疫球蛋白链组合分 开。该方法披露于W094/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等， Methodsin Enzymology 121:210(1986)。依照另一种方法，可改造一对抗体分子间的界面，以将从重组细胞培养物回收的 异二聚体的百分比最大化。界面包含至少部分抗体恒定域(^3结构域。在该方法中，将第 一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链(例如酪氨酸或色氨酸)替换。通 过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链(例如丙氨酸或苏氨酸)替换，在第二抗体分子的界 面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸 如同二聚体提高异二聚体产量的机制。双特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可 与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞 靶向不想要的细胞(美国专利No. 4，676，980)，及用于治疗HIV感染(W0 91/00360, WO 92/00373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂 是本领域众所周知的，连同许多交联技术一起披露于美国专利No. 4，676，980。文献中还记载了自抗体片段生成双特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来 制备双特异性抗体。Brerman等，Science 229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗 体以生成F(ab' )2片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下还原， 以稳定邻近的二硫醇并防止分子间二硫键的形成。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝 基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab' -TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成 Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab' -TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生 的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。
最新的进展便于从大肠杆菌直接回收Fab' -SH片段，这些片段可化学偶联以形 成双特异性抗体。Shalaby等，J. Exp. Med. 175 :217_225 (1992)记载了完全人源化的双特异 性抗体F(ab' )2分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab'片段，并在体外进行定向化 学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞 和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳瘤靶物的溶解活性。还记载了从重组细胞培养物直接生成和分离双特异性抗体片段的多种技 术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等，J. Immunol. 148(5) 1547-1553(1992)。将来自Fos和Jim蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体 的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二 聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段 包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上 的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互 补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv) 二 聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等，J. Immunol. 152 =5368(1994)。涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等， J. Immunol. 147 60(1991)。8.多价抗体还提供了多价抗体。多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原 的细胞的内在化(和/或异化)。本发明的抗体可以是可容易的通过编码抗体多肽链的核 酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点(例如四价抗体)的多价抗体(IgM 类别以外的)。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。在某些实施方 案中，二聚化结构域包含(或由其组成)Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体将包含Fc区 及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中，多价抗体包含(或由其 组成)三个至约八个抗原结合位点。在一个这样的实施方案中，多价抗体包含(或由其组 成)四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链(例如两条多肽链)，其中所述多肽 链包含两个或更多个可变域。例如，多肽链可包含VDl- (Xl) n-VD2- (X2) n_Fc，其中VDl是第 一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，Xl和X2代表氨基酸或多肽，而η 是O或1。例如，多肽链可包含VH-CH1-柔性接头-VH-CHl-Fc区链；或VH-CHI-VH-CHI-Fc 区链。本文中的多价抗体可进一步包含至少两条(例如四条)轻链可变域多肽。本文中的 多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文涵盖的轻链可变域多肽包含轻 链可变域，且任选进一步包含CL结构域。9.单结构域抗体还提供了单结构域抗体。单结构域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或整 个或部分轻链可变区的单一多肽链。在某些实施方案中，单结构域抗体是人单结构域抗体 (Domantis, Inc.，Waltham，MA ；参见例如美国专利No. 6，248，516 Bi)。在一个实施方案中， 单结构域抗体由整个或部分抗体重链可变域组成。10.抗体变体在有些实施方案中，涵盖本文所述抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以通过将适宜的变化引 入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成来制备。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残 基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘 若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体氨基酸序 列。鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的一种有用方法称作“丙氨酸扫 描诱变”，如 Cunningham 和 Wells (1989) Science 244 1081-1085 中所述。这里，鉴定一个 残基或一组靶残基(如带电荷的残基，诸如精氨酸、天冬氨酸、组氨酸、赖氨酸和谷氨酸)并 用中性或带负电荷的氨基酸(例如丙氨酸或多聚丙氨酸)替换，以影响氨基酸与抗原的相 互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的那 些氨基酸位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的 本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸 扫描或随机诱变，并对所表达的免疫球蛋白筛选期望的活性。氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含 一百个或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包 括具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶 (如用于ADEPT)或延长抗体血清半衰期的多肽融合。在某些实施方案中，本发明的抗体被改变以提高或降低抗体糖基化的程度。多肽 的糖基化典型的或是N-连接的或是0-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺 残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-χ-丝氨酸和天冬酰胺-χ-苏氨酸(其中X是除脯氨酸外 的任何氨基酸)是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中 这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。0-连接的糖基化指将糖类N-乙酰 半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用 5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。向抗体中添加或删除糖基化位点可通过改变氨基酸序列从而创建或消除一个或 多个上述三肽序列而便利的完成(用于N-连接的糖基化位点)。所述改变还可通过向原始 抗体的序列中添加、删除、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行(用于0-连接的 糖基化位点)。若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。例如，美国专利申请 No. US 2003/0157108 (Presta, L.)中记载了有缺乏岩藻糖的成熟碳水化合物结构附 着于抗体 Fc 区的抗体。还可参见 US 2004/0093621 (Kyowa HakkoKogyo Co.，Ltd.)。 WO 2003/011878 (Jean-Mairet 等人)和美国专利 No. 6，602, 684 (Umana 等人)中提 到了在附着于抗体Fc区的碳水化合物中有等分N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的抗体。WO 1997/30087 (Patel等人)中报告了在附着于抗体Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基 的抗体。关于有更改碳水化合物附着于其Fc区的抗体还可参见WO 1998/58964(Raju, S.)和WO 1999/22764 (Raju, S.)。关于具有改良糖基化的抗原结合分子还可参见US 2005/0123546 (Umana 等)。在某些实施方案中，糖基化变体包含Fc区，其中附着于Fc区的碳水化合物 结构缺乏岩藻糖。此类变体具有改进的ADCC功能。任选的是，Fc区还包含进一步改
34进ADCC的一处或多处氨基酸替代，例如Fc区位置298、333和/或334处的替代(Eu残 基编号方式)。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体的出版物的例子包括US 2003/0157108 ；WO 2000/61739 ；W02001/29246 ；US 2003/0115614 ；US 2002/0164328 ；US 2004/0093621 ；US2004/0132140 ；US 2004/0110704 ；US 2004/0110282 ；US 2004/0109865 ； W02003/085119 ；WO 2003/084570 ；WO 2005/035586 ；WO 2005/035778 ；W02005/053742 ； Okazaki 等 J. Mol. Biol. 336 1239-1249 (2004) ；Yamane-Ohnuki 等 Biotech. Bioeng. 87 614(2004)。生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lecl3 CHO 细胞(Ripka 等 Arch. Biochem. Biophys. 249 :533_545 (1986)；美国专利申请 No. US 2003/0157108 Al，Presta，L ；及 W02004/056312 Al，Adams 等，尤其是实施例 11)和敲除细 胞系，诸如α -1,6-岩藻糖转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(Yamane-Ohnuki等Biotech. Bioeng. 87 :614(2004))。另一类变体是氨基酸替代变体。这些变体在抗体分子中有至少一个氨基酸残基用 不同残基替换。进行替代诱变的感兴趣位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。上文表3表 头“优选替代”下显示了保守替代。如果此类替代导致期望生物学活性变化，那么可导入表 3中称为“例示替代”的更实质变化，或如上文参照氨基酸类别进一步所述，并对所得抗体筛 选期望结合特性。一类替代变体牵涉替代亲本抗体(例如人源化或人抗体)的一个或多个高变区残 基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体将具有改变的(例 如改良的)生物学特性。用于生成此类替代变体的一种便利方法牵涉使用噬菌体展示的亲 和力成熟。简言之，将数个高变区位点(例如6-7个位点)突变，在每个位点产生所有可能 的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与每个颗粒内包装的至少 部分噬菌体外壳蛋白(例如M13基因III产物)的融合物。然后对噬菌体展示的变体筛选 其生物学活性(例如结合亲和力)。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行扫描诱 变(例如丙氨酸扫描)以鉴定对抗原结合具有重大贡献的高变区残基。或者/另外，分析 抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。所述接触残 基及邻近残基是依照本领域知道的技术，包括本文详述的，进行替代的候选位点。一旦产生 这样的变体，使用本领域知道的技术，包括本文所述的，对该组变体进行筛选，可选择在一 种或多种相关测定法中具有优良特性的抗体用于进一步的开发。编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些 方法包括但不限于从天然来源分离(在天然存在氨基酸序列变体的情况中)，或者通过对 较早制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的(或定点)诱变、PCR诱变和盒 式诱变来制备。可能希望在本发明抗体的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变 体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置(包括铰链半胱氨酸)包含氨基酸修饰(如 替代)的人Fc区序列(如人IgGl、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区)。依照此描述和本领域的教导，涵盖的是，在有些实施方案中，本发明的抗体与野生 型对应抗体相比可在例如Fc区中包含一处或多处改变。与它们的野生型对应物相比，这 些抗体仍将基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可在Fc区中进行将会导 致Clq结合和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)改变(即或是增强或是削弱)的某些改变，例如W099/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它例子的Duncan和Winter，Nature 322 738-40 (1988)；美国专利 No. 5，648，260 ；美国专利 No. 5，624，821 ； R W094/29351。 W000/42072 (Presta)和WO 2004/056312 (Lowman)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体 变体。通过述及将这些专利出版物的内容明确收入本文。还可参见Shields等J.Biol. Chem. 9 (2) =6591-6604 (2001) 0半衰期延长且对新生儿Fc受体(FcRn)(它负责将母体IgG 转移给胎儿)(Guyer 等，J. Immunol. 117 587(1976)及 Kim 等，J. Immunol. 24 249(1994)) 的结合改良的抗体记载于US2005/0014934A1 (Hinton等)。这些抗体包含具有一处或多处 改进Fc区对FcRn结合的替代的Fc区。具有改变的Fc区氨基酸序列且Clq结合能力升高 或降低的多肽变体记载于美国专利No. 6，194，551B1，W099/51642。通过述及将这些专利出 版物的内容明确收入本文。还可参见Idusogie等J. Immunol. 164 =4178-4184(2000)。在一个实施方案中，本发明提供了在构成Fc区的Fc多肽的界面中包含修饰的 抗体，其中所述修饰便于和/或促进异二聚化。这些修饰包括在第一 Fc多肽中引入隆起 (protuberance)，在第二 Fc多肽中引入空穴(cavity)，其中所述隆起可位于所述空穴中， 从而促进第一和第二 Fc多肽的复合。用于生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知 的，例如美国专利No. 5，731，168中所记载的。11.抗体衍生物可进一步修饰抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。优 选的是，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不 限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯 吡咯烷酮、聚-1，3- 二氧戊环、聚-1，3，6-三噁烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸(均聚 物或随机共聚物)、和右旋糖苷或聚(η-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙 烷(prolypropylene oxide) /环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(如甘油)、聚乙烯醇、及 其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是 任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着到抗体上的聚合物数目可以变化，而且如 果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑 来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功 能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。在另一个实施方案中，提供了抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质 性质模块的偶联物。在一个实施方案中，该非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等，Proc. Natl. Acad. Sci. 102 11600-11605 (2005))。辐射可以是任何波长的，包括但不限于对普通 细胞无害但将非蛋白质性质模块加热至接近抗体_非蛋白质性质模块的细胞被杀死的温 度的波长。在某些实施方案中，抗体可以是经过标记的和/或可以在固体支持物上固定化。 在另一个实施方案中，抗体是抗独特型抗体。12.异源偶联抗体还提供了异源偶联抗体。异源偶联抗体由两种共价连接的抗体构成。此类抗体 建议用于例如将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No. 4，676，980)及用于治 疗HIV感染(TO 91/00360 ；WO 92/200373 ；EP 03089)。涵盖可在体外使用合成蛋白质 化学的已知方法制备抗体，包括那些涉及交联剂的方法。例如，可使用二硫化物交换反应或通过形成硫醚键来构建免疫毒素。适于此目的的试剂的例子包括亚氨基硫醇酯/盐 (iminothiolate)禾口 4-疏基丁酷亚氛酸甲酉旨(methyl-4-mercaptobutyrimidate)及例如美 国专利No. 4，676，980中所披露的。13.效应器功能工程可能希望在效应器功能方面修饰抗体，从而增强例如抗体在治疗微生物病症中的 效力。例如，可向Fc区中引入半胱氨酸残基，从而使得在该区中形成链间二硫键。具有增 强的抗微生物活性的同二聚体抗体还可使用异双功能交联剂来制备。或者，抗体可改造成 具有双重Fc区，由此可具有增强的活性。14.载体、宿主细胞和重组方法为了重组生产抗体，在一个实施方案中，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载 体，用于进一步克隆(DNA扩增)或表达。可使用常规规程容易地分离编码抗体的DNA并 测序(如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异性结合的寡核苷酸探针)。可利用许 多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。一般而言，宿主细胞是原核或真核 (通常是哺乳动物)起源的。应当领会，任何同种型的恒定区可用于此目的，包括IgG、IgM、 IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以从任何人或动物物种获得。a)使用原核宿主细胞生成抗体(1)载体构建可使用标准重组技术来获得编码抗体多肽构件的多核苷酸序列。可从抗体生成细 胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技 术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多 核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的 选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其 功能(扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之)及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相 容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于复制起点、选择标志基因、启动 子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入物、和转录终止序列。一般而言，包含衍生自与宿主细胞相容物种的复制子和控制序列的质粒载体可以 与这些宿主一起使用。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的 标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒PBR322转化大肠杆菌。pBR322包含 编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。 PBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物 体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利No. 5，648，237中详细记载了用于 表达特定抗体的PBR322衍生物的例子。另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿 主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λ GEM. TM.-11来构建可用于转化易感宿主细胞诸 如大肠杆菌LE392的重组载体。本发明的表达载体可包含两对或更多对启动子-顺反子，它们编码每一种多肽构 件。启动子是位于顺反子上游(5')的非翻译调节序列，它调控顺反子的表达。原核启动 子通常分成两类，诱导型的和组成性的。诱导型启动子指响应培养条件的变化(例如营养 物的存在与否或温度变化)而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。
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众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化自源DNA切 出启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可将选择的启动子与编码轻链或 重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的 扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它 们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β -半乳糖苷酶(galactamase)和乳 糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在 细菌中有功能的其它启动子(诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子)也是合适的。它们的 核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制性位点的接头或衔接 头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接(Siebenlist等(1980)Cell 20 :269)。在本发明的一个实施方案中，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿 膜易位的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载 体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工 (即被信号肽酶切除)的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿 主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或 热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施 方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。在另一个实施方案中，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质 中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重 链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株(例如大肠杆菌 trxB-菌株)提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折 叠和装配。Proba 和 Pluckthun，Gene 159:203(1995)。本发明的抗体还可使用如下表达系统来生成，其中所表达多肽构件的数量比率可 以受到调控，从而将分泌且正确装配的本发明抗体的产量最大化。这种调控是至少部分通 过同时调控多肽构件的翻译强度而实现的。Simmons等人，美国专利No. 5，840，523中披露了用于调控翻译强度的一种技术。 它在顺反子内利用翻译起始区(TIR)的变体。对于指定TIR，可创建具有一定范围翻译强度 的一系列氨基酸或核酸序列变体，由此提供针对特定链的期望表达水平调节此因素的方便 手段。可通过常规诱变技术导致能改变氨基酸序列的密码子变化来生成TIR变体。在某些 实施方案中，核苷酸序列中的变化是沉默的。TIR中的改变可包括例如Shine-Dalgarno序 列的数目或间距的改变，及信号序列中的改变。用于生成突变型信号序列的一种方法是在 编码序列的开端生成不改变信号序列氨基酸序列的“密码子库”(即变化是沉默的)。这可 通过改变每个密码子的第三个核苷酸位置来实现；另外，有些氨基酸，诸如亮氨酸、丝氨酸、 和精氨酸，具有多种第一个和第二个位置，这可在建库中增加复杂性。Yansura等(1992) METHODS :A Companion toMethods in Enzymol. 4 151-158 中详细记载了这种诱变方法。在一个实施方案中，对于载体中的每个顺反子，生成具有一定范围TIR强度的一 组载体。这个有限集合提供了每条链的表达水平以及期望抗体产物的产量在各种TIR强度 组合下的比较。可通过量化报道基因的表达水平来测定TIR强度，Simmons等人，美国专利 No. 5，840，523中有详细记载。根据翻译强度的比较，选择期望的个别TIR在本发明的表达载体构建物中进行组合。适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌(Archaebacteria)和真细 菌(Eubacteria)，诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的例子包括埃希氏 菌属(Escherichia)(如大肠埃希氏菌E.coli)、芽孢杆菌属(Bacillus)(如枯草芽孢 杆菌 B. subtilis)、肠杆菌属(Enterobacteria)、假单胞菌属(Pseudomonas)物种(如 铜绿假单胞菌P. aeruginosa)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)、粘质沙雷 氏菌(Serratia marcescans)、克雷伯氏菌属(Klebsiella)、变形菌属(Proteus)、志贺 氏菌属(Shigella)、根瘤菌属(Rhizobium)、透明颤菌属(Vitreoscilla)、或副球菌属 (Paracoccus)。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆 菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的例子包括菌株W3110(BaChmann，Cellular and Molecular Biology,第 2 卷，Washington, D. C.，美国微生物学学会，1987，第 1190-1219 页；ATCC保藏号27,325)及其衍生物，包括具有基因型W3110 Δ fhuA( Δ tonA)ptr3 lac Iq lacL8 Δ ompT Δ (nmpc-fepE) degP41 kanR 的菌株 33D3 (美国专利 No. 5，639，635)。其 它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294 (ATCC 31，446)、大肠杆菌B、大肠杆菌λ 1776(ΑΤ(Χ 31,537)和大肠杆菌RV308 (ATCC 31,608)也是合适的。这些例子只是例示而非限制。本 领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass等， Proteins 8 :309_314 (1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的 细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制 子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分 泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。(2)抗体生成用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期 望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或 是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯 化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/ DMS0。使用的还有一种技术是电穿孔。在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽 的原核细胞。合适培养基的例子包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。 在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包 含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基 中添加氨苄青霉素。在碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单 独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含 有一种或多种选自下组的还原剂谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖 醇和二硫苏糖醇。在合适的温度培养原核宿主细胞。在某些实施方案中，对于培养大肠杆菌，培养的 温度范围为约20°C至约39°C、约25°C至约37°C、或约30°C。主要取决于宿主生物体，培养 基的PH可以是范围为约5至约9的任何pH。在某些实施方案中，对于大肠杆菌，pH为约
396. 8至约7. 4、或约7. 0。如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下 诱导蛋白质表达。在本发明的一个实施方案中，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因 此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。在某些实施方案中，磷 酸盐限制培养基是C. R. A. P培养基(参见例如Simmons等，J. Immunol. Methods 263 133-147 (2002))。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道 的。在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。 蛋白质回收通常牵涉破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmoticshock)、超声处理或裂 解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例 如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可转运到培养液中并从中分离。可从培 养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍 知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹测定法进一步分离和鉴定所 表达的蛋白质。在本发明的一个实施方案中，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补 料-分批发酵规程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，在某些实施 方案中是约1，000至100，000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤 其是葡萄糖(优选的碳源/能源)。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵 罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度(例如0D550约 180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期)后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构 建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养较短的 时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。为了提高本发明多肽的生产产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善 所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白(DsbA、DsbB, DsbC, DsbD和/或DsbG)或FkpA(具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式，反式-异构 酶)的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生 成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen等(1999) J.Biol. Chem. 274 :19601_19605 ； Georgiou 等，美国专利 No. 6，083, 715 ；Georgiou 等，美国专利 No. 6，027, 888 ；Bothmann 和 Pluckthun(2000)J. Biol. Chem. 275 17100-17105 ;Ramm 和 Pluckthun (2000)J. Biol. Chem. 275 :17106_17113 ；Arie 等(2001)Mol. Microbiol. 39 :199_210。为了将所表达异源蛋白质(尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质)的蛋白水解降 至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在 编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT, DegP, Tsp、蛋白酶I、 蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例 如Joly等(1998)见上文；Georgiou等，美国专利No. 5，264，365 ；Georgiou等，美国专利 No.5,508,192 ；Hara 等，Microbial Drug Resistance 2 63-72(1996)。在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过表达一 种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。
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(3)抗体纯化在一个实施方案中，进一步纯化本文中生成的抗体以获得基本上同质的制备物， 用于进一步的测定和使用。可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的规程是合适 纯化规程的例示免疫亲和或离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交 换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如S印hadex G-75 的凝胶过滤。在一个实施方案中，将固定化在固相上的蛋白A用于本发明抗体产物的免疫亲和 纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureas)的41kD细胞壁蛋白质，它 以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark等(1983) J. Immunol. Meth. 62 1-13。蛋白A固定化 其上的固相可以是具有玻璃或石英表面的柱子，或者可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应 用中，用诸如甘油等试剂包被柱，用以有可能防止污染物的非特异粘附。作为纯化的第一步，可以将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固 定化固相上，使得目的抗体特异性结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异性结合的 污染物。最后通过洗脱从固相回收目的抗体。b)使用真核宿主细胞生成抗体用于真核宿主细胞的载体通常包括一种或多种如下非限制性构件信号序列、复 制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。(1)信号序列构件在真核宿主细胞中使用的载体还可在目的成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序 列或具有特异性切割位点的其它多肽。可以选择受到宿主细胞识别并加工(即被信号肽酶 切除)的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌 前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。将这些前体区的DNA以符合读码框的方式连接至编码抗 体的DNA。(2)复制起点通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因它 包含早期启动子才使用。(3)选择基因构件表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋 白质(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素； (b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。选择方案的一个例子利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那 些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的例子使用药物 新霉素、霉酚酸和潮霉素。适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个例子是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的 细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白-I和II (优选灵长类金属硫蛋白基 因)、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。例如，在有些实施方案中，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤(Mtx，DHFR的 一种竞争性拮抗剂)的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在有些实 施方案中，在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是例如DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系(例如 ATCCCRL-9096)。或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素例如卡那霉素、 新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标 志诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞(特别是包 含内源DHFR的野生型宿主)。参见美国专利No. 4，965，199。(4)启动子构件表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别且与编码感兴趣多肽(例如抗体) 的核酸可操作连接的启动子。已知真核细胞的启动子序列。例如，事实上，所有真核基因都 具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游大约25至30个碱基处。在许多基因的转录起 点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT区，其中N可以是任何核苷酸。在大 多数真核基因的3'端是AATAAA序列，它可能是向编码序列的3'端添加聚腺苷酸(polyA) 尾的信号。在某些实施方案中，任何或所有这些序列可以合适的插入真核表达载体中。在哺乳动物宿主细胞中自载体转录受到例如从病毒(诸如多瘤病毒、禽痘病毒、 腺病毒(诸如2型腺病毒)、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病 毒、和猿病毒40(SV40))基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子(例如肌动蛋白启动子或 免疫球蛋白启动子)的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞 系统相容的话。方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还 包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立 即早期启动子。美国专利No. 4，419，446中披露了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物 宿主中表达DNA的系统。美国专利No. 4，601，978中记载了该系统的一种修改。关于在小 鼠细胞中在来自单纯疱疹病毒的胸苷激酶启动子的控制下表达人β “干扰素cDNA还可参 见Reyes等，Nature 297 :598_601 (1982)。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复作为启动 子。(5)增强子元件构件常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体的DNA 的转录。现在知道来自哺乳动物基因(珠蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素) 的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。例子包括SV40复制起 点晚期侧的增强子(bp 100-270)、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期 侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强子元件还可参见Yani^Nature 297:17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5'或3'位置，但是 一般位于启动子的5'位点。(6)转录终止构件在真核宿主细胞中使用的表达载体还可包含终止转录和稳定mRNA所必需的序 列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA的5'和偶尔的3'非翻译区获得。这些区 域包含在编码抗体的mRNA的非翻译部分中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有 用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见W094/11026及其中披露的表达载体。(7)宿主细胞的选择和转化适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养(组织培养)中的繁殖已经成为常规规程。有用 哺乳动物宿主细胞系的例子有经SV40转化的猴肾CVl系(C0S-7，ATCC CRL 1651)、人胚肾 系(293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham等，J. Gen. Virol. 36 59 (1977))、 幼仓鼠肾细胞(BHK，ATCC CCL 10)、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO，Urlaub等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 :4216 (1980))、小鼠塞托利(Sertoli)细胞(TM4, Mather, Biol. R印rod. 23 :243-251(1980))、猴肾细胞(CVl, ATCC CCL 70)、非洲绿猴肾细胞(VER0-76， ATCC CRL 1587)、人宫颈癌细胞(HELA, ATCC CCL2)、犬肾细胞(MDCK, ATCC CCL 34)、牛鼠 (buffalo rat)肝细胞(BRL 3A, ATCC CRL 1442)、人肺细胞(W138, ATCC CCL 75)、人肝细 胞(Hep G2，HB 8065)、小鼠乳瘤(MMT 060562, ATCC CCL 51) ,TRI 细胞(Mather 等，Annals N. Y. Acad. Sci. 383 :44-68 (1982))、MRC 5 细胞、FS4 细胞、和人肝瘤(h印atoma)系 Ofep G2)。为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、 选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。(8)培养宿主细胞可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如 Ham 氏 FlO(Sigma)、极限必需培养基(MEM, Sigma)、RPMI-1640 (Sigma)、禾口 Dulbecco 氏改 良Eagle氏培养基(DMEM，Sigma)适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的 任何培养基作为宿主细胞的培养基:Ham等，Meth. Enz. 58 44(1979) ；Barnes等，Anal. Biochem. 102 255(1980)；美国专利 No. 4，767，704 ；4，657，866 ；4，927，762 ；4，560，655 ；或 5，122，469 ；W090/03430 ；WO 87/00195 ；或美国专利Re. 30，985。任何这些培养基可根据需 要补充激素和/或其它生长因子(诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子)、盐(诸如氯 化钠、钙、镁和磷酸盐)、缓冲剂(诸如HEPES)、核苷酸(诸如腺苷和胸苷)、抗生素(诸如 GENTAMYCIN 药物)、痕量元素(定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物)、 和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它补充物。培养 条件诸如温度、PH等即为表达而选择先前与宿主细胞一起使用的，这对于普通技术人员是 显然的。(9)抗体的纯化在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细 胞内生成抗体，那么作为第一步可以通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或 是裂解片段。在抗体分泌入培养基的情况中，可以首先使用商品化蛋白质浓缩滤器(例如 Amicon或Millipore Pellicon超滤单元)浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上 述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污 染物的生长。可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析(亲和层析是一种便利的 技术)来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在 的任何免疫球蛋白Fc结构域的物种和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或 重链的抗体(Lindmark等，J. Immunol. Meth. 62 1-13(1983))。蛋白G推荐用于所有小鼠 同种型和人Y3(Guss等，EMBO J. 5 :1567-1575(1986))。亲和配体所附着的基质可以是琼 脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯容许获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。在抗体包含CH3结构域的情况中，可使 用Bakerbond ABX 树脂(J. T. Baker, Phillipsburg, NJ)进行纯化。根据待回收的抗体， 也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分级、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层 析、肝素SEPHAROSE 上的层析、阴离子或阳离子交换树脂(诸如聚天冬氨酸柱)上的层析、 层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。在任何初步纯化步骤之后，可将含有目的抗体和污染物的混合物进行进一步的纯 化，例如低PH疏水相互作用层析，使用pH约2. 5-4. 5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度(例 如约0-0. 25M盐)进行。一般而言，用于制备供研究、测试和临床使用的抗体的各种方法是本领域已完善 建立的，与上文所述方法是一致的和/或本领域技术人员认为对于特定的感兴趣抗体是适宜的。C.激动剂和拮抗剂提供了本发明AMP的激动剂和拮抗剂。此类AMP调控剂涵盖在本发明中，而且对 于治疗微生物病症是有用的，如本文中所提供的。在一个实施方案中，本发明AMP的激动剂或激动剂是抗体例如IL-22抗体或抗 IL-22R抗体。在某些实施方案中，抗IL-22抗体是促进IL-22与IL-22R相互作用的激动 性抗体。在另一个实施方案中，抗IL-22抗体是完全或部分阻断IL-22与IL-22R相互作用 的拮抗性抗体。在某些实施方案中，抗IL-22R抗体结合IL-22R的细胞外配体结合结构域。 例如，抗IL-22R抗体可以结合人类IL-22R的细胞外配体结合结构域，其在SEQ ID NO :3中 约氨基酸18-228中发现。在一个具体的实施方案中，IL-22激动剂是结合IL-22BP且阻断或抑制IL-22BP结 合IL-22并由此诱导或提高IL-22活性(例如结合IL-22R)的抗体。在另一个实施方案中，本发明AMP的激动剂或拮抗剂是结合AMP的寡肽。在一 个实施方案中，寡肽结合IL-22R的细胞外配体结合结构域。寡肽可以使用已知的寡肽合 成方法来化学地合成，或可以使用重组技术来制备和纯化。这种寡肽长度通常是至少约5 个氨基酸，或者长度至少约 6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、 25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、 50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、 75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、或 100个氨基酸。这种寡肽可以使用公知的技术不需过度实验地鉴定。对此，注意到，用于 对寡肽库筛选能够特异性结合多肽靶物的寡肽的技术是本领域公知的(参见例如美国专 利 No. 5，556，762,5, 750，373,4, 708，871,4, 833，092,5, 223，409,5, 403，484,5, 571，689、 5，663，143 ；PCT 公开 No. WO 84/03506 和 W084/03564 ；Geysen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. Α. ,81 3998-4002(1984) ；Geysen 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82 178-182 (1985)； Geysen 等，于 Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986) ；Geysen 等，J. Immunol. Meth.，102 :259-274 (1987) ；Schoofs 等，J. Immunol, 140 :611_616 (1988) ；Cwirla, S. E.等 (1990)Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 6378 ；Lowman, H. B.等(1991)Biochemistry, 30 10832 ；Clackson, Τ.等(1991)Nature, 352 624 ；Marks, J. D.等(1991)J. Mol. Biol, 222 581 ；Kang, Α. S.等(1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 88 8363 ；及 Smith, G. P. (1991)Current Opin. Biotechnol, 2 :668)。在又一个实施方案中，本发明AMP的激动剂或拮抗剂是不同于在此描述的寡肽或 抗体的、结合AMP的有机分子。有机分子可以是例如小分子。在一个实施方案中，有机分子 结合IL-22R的细胞外结构域。结合本发明AMP的有机分子可以使用已知的方法(参见，例 如，PCT公开No. W000/00823和W000/39585)来鉴定和化学地合成。这种有机分子通常大 小小于约2000道尔顿，或者大小小于约1500、750、500、250或200道尔顿，其中能够结合本 发明AMP的这种有机分子可以使用公知的技术不需过度的实验来鉴定。对此，注意到，用 于对有机分子库筛选能够结合多肽靶物的分子的技术是本领域公知的(参见例如PCT公开 No. W000/00823 和 W000/39585)。在一个具体的实施方案中，IL-22激动剂是结合IL-22BP且阻断或抑制IL-22BP结 合IL-22并由此诱导或提高IL-22活性(例如结合IL-22R)的有机分子。在一个具体的实施方案中，IL-22拮抗剂是可溶的IL-22受体，例如，非膜结合的 IL-22R形式。这种可溶形式的IL-22R可以与膜结合的IL-22R竞争结合IL-22。在某些实 施方案中，可溶形式的IL-22R可以包含IL-22R的细胞外结构域的所有部分或配体结合部 分，例如，包含SEQ ID NO :3的氨基酸18-228的所有部分或配体结合部分。在某些实施方 案中，可溶形式的IL-22R缺少跨膜结构域。例如，人IL-22R的可溶形式可以缺少SEQ ID NO 3的约氨基酸229-251的跨膜结构域的所有的或实质性的部分。已经报道了 IL-22的天然存在的可溶受体。参见Dumoutier L.等，‘‘Cloningand characterization of IL-22 binding protein,a natural antagonist ofIL-10-related T cell-derived inducible factor/IL-22, “ J. Immunol. 166 :7090_7095 (2001)；及 Xu W.等，"A soluble class II cytokine receptor,IL-22RA2,is anaturally occurring IL-22 antagonist, “ Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 98 :9511_9516 (2001)。本领域中，这 种受体被不同地称为"IL-22BP”或“IL-22RA2”。人IL-22BP的序列在图4中显示。如本文 中所使用的，术语“ IL-22BP”或“ IL-22结合蛋白”指来自任何脊椎动物来源，包括哺乳动物 诸如灵长类(例如人和猴)和啮齿类(例如小鼠和大鼠)的任何天然IL-22BP，除非另有陈 述。在又一个实施方案中，IL-22的拮抗剂是反义核酸，其降低IL-22或IL-22R基因 的表达(即，其降低IL-22或IL-22R基因的转录和/或IL-22或IL_22RmRNA的翻译)。在 某些实施方案中，反义核酸结合编码IL-22或IL-22R的核酸(DNA或RNA)。在某些实施方 案中，反义核酸是长度约10-30个核苷酸的寡核苷酸(包括两个端点之间的所有点)。在 某些实施方案中，反义寡核苷酸包含修饰的糖_磷酸二酯主干(或其它的糖连接，包括硫 代磷酸酯连接和如WO 91/06629中记载的连接)，其中这种修饰的糖-磷酸二酯主干对内 源核酸酶具有抗性。在一个实施方案中，反义核酸是寡脱氧核糖核苷酸，其引起编码IL-22 或IL-22R的mRNA的降解和/或降低的转录或翻译。在某些实施方案中，反义核酸是通过 “RNA干扰”(“RNAi”)降低靶核酸的表达的RNA。对于RNAi的综述，参见，例如，Novina等 (2004) Nature 430 :161_164。这种 RNA 衍生自例如短干扰 RNA (siRNA)和 microRNA。例如， siRNA可以作为长度约18-26个核苷酸的双链寡核糖核苷酸来合成。见上文。在又一个实施方案中，提供了 IL-22的激动剂。示范性的激动剂包括，但不限于， 天然IL-22或IL-22R ；保持天然多肽的至少一种活性的IL-22或IL-22R片段、变体或修饰形式；能够结合并活化IL-22R的试剂；及诱导IL-22或IL-22R或编码IL-22或IL-22R的 核酸过表达的试剂。D.药物配制剂本发明提供了药物配制剂。在一个实施方案中，药物配制剂包含1)活性剂，例如 任何上文所述多肽、抗体、激动剂、或拮抗剂；和2)药学可接受载体。在另一个实施方案中， 药物配制剂进一步包含至少一种别的治疗剂。药物配制剂可通过将具有期望纯度的药剂与任选的制药学可接受的载体、赋形剂 或稳定剂(Remington' s Pharmaceutical Sciences,第 16 版，Osol, Α.编，1980)混合， 以冻干配制剂或水溶液的形式制备供贮存。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂 量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧 化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双 胺；苯扎氯铵、苄索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烃基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯 或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基) 多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮； 氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水 化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA ；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或 山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；金属复合物(例如Zn-蛋白质复合物)；和/或非离子表面 活性剂，诸如TWEEN 、PLURONICS 或聚乙二醇(PEG)。脂转染或脂质体也可用于将药剂投递入细胞。在药剂是抗体片段的情况中，优选 特异性结合靶蛋白质的最小抑制性片段。例如，根据抗体的可变区序列，可以设计保留结合 靶蛋白质序列能力的肽分子。此类肽可以化学合成和/或通过重组DNA技术生成(参见例 如 Marasco 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA90 :7889_7893 [1993])。本文中所公开的抗体还 可配制成免疫脂质体。可通过本领域知道的方法来制备包含抗体的脂质体，诸如Epstein 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82 3688 (1985) ；Hwang 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 4030(1980)；及美国专利No. 4，485，045和4，544，545中所记载的。美国专利No. 5，013，556 中披露了循环时间延长的脂质体。特别有用的脂质体可用含有磷脂酰胆碱、胆固醇和PEG 衍生化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)的脂质组合物通过反相蒸发法生成。将脂质体挤过具有 限定孔径的滤器，以产生具有期望直径的脂质体。可将本发明抗体的Fab’片段经二硫化 物交换反应与脂质体偶联，如Martin等，J. Biol. Chem. 257 =286-288(1982)中所记载的。 任选在脂质体中包含化疗剂(诸如多柔比星)。参见Gabizon等，J. National Cancer Inst. 81(19) 1484 (1989)。药剂还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中(例如分别 是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊)、在胶状药物投递系统中 (例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊)、或在粗滴乳状液中。此类技 术披露于例如 Remington' s PharmaceuticalSciences,H 16 版，Osol, A.编，1980。可制备药剂的持续释放制剂。持续释放制剂的合适例子包括含有药剂的固体疏水 性聚合物半透性基质，该基质是定型产品的形式，例如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子 包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专 利No. 3，773，919)、L-谷氨酸与L-谷氨酸γ乙酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT (由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林 构成的可注射微球体)及聚-D-(_)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇 酸等聚合物能够释放分子达100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当封装 的抗体在身体中长时间维持时，它们可能由于暴露于37°C的潮湿环境而变性或聚集，导致 生物学活性损失和免疫原性可能改变。可以根据所涉及的机制来设计合理的稳定化策略。 例如，如果发现聚集机制是经由硫_ 二硫化物互换的分子间S-S键形成，那么可通过修饰巯 基残基、自酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定聚合物基质组合物来实现 稳定。本文中的药物配制剂还可含有所治疗具体适应症所必需的超过一种活性化合物。 例如，在一个实施方案中，含有超过一种活性化合物的药物配制剂包含1)至少一种IL-22 激动剂，例如结合IL-22的抗体和/或结合IL-22R的抗体；和2)至少一种结合IL-6或 IL-23的抗体(其中可以以任何组合选择任何数目的2)中所列抗体)。在另一个实施方案 中，药物配制剂包含两种或多种具有互补活性的活性化合物。E.治疗方法本发明还提供治疗微生物病症的方法。在一个实施方案中，本发明提供治疗受试 者中的微生物病症的方法，包括对所述受试者施用有效量的包含AMP或AMP调控剂的药物 组合物，其中所述AMP选自下组:LT、IL-6、IL-18、IL-22、IL-23、REG I α、REG I β、HIP/PAP、 REG IIKREG IV和Reg相关序列(RS)。在一个实施方案中，所述病症是由EHEC或EPEC引 起的腹泻、炎性肠病(IBD)或更具体的溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩氏病(CD)。在一个实施方案中，本发明提供治疗受试者中的微生物病原体(例如细菌或病 毒)感染的方法，包括对所述受试者施用有效量的包含AMP或AMP调控剂的药物组合物，其 中所述六1^选自下组山1\比-6、11^-18、比-22、比-23、1 6 I α ,REG I β、HIP/PAP、REG III、 REG IV和Reg相关序列(RS)。在另一个实施方案中，本发明提供调控受到微生物病原体(例如细菌或病毒)感 染的受试者的细胞中AMP活性的方法，包括使所述细胞接触AMP或AMP调控剂，其中所述 AMP 选自下组LT、IL-6、IL-18、IL-22、IL-23、REG I α、REG I β、HIP/PAP、REG III (例如 REG III β 或 REGIIIy)、REG IV、和 Reg 相关序列(RS)。在另一个实施方案中，本发明提供治疗受试者中的微生物病症的方法，包括使所 述受试者的细胞接触编码AMP或AMP调控剂的核酸分子(例如DNA或RNA分子)，其中所 述八1^选自下组丄1\比-6、11^-18、比-22、比-23、1 6 I α ,REG I β、HIP/PAP、REG III,REG IV和Reg相关序列(RS)。在一个实施方案中，所述病症是由EHEC或EPEC引起的腹泻、炎 性肠病(IBD)或更具体的溃疡性结肠炎(UC)或克罗恩氏病(CD)。在另一个实施方案中，本发明提供调控受到微生物病原体(例如细菌或病毒)感 染的受试者的细胞中AMP活性的方法，包括使所述细胞接触编码AMP或AMP调控剂的核酸 分子(例如DNA或RNA分子)，其中所述AMP选自下组LT、IL-6, IL-18, IL-22、IL-23, REG I α、REG I β、HIP/PAP、REG III (例如 REG III β 或 REGIII γ )、REG IV、和 Reg 相关序列 (RS)。微生物病原体的例子包括但不限于细菌或病毒。在一个实施方案中，所述微生物 病原体是细菌，例如革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌。在一个具体的实施方案中，所述细菌是
47革兰氏阴性细菌。在另一个实施方案中，所述细菌是粘附或抹消(A/E)细菌，而且更具体地 是肠出血性大肠杆菌(EHEC)或肠致病性大肠杆菌(EPEC)。在一个实施方案中，所述细菌是 肠致病性大肠杆菌(EHEC)，是大肠杆菌0157 :H7或大肠杆菌055 :H7。本发明的治疗方法包括本发明的一种或多种组合物或药物配制剂。除非另有陈 述，这些方法包括体外的、回体的(ex vivo)和体内的治疗方法。在各种实施方案中，本发明提供通过刺激或抑制由AMP介导的信号传导途径和/ 或细胞功能来调控抗微生物免疫应答的方法。所述方法对于治疗微生物病症是有 用的。例如，在一个实施方案中，本发明提供通过刺激由AMP介导的信号传导途径例如由 IL-22和/或IL-23介导的信号传导途径来增强抗微生物免疫应答的方法。在另一个实施 方案中，本发明提供通过刺激或抑制由细胞因子介导的信号传导途径来调控抗微生物免疫 应答的方法。例如，在一个实施方案中，本发明提供通过刺激由细胞因子介导的信号传导途 径例如IL-22和/或IL-23信号传导途径来增强抗微生物免疫应答的方法。此外，本发明 提供通过刺激或抑制Tht17细胞功能来调控抗微生物免疫应答的方法。在一个实施方案中，本发明提供刺激生物学系统中由AMP介导的信号传导途径的 方法，该方法包括给所述生物学系统提供AMP激动剂。所述生物学系统的例子包括但不限 于体外细胞培养系统中的或生物体体内的哺乳动物细胞。在另一个实施方案中，本发明提 供抑制生物学系统中由AMP介导的信号传导途径的方法，该方法包括给所述生物学系统提 供AMP拮抗剂。在一个具体的实施方案中，本发明提供通过刺激生物学系统中由IL-23和/或 IL-22介导的信号传导途径来增强生物学系统中的抗微生物免疫应答的方法，该方法包括 给所述生物学系统提供IL-22或IL-22激动剂。在一个实施方案中，IL-22激动剂是IL-22。 在另一个实施方案中，所述IL-22激动剂是结合IL-22的抗体。在另一个实施方案中，提供抑制生物学系统中由IL-23介导的信号传导途径的方 法，该方法包括给所述生物学系统提供IL-22拮抗剂。在一个实施方案中，所述IL-22拮抗 剂是抗体，例如中和性抗IL-22抗体和/或中和性抗IL-22R抗体。在另一个实施方案中，本发明提供刺激Tht17细胞功能的方法，该方法包括将 细胞暴露于AMP的激动剂，其中所述AMP介导由IL-23介导的信号传导途径(例如
IL-23、IL-6、或IL-22)。所述方法对于治疗微生物病症是有用的。在一个实施方案中，IL-22 激动剂是IL-22。在另一个实施方案中，所述IL-22激动剂是结合IL-22的抗体。在另一个实施方案中，提供抑制Tht17细胞功能的方法，该方法包括将Tht17细胞 暴露于AMP的拮抗剂，其中所述AMP介导由IL-23介导的信号传导途径(例如IL-23、IL-6、 或IL-22)。在一个实施方案中，所述拮抗剂是抗IL-22抗体，例如中和性抗IL-22抗体。例示性的Thiw7细胞功能包括但不限于刺激由细胞介导的免疫(迟发型超敏感 性)；募集先天免疫细胞，诸如髓样细胞(例如单核细胞和嗜中性粒细胞)至炎症部位；和 刺激炎症细胞浸润入组织中。在一个实施方案中，细胞功能是由IL-23和/或IL-22 介导的。本发明的组合物依照已知的方法施用给哺乳动物，优选人类，诸如，作为推注或通 过一段时间的连续输注的静脉内施用，通过肌肉内的、腹膜内的、脑脊内的、皮下的、关节内 的、滑膜内的、鞘内的、口腔的、体表的、或吸入(鼻内、肺内)路径。多肽和抗体的静脉内或
48吸入施用是优选的。为了治疗或降低微生物病症的严重程度，本发明组合物的适宜剂量将取决于如上 文定义的要治疗的病症的类型、病症的严重程度和进程、施用药剂是预防还是治疗目的、早 先的治疗、患者的临床史和对化合物的响应、及主治医师的判断。一次性或在一系列治疗中 将化合物适当地施用给患者。例如，取决于病症的类型和严重程度，约1 μ g/kg至15mg/kg(例如0. l_20mg/kg) 的多肽或抗体是对患者施用的起始候选剂量，例如，无论是通过一次或多次分开的施用还 是通过连续的输注。典型的每日剂量可以从约1 μ g/kg到100mg/kg或更多，取决于上述的 因素。对于持续几天或更长时间的重复施用，取决于状况，持续进行治疗直到产生期望的对 疾病症状的抑制。然而，其它剂量方案也是有用的。可以通过常规的技术和测定法来容易 地监测此疗法的进展。F.诊断方法和检测方法在一个实施方案中，本发明提供检测生物学样品中AMP的存在的方法，包括在容 许下述抗体结合AMP的条件下使所述生物学样品接触AMP的抗体，并检测是否形成所述抗 体和AMP之间的复合物。在一个实施方案中，本发明提供监测受试者中微生物病症治疗的方法，其中所述 方法包括检测自需要治疗的受试者获得的组织细胞测试样品中编码AMP的基因的表达水 平，并检测测试样品中的表达水平。检测可以是定性的或定量的。在一个实施方案中，所述 测试样品包含血液或血清。在一个实施方案中，检测编码AMP的基因的表达水平包括(a) 使抗AMP抗体接触自所述哺乳动物获得的测试样品，并(b)检测所述抗体与所述测试样品 中AMP之间复合物的形成。所述抗体可以连接有可检测标记物。复合物形成可以通过，例 如，光学显微术、流式细胞术、荧光测定术或本领域已知的其它技术来监测。测试样品可以 自怀疑患有微生物病症的个体获得。在一个实施方案中，检测编码AMP多肽的基因的表达水平包括检测来自所述基因 的mRNA转录水平。mRNA转录水平可以通过本领域技术人员已知的各种方法来定量地或定 性地检测。mRNA转录水平也可以通过检测从所述mRNA产生的cDNA的水平来直接地或间接 地检测。检测mRNA转录水平的示范性的方法包括但不限于实时定量RT-PCR和基于杂交的 测定法，包括基于微阵列的测定法和基于滤膜的测定法，例如Northern印迹。在另一个实施方案中，本发明提供检测生物学样品中AMP的存在的方法，包括在 容许下述抗体结合AMP的条件下使所述生物学样品接触AMP的抗体，并检测是否形成所述 抗体和AMP之间的复合物。在另一个实施方案中，本发明涉及诊断试剂盒，其含有适合的包装中的抗AMP。所 述试剂盒优选的含有使用所述抗体来检测AMP的说明书。在一个实施方案中，所述诊断试 剂盒用于诊断微生物病症。在一个实施方案中，所述诊断试剂盒用于诊断微生物感染。在另一个实施方案中，本发明提供包含一种或多种本发明AMP和/或其调控剂的 试剂盒。在另一个实施方案中，本发明提供包含一种或多种药物组合物的试剂盒，所述药物 组合物每一种包含本发明的AMP或其调控剂。G.测定法1.基于细胞的测定法和动物模型
免疫性疾病的基于细胞的测定法和动物模型在实施本发明的某些实施方案中是 有用的。在下文实施例中提供的某些基于细胞的测定法是有用的，例如，用于测试IL-22拮 抗剂或激动剂的效力。体内动物模型对于实施本发明的某些实施方案也是有用的。还在下文实施例中描 述了示范性的动物模型。这些模型的体内性质使得它们对于人类患者中的应答是预测性 的。免疫相关疾病的动物模型包括非重组的和重组的(转基因的)动物。非重组动物模型 包括例如啮齿动物如鼠模型。这种模型可以通过使用标准技术将细胞导入同基因小鼠来产 生，例如皮下注射、尾静脉注射、脾植入、腹膜内植入、肾囊下植入、等。移植物抗宿主疾病模型提供了评估针对MHC抗原和次要移植物抗原的T细胞反应 性的手段。当免疫活性细胞被移植到免疫抑制的或耐受的患者中时，移植物抗宿主疾病发 生。供体细胞识别并应答宿主抗原。应答可以从危及生命的严重炎症到腹泻和体重减轻的 轻微病情。评定移植物抗宿主疾病的适合规程在Current Protocols in Immunology，见上 文，单元4. 3中详细记载了。皮肤同种移植物排斥的动物模型是测试T细胞介导体内组织破坏的能力的手段， 和它们在移植物排斥中的作用的度量。大多数常见的和公认的模型使用鼠尾部皮肤移植 物。重复的实验已经显示了皮肤同种移植物排斥由T细胞、辅助T细胞和杀伤效应器T细 胞而不是抗体来介导° Auchincloss,H. Jr.禾口 Sachs,D. H. ,Fundamental Immunology,第 2 版，W. Ε· Paul 编，Raven Press，NY，1989，889—992。在 Current Protocols in Immunology, 上文，单元4. 4中详细记载了适合的规程。可以用于测试本发明的化合物的其它移植物排 斥模型是 Tanabe，Μ.等，Transplantation (1994) 58 23 和 Tinubu，S. Α.等，J. Immunol. (1994)4330-4338记载的同种异基因心脏移植物模型。接触超敏反应是细胞介导的免疫功能(迟发型超敏反应)的简单体内测定法。 在这个规程中，皮肤暴露于引起迟发型超敏反应的外源半抗原，所述迟发型超敏反应被 测量和定量。接触敏感性涉及起始的敏化阶段(sensitizingphase)，接着是引发阶段 (elicitation phase) 0当T淋巴细胞遭遇它们早先接触过的抗原时，发生引发阶段。发生 肿胀和发炎，使得它成为人类变应性接触性皮炎的极好的模型。在Current Protocols in Immunology,编 J. Ε. Cologan, Α. Μ. Kruisbeek, D. H. Margulies,Ε. Μ. Shevach 禾口 I Strober, John Wiley & Sons, Inc.，1994，单元4. 2.中详细记载了适合的规程。还可参见Grabbe， S.和 Schwarz，T，Immun. Today 19(1) :37_44(1998)。此外，本发明的组合物可以在银屑病样疾病的动物模型上测试。例如，本发明的组 合物可以在Schon，Μ. P.等，Nat. Med. (1997)3 183记载的scid/scid小鼠模型中测试，其 中小鼠展现出类似于银屑病的组织病理性皮肤损伤。另一种适合的模型是如Mckoloff， B.J.等，Am. J.Path. (1995) 146:580所述制备的人类皮肤/scid小鼠嵌合体。另一种 适合的模型在Boyman等，J ExpMed(2004) 199 (5) :731_6中记载，其中人类前银屑病性 (prepsoriatic)皮肤被移植到AGR129小鼠上，引起银屑病性皮肤损伤的发生。作为编码多肽的内源基因与该基因已经改变的DNA分子之间同源重组的结果，可 以构建具有缺陷的或改变的编码在此鉴定的多肽的基因的敲除动物。例如，编码特定多肽 的cDNA可以用于依照建立的技术克隆编码该多肽的基因组DNA。编码特定多肽的基因组 DNA的一部分可以被删除或用另一种基因替换，诸如编码可用于监测整合的选择标志的基因。通常，几千个碱基的未改变的侧翼DNA(在5'和3'两个末端)被包括在载体中[同源 重组载体的描述参见，例如Thomas和Capecchi，Cell，51 :503(1987)]。载体被导入胚胎干 细胞系(例如，通过电穿孔)中，并且选择其中导入的DNA与内源DNA已经同源重组的细胞 [参见，例如Li等，Cell，69 915 (1992)]。选择的细胞然后注射到动物(例如，小鼠或大鼠) 的胚泡中来形成聚集嵌合体[参见，例如Bradley，于Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells :A PracticalApproach,Ε. J. Robertson,编(IRL,Oxford,1987),pp. 113-152]。 然后，嵌合的胚胎能植入适合的伪孕雌性养育动物中，并使胚胎足月妊娠来创建“敲除”动 物。在它们的生殖细胞中携带同源重组的DNA的子代可以通过标准技术来鉴定，用于培育 其中动物的所有细胞含有同源重组的DNA的动物。敲除动物可以特征在于例如它们抵御某 些病理疾患的能力和它们由于缺乏所述多肽发生病理疾患。2.药物候选物的筛选测定法药物候选物的筛选测定法设计用以鉴定与在此鉴定的多肽或其生物学活性片段 结合或复合、或者以其它方式干扰多肽与其它细胞蛋白质相互作用的化合物。这种筛选测 定法将包括可适应化学物质文库的高通量筛选，使得它们特别适合于鉴定小分子药物候选 物的测定法。所涵盖的小分子包括合成的有机或无机化合物，包括肽(优选可溶性肽)、 (多)肽-免疫球蛋白融合物、以及特别是抗体，包括但不限于多克隆抗体和单克隆抗体及 抗体片段、单链抗体、抗独特型抗体、以及这些抗体或片段的嵌合的或人源化的形式，以及 人抗体和抗体片段。可以以各种形式实施测定法，包括蛋白质_蛋白质结合测定法、生物化 学筛选测定法、免疫测定法和基于细胞的测定法，它们是本领域良好表征的。所有测定法的 共同之处在于它们要求使测试化合物接触在此鉴定的多肽，接触的条件和持续时间足以容 许所述多肽与测试化合物相互作用。在结合测定法中，相互作用是结合，可以在反应混合物中分离和检测形成的复合 物。在一个特定的实施方案中，多肽或测试化合物通过共价的或非共价的附着而固定化在 固相上，例如微量滴定板上。非共价附着一般通过用多肽或测试化合物的溶液包被固体表 面并干燥来实现。或者，固定化的抗体，例如对要固定化的多肽特异性的单克隆抗体可以用 于将多肽锚定至固体表面。通过将用可检测标记物标记的非固定化成分添加至固定化成 分，例如，含有锚定成分的包被表面，来进行测定法。当反应完成时，未反应的成分被除去， 例如，通过洗涤，检测锚定在固体表面上的复合物。当最初的非固定化成分携带可检测标记 物时，固定化在表面上的标记物的检出表明发生了复合。在最初的非固定成分不携带标记 物的情况中，例如通过使用特异性结合固定化的复合物的带标记物的抗体能检测复合。如果测试化合物与在此鉴定的特定多肽相互作用于但不结合，那么它与该蛋 白质的相互作用可以通过检测蛋白质-蛋白质相互作用的公知方法来测定。这种测定 法包括传统方法，诸如，交联、免疫共沉淀、以及通过梯度或层析柱的共纯化。此外，蛋 白质-蛋白质相互作用可以通过如Chevray和Nathans，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89， 5789-5793(1991)所披露的、使用Fields和同事记载的基于酵母的遗传系统[Fields 和 Song，Nature (London) 340，245-246 (1989) ；Chien 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88， 9578-9582(1991)]来监测。许多转录激活物(诸如酵母GAL4)由两个物理上分立的模块结 构域组成，一个起到DNA结合结构域的作用，而另一个发挥转录激活结构域的功能。在上述 公开物中记载的酵母表达系统(一般称为“双杂交系统”)利用了这种性质，采用两种杂合蛋白，在一种中，靶蛋白质融合至GAL4的DNA结合结构域，在另一种中，候选激活蛋白质融 合至激活结构域。GALl-IacZ报道基因在GAL4激活的启动子的控制之下的表达取决于经由 蛋白质-蛋白质相互作用的GAL4活性的重构。用半乳糖苷酶的产色底物检测含有相 互作用多肽的菌落。用于使用双杂交技术鉴定两种特定蛋白质之间的蛋白质-蛋白质相互 作用的完整试剂盒(MATCHMAKER )可从Clontech购买。这种系统也可以扩展到绘制涉及 特定蛋白质相互作用的蛋白质结构域，以及定位对这些相互作用至关重要的氨基酸残基。为了鉴定干扰在此鉴定的多肽与其它细胞内或细胞外成分的相互作用的化合物， 可以在容许所述多肽与所述成分相互作用的条件下制备含有所述多肽和所述成分的反应 混合物。为了测试测试化合物抑制相互作用的能力，在缺乏和存在所述测试化合物的情况 下制备反应混合物。如果在存在所述测试化合物的情况下所述多肽与所述成分的相互作用 降低，那么称所述测试化合物抑制所述多肽与所述成分的相互作用。在某些实施方案中，鉴定AMP的激动剂或拮抗剂的方法包括使AMP接触候选激动 剂或拮抗剂分子并测量在通常与所述AMP相关的一种或多种生物学活性方面可检测的改 变。这些活性包括但不限于在下文实施例中描述的那些。在一个实施方案中，本发明提供用于鉴定IL-22多肽的激动剂的方法，包括使 IL-22多肽接触候选激动剂分子并测量在通常与所述IL-22多肽相关的一种或多种生物学 活性方面可检测的改变。这些活性包括但不限于在下文实施例中描述的那些。3.抗体结合测定法抗体结合研究可以以任何已知的测定法来进行，例如，竞争性结合测定法、直接 和间接夹心式测定法、及免疫沉淀测定法。Zola，MonoclonalAntibodies :A Manual of Techniques,pp.147-158(CRC Press, Inc. ,1987)。竞争性结合测定法依靠标记的标准物与测试样品分析物竞争对有限量的抗体的 结合的能力。测试样品中靶蛋白质的量与结合至抗体的标准物的量成反比。为了便于测定 结合的标准物的量，优选在所述竞争之前或之后使抗体不溶，从而结合至抗体的标准物和 分析物可以方便地与保持未结合的标准物和分析物分开。夹心式测定法涉及使用两种抗体，每一种都能够结合要检测的蛋白质的不同的免 疫原性部分，或表位。在夹心式测定法中，测试样品分析物被固定化在固体支持物上的第一 抗体结合，此后第二抗体结合至所述分析物，从而形成不溶的三部分复合物。参见，例如，美 国专利No. 4，376，110。第二抗体可以自身用可检测模块标记(直接夹心式测定法)，或可 以使用用可检测模块标记的抗免疫球蛋白抗体来测量(间接夹心式测定法)。例如，一类夹 心式测定法是ELISA测定法，其中可检测模块是酶。免疫组织化学也可以用于确定抗体所结合的抗原的细胞位置。对于免疫组织化 学，组织样品可以是新鲜的或冷冻的，或可以包埋入石蜡并用防腐剂诸如例如福尔马林固定。制品在另一个实施方案中，本发明提供了包含对于本文所述微生物病症的诊断或治疗 有用的组合物的制品。所述制品包括容器和说明书。适合的容器包括，例如，瓶、管形瓶、注 射器和试管。所述容器可以由各种材料诸如玻璃或塑料制成。容器装有对于所述疾患的诊 断或治疗有效的组合物，并且可以具有无菌的存取口(例如，所述容器可以是具有可被皮下注射针刺穿的塞子的静脉内溶液袋或管形瓶)。组合物中的活性试剂通常是本发明的多 肽、抗体、激动剂或拮抗剂。在容器上或与容器相连的说明书或标签表明了所述组合物是用 于诊断或治疗所选的疾患。所述制品可以进一步包括第二容器，其中装有药学可接受的缓 冲液，诸如磷酸盐缓冲盐水、林格氏溶液和右旋糖溶液。它可以进一步包括从商业和用户立 场出发的其它想要的材料，包括其它缓冲液、稀释剂、滤器、针、注射器和带使用说明书的包 装插页。在一个实施方案中，本发明提供了一种制品，包括(a)包含AMP或其调控剂(例如IL-22激动剂)的组合物；(b)装有所述组合物的容器；和(c)附加在所述容器上的标签，或包括在所述容器中的包装插页，关于在微生物病 症的治疗中使用所述激动剂。所述组合物可以包含有效量的激动剂。
实施例下文是本发明方法和组合物的实施例，而且在本文中出于例示目的提供，而非意 图限制本发明的范围。应当理解，鉴于本文中所提供的一般描述，可实施各种其它实施方案。除非另有陈述，实施例中提及的商品化试剂依照制造商的说明书使用。在以下实 施例中及在整个说明书中以ATCC登记号鉴别的那些细胞的来源是美国典型培养物保藏中 心(American Type Culture Collection，Manassas，VA)。本文中所呈现的数据首次证明了 IL-22是在A/E细菌病原体感染早期期间连接适 应性免疫应答和先天性上皮防御的关键细胞因子之一。如本文中所显示的，对RegIII β和 RegIII Y的诱导也指示IL-22在控制各种细菌感染中可具有更宽的功能。所述数据进一步 支持Thl7细胞及其效应器细胞因子在传染性疾病和自身免疫性疾病中的作用。最后，本研 究指示IL-22及其下游产物诸如RegIII β和RegIII γ对于治疗某些传染性疾病可以是有 益的。实施例1 :IL_23是传染病过程期间IL-22调节所必需的本文中的数据证明IL-23是传染病过程期间IL-22调节所必需的。IL-22R和IL-IOR^链这两种IL-22受体对都在野生型C57B1/6小鼠的GI道中 表达(图1A)。它们在十二指肠、空肠、回肠、和结肠中的表达比它们在皮肤中的表达要 高，皮肤是IL-22在其中显示诱导增生的组织。一致的是，结肠上皮细胞和上皮下成肌纤 维细胞都报告响应IL-22。在啮齿类柠檬酸杆菌感染期间，在野生型小鼠的结肠中诱导了 IL-22(图1B)，正如促进Thl7细胞分化的细胞因子，包括IL-23的pl9和p40亚基(图 1C-D)、和IL-6 (图1E)。所有这些细胞因子被快速诱导，峰值表达位于接种后第4天前后。 相反，IL-17诱导具有较慢的动力学，而且在接种后第12天达到其最大水平(图1F)。由于IL-23或IL-6任一在体外促进T细胞生成IL-22，因此本发明人试图首先限 定它们在啮齿类柠檬酸杆菌感染期间在调节IL-22生成中的作用。在比较啮齿类柠檬酸杆 菌感染后野生型、Pl9+、p40+、和IL-6+小鼠的存活率时，我们一致地发现来自p40+组 (图1G)或pl9+组(数据未显示)任一的所有小鼠在接种后10天死亡。有趣的是，在第12 天前后在IL-6+组中也观察到60%的死亡率(图1G)，指示对啮齿类柠檬酸杆菌感染的完全控制一定程度地需要IL-6。接着，我们检查了 pl9+和IL-6+这两种小鼠中的IL-22和 IL-17表达(图1H)。与野生型小鼠相比，虽然IL-17表达在pl9+小鼠中没有改变(15)， 但是IL-22诱导在ρ 19+小鼠中降低了。然而，在IL-6+小鼠中，虽然IL-22的峰值水平与 野生型小鼠的相当，但是其诱导显著延迟了(图1H)。此外，在IL-6+小鼠中，IL-17诱导 显著降低了，与IL-6对IL-17生成的必需作用一致。在来自受感染小鼠的结肠的离体培养物中通过ELISA直接测量IL-22/IL-17蛋白 质，证实了啮齿类柠檬酸杆菌感染期间P19+小鼠中IL-22/IL-17生成的动力学和IL-22诱 导的缺失(图11)。这些数据首次证明IL-23是传染病过程期间IL-22调节所必需的。这些数据首次证明IL-23是传染病过程期间IL-22调节所必需的。实施例2:IL_22是促成IL-23在控制微生物感染中的生物学的关键下游效应器细 胞因子IL-23缺陷和IL-6+这两种小鼠中改变的IL-22调节指示IL-22可能在宿主针对 啮齿类柠檬酸杆菌感染的防御中发挥至关重要的作用。为了进一步检查IL-22的作用，给 IL-22+小鼠接种啮齿类柠檬酸杆菌。虽然野生型同窝小鼠瞬时减轻体重，但是能够在第6 天后完全恢复，而IL-22+小鼠在啮齿类柠檬酸杆菌感染后继续减轻体重(图2A)。约80% 的IL-22+小鼠在接种啮齿类柠檬酸杆菌后12天变成垂死或死亡(图2A)。对来自第8天 受感染IL-22+小鼠的结肠的组织学分析展示粘膜厚度与WT小鼠的相比增加(图2B)。一 致的是，粘膜下炎症也增加(箭，图2B)。此外，虽然在对照小鼠中，啮齿类柠檬酸杆菌感染 主要是浅表的，但是在IL-22+小鼠中，大量的细菌深深地渗透入结肠隐窝中(箭，图2C)。 用抗IL-22R抗体进行的FACS分析(图12)揭示E-钙粘蛋白阳性原代鼠结肠上皮细胞表达 IL-22R，但是⑶45+上皮内淋巴细胞(IEL)或固有层单个核细胞(LPMC)不表达IL_22R(图 12A)。类似地，原代人结肠上皮细胞也表达IL-22R (图12B)。这些数据提示IL-22直接靶 定结肠上皮细胞。这些数据支持IL-22在宿主针对啮齿类柠檬酸杆菌感染的防御中的重要性，而且 指示IL-22可以是促成IL-23在控制微生物感染中的生物学的关键下游效应器细胞因子之
ο实施例3 宿主针对啮齿类柠檬酸杆菌感染的防御不需要IL-17A和IL-17F途径IL-6+小鼠中针对啮齿类柠檬酸杆菌的宿主防御的部分受损也可通过这些小鼠 中IL-22诱导延迟来解释(图1H，左边小图)。然而，也可能受到啮齿类柠檬酸杆菌感染的 IL-6+小鼠中的致命性可能是由于它们没有能力上调IL-17(图1H，右边小图)。IL-17途 径对于控制许多细胞外细菌感染(诸如肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae))是至 关重要的。IL-17 经由 IL-17R 和 IL-17RC 发信号(D. Toy 等，J Immunol 177, 36 (July 1， 2006))，而且自许多细胞类型(包括上皮细胞)诱导促炎症应答(J.WitowskLK.Ksiazek， A. Jorres, CellMol Life Sci 61，567 (Mar，2004))。为 了分析 IL-17途径在啮齿类柠檬酸杆 菌感染期间的作用，生成了 IL-17RC+小鼠(图5)。与野生型同窝小鼠相比，IL-17RC+小 鼠在T细胞、B细胞和其它免疫细胞的发育或组成方面没有明显缺陷(数据未显示)。然而， 自IL-17RC+小鼠尾尖(图5C)或肺组织(数据未显示)生成的成纤维细胞在用IL-17A或 IL-17F任一刺激时完全没有能力生成IL-6，指示IL-17RC对于由IL-17A和IL-17F 二者介 导的功能是必需的受体。在接种啮齿类柠檬酸杆菌后，IL-17RC+小鼠和野生型同窝小鼠都在感染过程中存活，没有任何显著减轻体重(图2D)或任何结肠组织学差异(数据未显 示)°这些结果指示宿主针对啮齿类柠檬酸杆菌感染的防御不需要IL-17A和IL-17F途 径，直接排除了 IL-17生成缺陷是在IL-6+小鼠中观察到的死亡的主要起因的可能性。如 此，在IL-6+小鼠中观察到的IL-22诱导延迟可能是这些小鼠没有能力在感染中存活的原 因。然而，IL-6下游的其它因子可能也是重要的。来自IL-6+小鼠的结果暗示早期IL-22 诱导对于宿主发起足够的针对啮齿类柠檬酸杆菌感染的应答以防止致命性可能是至关重 要的。实施例3 JL-22在细菌感染早期阶段发挥至关重要的作用为了确定早期IL-22诱导对于宿主发起足够的针对啮齿类柠檬酸杆菌感染的应 答以防止致命性是否是至关重要的，自第0天或接种啮齿类柠檬酸杆菌后第8天开始隔天 施用抗IL-22中和性抗体。正如所预期的，在接种细菌的同时接受抗IL-22单抗的小鼠继 续减轻体重，而且在接种后12天都变得垂死或死亡。相反，所有用同种型对照抗体处理的 动物都存活(图2E)。自接种后8天开始接受抗IL-22单抗的小鼠具有与用同种型单抗处 理的小鼠相似的后果，自感染完全恢复。因此，这些数据指示IL-22在啮齿类柠檬酸杆菌感染早期阶段发挥至关重要的作 用，但是在根除细菌的宿主防御晚期阶段不发挥作用。实施例4 :IL_19、IL-20、和IL-24不是宿主针对细菌感染的防御必需的在人上皮角质形成细胞中，其它IL-10家族细胞因子(IL-19、IL_20、和IL-24)都 诱导与IL-22所诱导的相似的生物学功能(S. M. Sa等，J Immunol 178，2229 (February 15， 2007))。在啮齿类柠檬酸杆菌感染期间，IL-19、IL-20、和IL-24在野生型小鼠中都上调(图 6)。因此，它们在啮齿类柠檬酸杆菌感染期间可能发挥与IL-22相似的作用。IL-19经由 IL-20Ra和IL-2OR0链发信号。IL-20和IL-24能经由两对不同受体(IL-20Rα /IL-20Rβ 和 IL-22R/IL-20R3 )发信号(J. -C. RenauId, Nature Reviews Immunology 3，667 (2003))。 因此，IL-20Ri3是这三种细胞因子的共同受体链。在GI道中，IL-20Ra和IL_20Ri3链的 表达显著低于这些链在皮肤中的表达(图7)。为了精密地确定这三种细胞因子在啮齿类柠檬酸杆菌感染期间的作用，生成了 IL_20Ri3 +小鼠(图8)。这些小鼠展现正常发育，在所有主要淋巴样器官中具有与野生型 小鼠相比相似的淋巴细胞组成和发育(数据未显示)。来自这些小鼠的耳部皮肤在用重组 IL-20处理时未能上调SlOO家族蛋白质，指示体内IL-20信号传导缺陷(图8C)。像野生型小鼠一样，IL_20Ri3 +小鼠在啮齿类柠檬酸杆菌感染中存活(图2F)，证 明了 IL-19、IL-20、和IL-24不是宿主针对啮齿类柠檬酸杆菌的防御必需的。实施例5 JL-22缺陷在啮齿类柠檬酸杆菌感染早期阶段期间可损及上皮完整性本发明人检查了啮齿类柠檬酸杆菌感染期间IL-22的下游机制。在接种啮齿类 柠檬酸杆菌后8天，与对照小鼠相比，在第0天用抗IL-22单抗处理的IL-22+小鼠和野生 型小鼠都形成更加严重的血性腹泻和直肠脱垂发生率增加(数据未显示)。与对照小鼠相 比，来自IL-22+小鼠(数据未显示)或第0天用抗IL-22单抗处理的小鼠的结肠在接种 后10天增厚和缩短(图3A)，并且具有较小的盲肠。组织学分析进一步揭示缺少IL-22信 号传导的结肠中炎症增加(图3B)。在IL-22+和用IL-22单抗处理的小鼠中还都有显著
55的多灶性粘膜溃疡形成和多个透壁性炎症病灶(图3C和图9)。此外，IL-22+小鼠的肠系 膜淋巴结、脾、和肝中的细菌负荷与野生型小鼠的相比显著升高。有趣的是，野生型小鼠和 IL-22+小鼠的结肠中的细菌负荷差异可忽略不计(图3D)。与这些结果一致，也有系统性 细菌扩散的证据，特别是在IL-22+小鼠的肝中，那里伴有栓塞性微脓疡的多灶性肝细胞坏 死是明显的(图3E)。总之，这些数据指示在IL-22+小鼠中上皮完整性在啮齿类柠檬酸杆菌感染早期 阶段期间受损。实施例6 JL-22缺陷导致抗细菌IgG滴度降低先前的研究确立了抗啮齿类柠檬酸杆菌抗体在清除细菌中的必需作用。转移来自 感染后野生型小鼠的血清完全挽救CD4+小鼠免于在啮齿类柠檬酸杆菌攻击后死亡(10)。 在我们的研究中，IL-22缺陷小鼠自第8天前后开始变得垂死或死亡，此时野生型小鼠中还 没有完全形成抗体应答(图3F)。在第8天，抗啮齿类柠檬酸杆菌抗体滴度比野生型小鼠中 第16天的滴度低50倍。然而，当我们比较来自野生型和IL-22+小鼠的第8天抗啮齿类柠 檬酸杆菌抗体的滴度时，IL-22+小鼠中的抗啮齿类柠檬酸杆菌IgG滴度与野生型小鼠的 相比有出乎意料的显著降低(图3G)。相反，IL-22+小鼠中的总IgG、IgM、IgA或抗啮齿类 柠檬酸杆菌IgM和IgA滴度没有降低(图IOA和未显示的数据)。另外，IgG亚型分析揭示， 虽然接种后8天野生型或IL-22+小鼠中都没有抗啮齿类柠檬酸杆菌IgGl，但是IL-22+小 鼠中的其它抗啮齿类柠檬酸杆菌IgG亚型(包括IgG2a、IgG2b、IgG2c和IgG3)都显著降 低(图10B)。不太可能抗细菌特异性IgG的差异促成在此时间点自结肠清除啮齿类柠檬酸 杆菌，尤其是因为IgG不是靶向结肠粘膜腔的，而且野生型和IL-22+小鼠中的结肠细菌负 荷是相似的(图3D)。可能循环中的抗啮齿类柠檬酸杆菌IgG在控制啮齿类柠檬酸杆菌穿 透经过肠上皮屏障，及阻止系统性扩散中可能是重要的，因为最近的一项研究证明循环中 的IgG(而非分泌性IgA或IgM)是啮齿类柠檬酸杆菌系统性清除所需要的(C. Maaser等， Infect. Immun. 72，3315 (June 1，2004))。不清楚IL-22缺陷如何导致抗细菌IgG滴度降低。 不太可能IL-22直接作用于B细胞，因为在B细胞上检测不到IL-22R表达(S. Lecart等， Int. Immunol. 14，1351 (November 1,2002)) 但是，抗啮齿类柠檬酸杆菌IgG降低可能是促 成IL-22+小鼠中啮齿类柠檬酸杆菌感染期间宿主防御应答缺陷的因素之一。实施例7 JL-22是在细菌感染期间自结肠上皮细胞诱导抗微生物凝集素(诸如 RegIIIP和RegIII γ)不可缺少的根据微阵列分析，离体用IL-22处理来自未感染野生型小鼠的结肠组织上调许多 抗微生物蛋白质，包括S100A8、S100A9、RegIIH RegIII γ、触珠蛋白、SAA3、和乳运铁蛋 白(图4Α、19、和20)。对这些蛋白质的诱导得到了实时RT-PCR的证实(图4Β和未显示的 数据)。然而，在啮齿类柠檬酸杆菌感染期间，只有S100A8、S100A9、RegIIIi3和RegIII γ 在IL-22+小鼠中与野生型小鼠相比差异表达(图4C)。所有其它基因或是没被诱导或是 在野生型与IL-22+小鼠的结肠中没有差异(数据未显示)。在第4天和第6天，S100A8 和S100A9 二者在IL-22+小鼠的结肠中的表达比在野生型结肠中的略高，提示这些蛋白 质的差异表达很可能不负责在啮齿类柠檬酸杆菌感染期间在IL-22+小鼠中观察到的死 亡率升高。在野生型和IL-22+小鼠之间在防卫素(即在受感染上皮的宿主防御中重要 的蛋白质)(T.Ganz，Science 286，420 (October 15,1999))的表达中没有发现差异(数据
56未显示)。有趣的是，在野生型小鼠中观察到的RegIII β和RegIII γ上调在IL-22+小 鼠中在接种啮齿类柠檬酸杆菌后被完全消除(图4C)，指示这两种蛋白质在控制啮齿类柠 檬酸杆菌感染中具有潜在功能。RegIIIii和RegIII Y都属于分泌性C型凝集素蛋白质 家族(H. L. Cash, C. V. ffhitham, L. V. Hooper, Protein Expression and Purification 48, 151(2006))。RegIIIii和RegIII γ表达水平在小鼠中应答细菌建群以及在其它炎性刺 激后显著升高(S. A. Keilbaugh 等，Gut 54,623 (May 1,2005) ；H. Ogawa 等，Inflammatory Bowel Diseases 9,162(2003) ；H.0gawa,K.Fukushima,I. Sasaki,S. Matsuno,Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 279, G492 (Sep,2000)) RegIIIii或RegIII γ可阻止啮齿类柠檬酸杆菌深深地侵入结肠隐窝中，因为我 们在来自IL-22+与野生型小鼠结肠的细菌负荷中没有看到差异(图3D)。或者，RegIIIii 或RegIII Y蛋白质可起自分泌生长因子的作用，在肠炎症的背景中在上皮修复和/或 保护中发挥作用(H. Ogawa 等，Inflammatory BowelDiseases 9，162 (2003) ；S. L. Pull, J. Μ. Doherty, J. C. Mills, J. I. Gordon, T. S. Stappenbeck, PNAS 102,99 (January 4,2005)； V. Moucadel 等，Eur J Cell Biol80，156 (Feb，2001))。实施例8 适应性免疫不是由IL-22介导的针对啮齿类柠檬酸杆菌感染的早期宿 主防御必需的上述数据提示IL-22在先天性免疫和适应性免疫二者中的作用。因此，我们使用 重组活化基因2缺陷(Rag2+)小鼠来精密检查IL-22在啮齿类柠檬酸杆菌感染期间在先 天性与适应性免疫中的功能。由于缺少B和T细胞，及因此没有能力发起抗啮齿类柠檬酸 杆菌抗体应答，Rag2+小鼠逐渐减轻体重并最终在第30天前后变得垂死或死亡(图13A)。 与pl9+或IL-22+小鼠不同，Rag2+小鼠无一在感染的头两周里减轻超过10%它们的体 重或死亡。此外，用抗IL-22单抗处理的Rag2+小鼠减轻体重非常迅速(图13A)，与用抗 IL-22单抗处理的WT小鼠相似(图2E)。所有用抗IL-22单抗处理的Rag2+小鼠在第10 天前后变得垂死或死亡(图13)。这些数据提示IL-22途径在Rag2+小鼠中仍有活性，而且 IL-22是在啮齿类柠檬酸杆菌感染早期阶段在没有适应性免疫的情况中保护小鼠免于死亡 所必需的。这些数据还指示抗啮齿类柠檬酸杆菌IgG滴度降低是在啮齿类柠檬酸杆菌感染 后在IL-22+小鼠中观察到的发病和死亡的不充分起因，因为Rag2+小鼠中缺少抗体生成 单独不引起感染后快速体重减轻和早期死亡。在啮齿类柠檬酸杆菌感染后，Rag2+小鼠中的IL-22生成与WT小鼠的相当(图 13B)。相反，Rag2+小鼠中的IL-17A诱导显著降低(图13B和C)。因此，在此模型中，T细 胞和B细胞不是IL-22的来源。用抗IL-22单抗进行的免疫组织化学染色(图15)在受到 啮齿类柠檬酸杆菌感染的WT小鼠的结肠中检测到IL-22阳性细胞，但是未感染结肠或来自 受感染IL-22+小鼠的结肠没有检测到。在Rag2+小鼠的结肠中，IL-22阳性细胞主要与 ⑶Ilc+细胞簇共定位(图13D)，但是不与F4/80、Gr_l、或DX5阳性细胞共定位(数据未显 示)。另外，在体外，IL-23直接自⑶Ilc+ DC诱导IL-22生成(图13E)。总之，我们的数据 证明DC是啮齿类柠檬酸杆菌感染期间IL-22生成的主要来源之一，而且IL-23能直接促进 DC 生成 IL-22。实施例9 =RegIII在细菌感染期间发挥重要作用有趣的是，在接种啮齿类柠檬酸杆菌后，在野生型小鼠中观察到的RegIIIii和
57RegIIIy上调在IL-22+小鼠中(图4C)以及在pl9+小鼠中(图16)被完全消除。 RegIIIii和RegIII γ属于分泌性C型凝集素蛋白质家族。我们发现其它家族成员(包括 Regl、RegII, RegIII α、和RegIII δ (图17)，但是不包括RegIV(数据未显示))在受到啮 齿类柠檬酸杆菌感染的结肠中也上调，而且它们的诱导在IL-22+小鼠中被完全消除。外 源小鼠RegIII Y融合蛋白(rmReglllY)显著保护IL-22+小鼠免于由啮齿类柠檬酸杆菌 感染诱导的体重减轻，而且大约50%用rmRegIII γ融合蛋白处理的动物在感染中存活，而 100%用对照处理的IL-22+小鼠变得垂死或死亡(图14Α)。这些数据支持Reg家族蛋白 质(诸如RegIII Y)介导IL-22下游在控制啮齿类柠檬酸杆菌感染中的必需功能的假设。最后，IL-23/IL-22/Reg轴的存在在人类系统中也得到确认。人IL-23诱导人DC 生成hIL-22 (图14B)。原代人结肠上皮细胞(图12B)和人结肠上皮细胞系HT29和HCT15 表达IL-22R(图14C)。在体外，原代人结肠上皮细胞生长缓慢，而且在扩增期间逐渐丧失它 们的IL-22R表达(数据未显示)。因此，我们使用结肠上皮细胞系来测试它们对人IL-22 的应答。11^-22在这些结肠上皮细胞系中诱导31413活化(图140)，而且1 叩1113和 RegIII Y都被IL-22显著诱导(图14E)。重要的是，人RegIII γ融合蛋白(rhRegIII γ) (像rmRegIII γ融合蛋白)还将啮齿类柠檬酸杆菌感染后IL-22+小鼠的死亡率降低至 40%,比较而言用对照处理的IL-22+小鼠中的死亡率是100% (图18)。总之，我们的数 据暗示IL-22途径可能在人GI道中控制细菌感染(特别是A/E细菌感染)中发挥必需作 用。概述本发明人在此证明IL-22在针对粘附和抹消(A/E)细菌病原体的早期宿主防御中 发挥不可缺少的作用。本文中的数据指示IL-22以两种机制保护肠上皮屏障的完整性并阻止细菌侵入 及系统性扩散。第一，IL-22涉及引发早期抗细菌IgG应答。第二，IL-22是细菌感染期间 自结肠上皮细胞诱导抗微生物凝集素(诸如RegIIIii和RegIIlY)不可缺少的。这两种 机制任一或二者的缺失可促成IL-22+小鼠中啮齿类柠檬酸杆菌感染期间宿主防御应答受 损及系统性扩散和死亡率升高。虽然适应性免疫应答是清除这些病原体必需的(L. Bry, M. B. Brenner, JImmunol 172,433 (January 1，2004))，但是感染早期阶段期间由免疫细胞生成的细胞因子(诸如 IL-22)也是肠上皮细胞引发完全抗微生物应答和伤口愈合应答以阻止病原性细菌系统性 侵入宿主中必需的。如本文中所显示的，RegIIIii和RegIII γ诱导也指示IL-22在控制 各种细菌感染中可具有更宽的功能。所述数据进一步支持Thl7细胞及其效应器细胞因子 在传染病和自身免疫病中的作用。最后，本研究指示IL-22及其下游产物(诸如RegIII β 和RegIII Y)对于治疗某些传染病可能是有益的。材料和方法小鼠C57B1/6、IL_12p40+、和 IL-6+ 小鼠购自 Jackson Laboratory IL-22+ 小鼠和 IL-12pl9+是如之前所述生成的(11，图5)。IL-17RC+和IL_20R3 +小鼠是由Lexicon Pharmaceuticals (The Woodlands, TX)通过使用所描述的策略生成的(图5和图8)。简言 之，使用所描绘的寻靶载体通过标准同源重组生成敲除小鼠。将寻靶载体电穿孔入129品系ES细胞中，并鉴定被靶定的克隆。将靶定克隆显微注射入宿主胚泡中以生成嵌合体。使 嵌合体与C57B1/6动物繁殖以生成Fl杂合子。使杂合子杂交以生成F2野生型、杂合子和 纯合子组。使用三种引物的集合经PCR通过尾部DNA对这些研究中所使用的小鼠进行基因 分型。用于IL-2OR0 +小鼠野生型等位基因扩增的引物是5，-GTG GAA GCTACT TGA TGA GTA GGG-3，(pi)和 5，-AGA TGC GAA AAT GGA GAT TAAAAG-3，(p2)，其产生 595bp 产物。 用于ILjORP +小鼠突变型等位基因扩增的引物是5’ -CTA CCC GTG ATA TTG CTG AAG AG-3，(p3)和p2，其产生351bp产物。用于IL-17RC+小鼠野生型等位基因扩增的引物是 5，-GAG CCT GAAGAA GCT GGA AA-3， (P3)和 5，-CAA GTG TTG GCA GAG ATG GA-3， (P2)，其 产生534bp产物。用于IL-17RC+小鼠突变型等位基因扩增的引物是5’-TCGCCT TCT TGA CGA GTT CT-3，(Pl)和 P2，其产生 404bp 产物。细菌菌株和小鼠感染将6-8周龄小鼠禁食8小时之后口服接种2xl09个啮齿类柠檬酸杆菌菌株 DBS100 (ATCC 51459 ；American Type Culture Collection)，总体积 200 μ 1 每只小鼠。禁 食时，动物可获得水。接种和所有后续操作在BL-2生物安全橱中进行。接种后容许动物获 得食物。通过在LB肉汤中在摇动中于37°C温育过夜来制备细菌。通过测量0D600吸光度 来评估细菌的相对浓度，并将每份接种培养物连续稀释和涂板以证实所施用的CFU。 组织收集、组织学和CFU计数如所描述的接种对照或受感染小鼠。在无菌条件下取出全血、脾、肝、肠系膜淋巴 结、和结肠样品。将结肠解剖至肛管，并将末端0. 5cm段用于CFU分析。在10%中性缓冲的 福尔马林中固定近端区段。将切片用H&E染色以评估组织病理学。将脾、肝、肠系膜淋巴结、 和结肠称重并勻浆。将勻浆物连续稀释并一式三份涂板至MacConkey琼脂(Remel)。以粉 红色菌落来鉴定啮齿类柠檬酸杆菌菌落。于37°C温育24小时后对菌落计数以测定IoglO CFU每克组织。RNA分离和实时RT-PCR通过RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)依照制造商的指令分离细胞和组织RNA。使用 TaqMan—步RT-PCR大师级混合试剂(Applied Biosystems)用引物和探针在ABI 7500实 时PCR系统(Applied Biosystems)上进行实时RT-PCR。引物和探针的序列如下mIL-22， 正向，5，-TCC GAG GAG TCA GTG CTAAA-3，，反向，5，-AGA ACG TCT TCC AGG GTG AA-3，，和 探针，5，-TGA GCACCT GCT TCA TCA GGT AGC A_3，(FAM, TAMRA) ；mIL_17A，正向，5，-GCTCCA GAA GGC CCT CAG A-3，，反向，5，-CTT TCC CTC CGC ATT GACA-3，，和探针，5，-ACC TCA ACC GTT CCA CGT CAC-3，(FAM, TAMRA)；小鼠核糖体持家基因 RPL-19，正向，5，-GCA TCC TCA TGG AGC ACA T-3，，反向，5，-CTG GTC AGC CAG GAG CTT-3，，和探针，5，-CTT GCG GGC CTTGTC TGC CTT-3，(FAM, TAMRA) ；mIL-19，正向，5，-AGC CTG GAT TGACAG GAA TC-3，，反 向，5，-GAT AAT CAG ACG AGG CGT TTC-3，，和探针，5，_TCT GGA AAC TCC TGC AGC CTG ACA C-3，(FAM, TAMRA) ；mIL-20，正向，5，-TTT GGG AGA ACT AGG CAT TCT T-3，，反向，5，-TCT TGG ACAGGA GTG TTC TCA-3，，和探针，5，-CAG CCT CTC CAC TTT CAT CTA TAGCAT CTC C-3，(FAM, TAMRA) ；mIL-24，正向，5，-GCT CTC CAT GCC ATTTCA A-3，，反向，5，-TGG CCA AGG GTC TGA AGT-3，，和探针，5，-TGT ACATCC CTG CTG TCC TCA AGG C_3，(FAM，TAMRA)； mIL-6，正向，5，-TCCAAT GCT CTC CTA ACA GAT AAG-3，，反向，5，_CM GAT GAA TTG GATGGTCTT G-3，，和探针，5，-TCC TTA GCC ACT CCT TCT GTG ACT CCA-3，(FAM, TAMRA) ；mS100A8, 正向，5，-TGT CCT CAG TTT GTG CAG AATATA AA-3，，反向，5，-TCA CCA TCG CAA GGA ACT CC-3，，和探针，5，-CGAAAA CTT GTT CAG AGA ATT GGA CAT CAA TAG TGA-3，(FAM, TAMRA)； mS100A9，正向，5，-GGT GGA AGC ACA GTT GGC A_3，，反向，5，-GTG TCC AGG TCC TCC ATG ATG-3，，和探针，5，-TGA AGA MG AGAAGA GAA ATG AAG CCC TCA TAA ATG-3，(FAM, TAMRA)； mRegIII γ，正向，5，-ATG GCT CCT ATT GCT ATG CC-3，，反向，5，-GAT GTC CTG AGGGCC TCT T-3，，和探针，5，-TGG CAG GCC ATA TCT GCA TCA TAC C_3，(FAM, TAMRA) ；mPAP/HIP/ RegIII β，正向，5，-ATG GCT CCT ACT GCT ATGCC-3，，反向，5，-GTG TCC TCC AGG CCT CTT T-3，，和探针，5，-TGA TGCAGA ACT GGC CTG CCA-3' (FAM, TAMRA) ；mIL_12p40，正向，5，-ACA TCTACC GAA GTC CAA TGC A-3，，反向，5，-GGA ATT GTA ATA GCG ATC CTGAGC-3，，和探针， 5，-TGC ACG CAG ACA TTC CCG CCT-3，(FAM，TAMRA) ；mIL_23pl9，正向，5，_GGT GGC TCA GGG AAA TGT-3，，反向，5，-GAC AGAGCA GGC AGG TAC AG-3，，和探针，5，-CAG ATG CAC AGT ACT CCA GACAGC AGC-3，(FAM, TAMRA) ；mIL_20R3，正向，5，-CAG GTG CTT CCA GTCCGT CT-3，， 反向，5，-CTC TCC TGG AAT CCC CAA AGT-3，，和探针，5，-CAGCAC AGA TGC CAA CGG CCT CAT-3，(FAM，TAMRA) ；mIL_20Ra，正向，5，_CTG GCC GCT TCG GGA CGC-3，，反向，5，_AAC CAC AGA AGA CACAAG GAA CTG-3，，和探针，5，-TCT GCT GCT GGC CGC TTC GG-3，(FAM，TAMRA)； mIL-22R，正向，5，-GCT GGA CTC CCT TGT GTG T-3，，反向，5，-CAC ATG GCC TCA GTC TCA A-3，，和探针，5，-CGC GGG ACC CTC ATCCTT TG-3，(FAM, TAMRA) ；mIL-10R^，正向，5，-TCC ACA GCA CCT GAAGGA GTT-3，，反向，5，_GGA GGG AAG GAG MC AGC AGA-3，，和探针，5，_TGG GCC ACC CCC ATC ACA GC-3’ (FAM, TAMRA) 一式两份运行反应，并将样品相对于对照持家 基因RPL-19标准化及依照Δ Δ Ct法报告Δ Δ Ct = Δ Ct样品-Δ Ct参照。Ig ELISA如先前所述对来自所收集全血的血清实施分析(10)。简言之，用加热杀死的啮 齿类柠檬酸杆菌或在PBS中1/1000稀释的山羊抗小鼠Ig捕捉抗体(SouthernBiotech) 包被ELISA板(Nunc)。将经过包被的板在PBS加0. 05% Tween20中清洗，用300 μ 1封闭 缓冲液(PBS+0. 5% BSA+10PPM Proclin)封闭1小时，并清洗，之后添加连续稀释的标准 品(小鼠单克隆 IgA、IgG, IgG3、和 IgM(SouthernBiotech) ；IgGU IgG2a、和 IgG2b 同种型 (Sigma-Aldrich)；小鼠IgG2c (Bethyl Laboratories))或未知物。将样品于室温温育4小 时。将板清洗五次，并用在测定缓冲液(PBS+0. 5% BSA+0. 05% Tween 20+10PPMProclin,pH 7.4)中1/4，000稀释的偶联有辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗小鼠IgA, IgM, IgG, IgGU IgG2a、IgG2b、IgG2c、和IgG3 (SouthernBiotech)检测Ig同种型，于室温温育1小时。清洗 后，向每个孔添加TMB过氧化物酶底物，并容许显色15分钟，然后向每个孔添加终止液(1M 磷酸)。在 MolecularDevices (Sunnyvale, CA)读板仪中于 450nm 读取吸光度，0D45(1。体外结肠培养自C57B1/6小鼠取出结肠。用冷的PBS清洁后，纵向切开结肠。将结肠放置 在装有IOml HBSS (Mediatech)缓冲液的IOOmm培养皿中，该缓冲液含有2. 5 μ g/ml Fungizone-两性霉素B、10 μ g/ml庆大霉素、100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素(都 来自GIBC0，Invitrogen) 0在培养皿边缘温和地刮结肠以清除粘液，并转移至装有新鲜 HBSS缓冲液的新培养皿。将结肠切成l-2mm段并在含有10 %热灭活的FCS (HyClone)、2. 5 μ g/ml Fungizone-两性霉素B、10 μ g/ml庆大霉素、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素 和100 μ g/ml链霉素的RPMI缓冲液中以50mg结肠/lml/孔转移至24孔板。将10 μ g/ml IL-22 (R&Dsystems)添加至培养物并于37°C温育24小时。微阵列分析分别使用ND-1000分光光度计(Nanodrop Technologies)和生物分析仪 2100 (Agilent Technologies)测定总RNA样品的数量和质量。用于制备Cy染料标记的cRNA 和阵列杂交的方法由Agilent Technologies提供。简言之，使用Agilent的低RNA输入荧 光线性扩增试剂盒，将总RNA样品转变成双链cDNA，然后转变成Cy染料标记的cRNA。使用 RNeasy迷你试剂盒(Qiagen)纯化经过标记的cRNA。使用ND-1000分光光度计测定cRNA产 量和Cy染料掺入。将750ng经过标记的cRNA片段化，并如制造商的原位杂交试剂盒+所 述杂交至Agilent的全小鼠基因组阵列。将所有样品用Cy5标记，并针对Cy3标记的通用 小鼠参照(Stratagene)杂交。杂交后，将阵列清洗，干燥并在Agilent的DNA微阵列扫描 仪上扫描。使用Agilent的特征提取软件8. 5来分析所获得的阵列图像。为了微阵列数据 聚类(图20)，通过标准方法将表达数据加工成Agilent对数-比数据。通过根据Pearson 相关系数有最高联系的矢量的迭代凝聚对选定基因聚类，其中凝聚矢量的数据通过平均联 系来汇总。(Selectedgenes were clustered by iterative agglomeration of vectors most highly linked byPearson correlation coefficient，with data for agglomerated vectors summarizedby average linkage.)体外小鼠尾尖成纤维细胞培养和刺激为了建立尾尖成纤维细胞(TTF)，将来自IL-17RC+成年小鼠和野生型同窝小鼠 的尾巴剥皮，切成Icm段，放置在培养皿上，并在高葡萄糖DMEM(含有10% FCS、2nm谷氨酰 胺、100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素)中温育5天。将迁移出移植物段的细胞转移至新 板(第2传代)并在相同培养基中维持。我们使用第3传代的TTF进行刺激实验。将TTF 以1.2x10s每孔的密度接种入24孔板。接种后24小时，将重组鼠IL-17A和IL-17F_ Systems)以各种浓度添加至培养物。添加细胞因子后24小时收获细胞培养物上清液，并 使用小鼠IL-6 ELISA套组(BD Biosciences)遵循制造商的指令通过酶联免疫吸附测定法 (ELISA)测量鼠IL-6水平。体内鼠IL-22阻断在啮齿类柠檬酸杆菌感染之前(第0天)或之后8天(第8天)以150 μ g/小鼠 的剂量隔天腹膜内注射阻断性抗小鼠IL-22(克隆8E11，同种型小鼠IgGl)单抗(11)。某 对照组还接受同种型对照IgGl单抗。统计学使用Prism软件(GraphPad)通过单路或双路ANOVA来计算统计学显著性。所有 (0. 05的ρ值认为是显著的，且在正文中指出。除非另有说明，呈现了数据的所有研究是 至少两项独立实验的代表。虽然为了清楚理解的目的已经通过说明和实施例较为详细地描述了上述发明，但 是说明和实施例不应解释为限制本发明的范围。通过述及明确地完整收录本文中所引用的 所有专利和科学文献的公开内容。实施例10 啮齿类柠檬酸杆菌感染期间LT途径是由IL-22介导的
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为了帮助确定IL-22对于由LT阻断引起的死亡是否是重要的，我们实施了挽救实 验，其中我们在小鼠中在LTbR-Fc处理的同时表达IL-22。我们用于表达IL-22的方法是 水动力学尾静脉投递编码小鼠IL-22的质粒DNA。人LTbR-Ig如下构建将涵盖细胞外结 构域的人LTbR (第1位至第224位；SEQ IDNO 57)克隆入改良pRK5表达载体中，该载体在 LTbR序列下游编码人IgGl Fc区(SEQ ID NO :58)。在CHO细胞中过表达蛋白质，并通过蛋 白A亲和层析来纯化。鼠LTbR. Ig如下构建将涵盖细胞外结构域的鼠LTbR(第1位至第 222位；SEQ ID NO 59)克隆入改良pRK5表达载体中，该载体在LTbR序列下游编码鼠IgG2a Fc 区(SEQ ID NO 60)。在图21中，我们发现LTbR-Fc生成与IL-22阻断相似的体重减轻曲线(图21右 边小图)和死亡曲线(图21左边小图)，这使得我们检查LT和IL-22之间的关系。啮齿类 柠檬酸杆菌感染导致结肠中IL-22的早期表达。图21显示了接种啮齿类柠檬酸杆菌的小鼠的百分比存活。将6-8周龄Balb/c小 鼠禁食8小时之后口服接种2xl09个啮齿类柠檬酸杆菌菌株DBS100 (ATCC 51459 ；American Type Culture Collection)，总体积200 μ 1每只小鼠。禁食时，动物可获得水。接种和所 有后续操作在BL-2生物安全橱中进行。接种后容许动物获得食物。通过在LB肉汤中在摇 动中于37°C温育过夜来制备细菌。通过测量0D600吸光度来评估细菌的相对浓度，并将每 份接种培养物连续稀释和涂板以证实所施用的CFU。在接种那天，还给小鼠注射150ug抗 gpl20单抗、抗IL-22 8E11单抗、或LTbR-Fc，每周3次。LT途径调节对IL-22生成重要的多个上游方面。图22提供了啮齿类柠檬酸杆菌 感染后LT途径的数据。A、C、E。在啮齿类柠檬酸杆菌感染后的不同时间点收获结肠。隔天 给小鼠注射150ug抗gpl20或LTbR-Fc。使用QiagenRNeasy试剂盒提取RNA。实施Taqman 分析以测定IL-22、RegIIg、p 19、或p40相对于第0天时间点的表达。B。在感染后第4天， 收集结肠。用冷的PBS清洁后，纵向切开结肠。将结肠放置在装有IOml HBSS(Mediatech) 缓冲液的IOOmm培养皿中，该缓冲液含有2. 5 μ g/ml Fungizone-两性霉素B、10 μ g/ml庆 大霉素、100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素(都来自GIBC0，Invitrogen)。在培养皿边缘 温和地刮结肠以清除粘液，并转移至装有新鲜HBSS缓冲液的新培养皿。将结肠切成l_2mm 段并在含有 10%热灭活的 FCS (HyClone)、2· 5 μ g/ml Fungizone-两性霉素 B、10 μ g/ml 庆 大霉素、2mM L-谷氨酰胺、100U/ml青霉素和100 μ g/ml链霉素的RPMI缓冲液中以50mg结 肠/lml/孔转移至24孔板。将lOng/ml rmIL-22 (R&D systems)添加至培养物并于37°C 温育24小时。收集上清液，用于IL-22 ELISA。D。第6天结肠固有层细胞。通过⑶Ilc+ 和MHC 11+确定的DC。收获结肠，并用不含钙和镁的HBSS(Invitrogen)及2% FBS和IOmM HEPES冲洗。纵向切开结肠，然后切成2-4cm段，并将各段转移至装有不含钙和镁的HBSS、 2% FBSUmM EDTAUOmM HEPESjPlmM DTT(Sigma-Aldrich)的 IOcm 皿。在以 200rpm 摇 动中于37°C温育45分钟后收集并丢弃IEL级分。为了分离LPMC，剥去剩余上皮层，并将 结肠段切成方块并放置在含有10% FCS、20mM HEPES、和0. 5mg/ml胶原酶/分散酶(Roche Diagnostics)的RPMI中。将结肠段在摇动中于37°C温育1小时。将分离的上皮细胞清洗 并用于FACS分析。在图22中，我们发现LTbR-Fc阻断IL-22诱导以及RegIIIg，已经显示了 IL-22诱 导RegIIIg(图22A-C)。先前显示了树突细胞生成IL-22，而且我们发现感染后6天结肠固有层中的DC数目轻微减少(图22D)。由LTbR-Fc引起的IL-22减少最有可能是由于IL-23 丧失，因为P19和p40 二者表达在感染期间在LTbR-Fc处理后都受到抑制(图22E)。IL-22部分挽救在用LTbR处理的小鼠中看到的缺陷。图23提供关于IL-22对 用LTbR处理的小鼠的影响的数据。A。尾静脉注射IL-22质粒后血清中IL-22和结肠中 RegIIIg的表达测试。B。用IL-22质粒挽救LTbRFc效果。在第-1天，对动物称重和分组，对额外的小鼠处以安乐死。称重后，所有动物禁食 14小时。次日上午(第0天)，所有小鼠口服接种200ul PBS中的2-4X10e9CFU啮齿类柠 檬酸杆菌。自接种细菌的同一天开始，持续两周，每周三次i. P.注射200ul PBS中的150ug 对照单抗或Fc融合蛋白。接种后调查人员放回食物。6小时后，通过尾静脉注射质粒DNA。 尾静脉注射实验1)将DNA构建物(pRK载体或pRK-mIL-22)在Ringer氏溶液中稀释至 某浓度以产生最终剂量10微克/小鼠/注射。2)给每只小鼠在尾静脉中静脉内注射大约 1. 6ml在Ringer氏溶液中含有DNA的溶液。3)为了最大DNA摄取，在4-5秒(最多8秒) 时间里以静脉内推注(尾静脉)来施用剂量。小鼠在不麻醉的情况中限制在圆锥形丙烯酸 限制器中，带有加热元件以提高体温和扩张血管。4)为每只动物使用一次性使用的无菌注 射器。继续监测动物直至它们达到临床正常。5)在服药后对动物观察任何不利临床体征至 少20分钟。如果动物在服药后1小时里没有达到临床正常，对它们处以安乐死或监测它们 直至它们达到临床正常。对垂死的动物处以安乐死。所有操作在BL-2生物安全橱中实施。 感染期间，对垂死的动物或那些显示未得到缓解的痛苦或直肠脱垂的处以安乐死。每天监测小鼠持续4周。在第5天至第17天之间，当用LTbR-Fc处理的小鼠可能 变得垂死时，每天两次监测小鼠，包括周末。每周收集粪粒以测量啮齿类柠檬酸杆菌的CFU。 研究期间每周一次对小鼠称重。若小鼠展现体重减轻15%或更多，则每天对它们称重。若 体重减轻超过20%，则对小鼠处以安乐死。研究结束时，对所有小鼠处以安乐死，并收集脾 和结肠，用于组织学、RNA或FACS分析。如图23A所示，自注射后2小时开始，我们能在小鼠血清中检测到IL-22表达，而 且表达在72小时时下降。我们还能检测到结肠中的RegIIIg表达，提示当以这种方式表达 时，活性IL-22能作用于结肠。IL-22能部分挽救感染期间由LTb-Fc处理诱导的死亡和体 重减轻(图23B)。用IL-22单抗(8E11)处理小鼠。图24显示的数据证明用IL-22单抗8E11进行 处理导致结肠滤泡减少(reduced)、B/T细胞组构(organization)受损、及结肠中DC、T细 胞、和B细胞数目减少。A。感染后6天，收获并纵向切开结肠。在不含钙和镁的HBSS、2% FBSUmM EDTAUOmM HEPES、和ImM DTT中温育30分钟后，温和地刮结肠以清除上皮细胞。 以白色、圆形物鉴定滤泡。每组5只小鼠，并且对每份结肠计数和绘图，作为找到的总滤泡 或找到的大于Imm的总滤泡。B。感染后6天，将结肠用冷的PBS冲洗并在OCT中快速冷冻。 切出6微米切片，干燥，然后在丙酮中固定。将切片用10%血清封闭，与抗CD5 FITC和抗 B220 APC各10ug/ml—起温育。在NIKON BX61显微镜上捕捉图像。C。感染后6天，如上 所述分离结肠固有层细胞。实施FAC分析以测定8E11处理后的树突细胞、CD3 T细胞、和B 细胞数目。如图24所示，感染后6天，我们用IL-22阻断性抗体或LTbR-Fc任一处理小鼠， 并对结肠中的淋巴样滤泡计数，以确定IL-22是否可能在结肠淋巴样结构的形成中具有作用。我们发现大于Imm的滤泡减少，提示IL-22和LT对于感染后滤泡尺寸增大可能是重要 的(图24A)。组织学分析显示阻断性IL-22破坏滤泡的T和B细胞区带，而LT阻断具有相 似的效果(图24B)。接着，我们确定IL-22阻断是否导致结肠固有层中细胞数目的变化。 我们发现IL-22阻断导致感染期间DC、T细胞、和B细胞数目减少。总之，IL-22表现出对 于淋巴样滤泡形成是重要的，而且可能是结肠中淋巴毒素途径的重要下游成分。DocCode-SCOREIFff内容的SCORE占位页申请号PCT/US08/82890文件日期11/07/2008此表格在IFW记录中的存在指明了在上文鉴定的日期以电子格式接收了下列文 件类型。此内容保存在SCORE数据库中。·设计图既然这是电子提交的，那么就没有物理人工文件夹，在PALM中没有记录人工文件 夹，而且不存在纸文件或物理媒体。IFW记录中的TIFF图像是自保存在SCORE中的原始文 件创建的。为了获取SCORE数据库中的文件，见SIRA制定的说明。在文件入口时(如上所述)·审查员可以经eDAN界面获取SCORE内容。·其它 USPTO 雇员能登记(bookmark)当前 SCORE URL (http://es/ ScoreAccessffeb/)。内容。
外部用户可以经公众和私人PAIR(Public and Private PAIR)界面获取SCORE 表格修正日期2006年2月8日
权利要求
一种通过调控受试者中的抗微生物免疫应答来治疗所述受试者中的微生物病原体感染的方法，包括对所述受试者施用有效量的抗微生物多肽(AMP)，其中所述AMP是IL 22。
2.一种通过调控受试者中的抗微生物免疫应答来治疗所述受试者中的微生物病原体 感染的方法，包括对所述受试者施用有效量的抗微生物多肽(AMP)或其调控剂，其中所述 AMP 选自下组IL-6、IL-18、IL-23、REGI α、REG I β、HIP/PAP、REG III、REG IV、Reg 相关 序列(RS)和LT。
3.—种调控受到微生物病原体感染的受试者的细胞中抗微生物多肽(AMP)的活性的 方法，包括使所述细胞接触分离的AMP，其中所述AMP是IL-22。
4.一种调控受到微生物病原体感染的受试者的细胞中抗微生物多肽(AMP)的活性的 方法，包括使所述细胞接触分离的AMP，其中所述AMP选自下组IL-6、IL-18、IL-23、REG I α , REG I β、HIP/PAP、REG III、REGIV、Reg 相关序列(RS)和 LT。
5.权利要求1的方法，其中所述感染是微生物病症。
6.权利要求5的方法，其中所述微生物病症是炎性肠病(IBD)。
7.权利要求5的方法，其中所述微生物病症是克罗恩氏或溃疡性结肠炎(UC)。
8.权利要求1的方法，其中所述微生物病原体是细菌。
9.权利要求8的方法，其中所述细菌是革兰氏阴性的。
10.权利要求8的方法，其中所述细菌是革兰氏阳性的。
11.权利要求8的方法，其中所述细菌是粘附或抹消(A/E)细菌。
12.权利要求11的方法，其中所述粘附或抹消(A/E)细菌是肠出血性大肠杆菌(EHEC) 和肠致病性大肠杆菌(EPEC)。
13.权利要求12的方法，其中所述肠致病性大肠杆菌(EHEC)是大肠杆菌0157:H7或大 肠杆菌055: H7。
14.权利要求2的方法，其中所述抗微生物多肽(AMP)是RegIIIβ和RegIII γ。
15.权利要求1的方法，其中所述微生物病原体是病毒。
16.一种通过调控受试者中的抗微生物免疫应答来治疗所述受试者中的微生物病原体 感染的方法，包括对所述受试者施用有效量的抗微生物多肽(AMP)调控剂，其中所述AMP调 控剂是IL-22激动剂。
17.权利要求16的方法，其中所述激动剂提高所述IL-22的表达和/或活性。
18.权利要求16的方法，其中所述激动剂是多肽或核酸分子。
19.权利要求16的方法，其中所述激动剂是融合多肽。
20.权利要求16的方法，其中所述激动剂是Fc融合多肽。
21.权利要求16的方法，其中所述激动剂是抗体或其生物学活性片段。
22.权利要求16的方法，其中所述激动剂是单克隆抗体。
23.权利要求16的方法，其中所述激动剂是人源化抗体。
24.权利要求1或3的方法，其中所述IL-22的氨基酸序列包含SEQID NO :8所示序列。
25.权利要求2或4的方法，其中所述AMP的氨基酸序列包含选自下组氨基酸序列的序 列SEQ ID N0:2、SEQ ID N0:4、SEQ ID N0:6、SEQ ID NO: 10、SEQ ID NO: 12、SEQ ID NO: 14、SEQ ID NO :16、SEQ ID NO :18、SEQ ID NO :20、SEQ ID NO :22、SEQ ID NO :24、SEQ IDNO :26、SEQID NO :50、禾口 SEQ ID NO :52。
26.权利要求1或3的方法，其中编码所述IL-22的核酸序列是SEQID NO 7所示序列。
27.权利要求1或3的方法，其中编码所述AMP的核酸序列包含选自下组核酸序列的序 列SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :9、SEQ ID NO :11、SEQ ID NO 13、SEQ ID NO :15、SEQ ID NO :17、SEQ ID NO :19、SEQ ID NO :21、SEQ ID NO :23、SEQ ID NO :25、SEQID NO :49、禾口 SEQ ID NO :51。
28.—种试剂盒，其包括用于治疗微生物病症的药物组合物，其中所述药物组合物包含 抗微生物多肽(AMP)，其中所述AMP是IL-22。
29.—种试剂盒，其包括一种或多种用于治疗微生物病症的药物组合物，其中所述药 物组合物每一种包含不同的抗微生物多肽(AMP)或其调控剂，且其中所述AMP选自下组 IL-6、IL-18、IL-23、REG I α、REG I β、HIP/PAP、REG III、REG IV、Reg 相关序列(RS)、和 LT。
全文摘要
本发明涉及用于通过调控宿主免疫应答来治疗微生物病症的组合物和方法。更具体地说，本发明涉及介导抗微生物免疫应答的组合物及使用此类组合物来治疗微生物感染的方法。
文档编号A61P31/00GK101951945SQ200880124173
公开日2011年1月19日 申请日期2008年11月7日 优先权日2007年11月7日
发明者亚历山大·R·阿巴斯, 佐拉·莫德鲁桑, 尼科·P·吉拉蒂, 帕特里夏·A·瓦尔德兹, 弗雷德里克·J·德索瓦格, 欧阳文军, 迪米特里·M·达尼兰科, 郑衍 申请人:健泰科生物技术公司