用于产生酸化的乳饮料的方法

专利名称：用于产生酸化的乳饮料的方法
技术领域：
本发明涉及使用具有转谷氨酰胺酶活性的酶产生酸化的乳饮料的方法。
背景技术：
酸化的乳饮料的市场在全球不断增长，所述酸化的乳饮料包括发酵的乳饮料和液 体酸乳酪(yoghurt)，并且人们有兴趣改进这种产品的质量和经济性。酸化的乳饮料通常通过下述方式产生将酸化的乳品与糖浆溶液混合，并对混合 物进行均质化处理。可通过加入化学物质如葡萄糖酸S-内酯(gluconodelta-lactone) (GDL)进行酸化，或者可以用乳酸细菌发酵乳品而引起酸化。然而，当保存这样的产品时，乳 品中的成分一酪蛋白经常沉淀或结合并聚集，因此饮料易于分相(separate)，使液体乳清 聚集在表面。这个常常称作脱水收缩(syneresis)的过程，降低了酸化的乳饮料的质量。果胶、淀粉、改性淀粉、CMC等常常用作酸化的乳饮料中的稳定剂，但是由于这些稳 定剂的成本相对较高，所以人们有兴趣发现其它而且可能甚至更好的溶液。现有技术中已知具有转谷氨酰胺酶活性的酶用于修饰食品蛋白质，包括乳品蛋白 质的用途。例如，JP2835940-B2描述了包含乳蛋白的酸性饮料的生产，并且显示包含溶解 的脱脂乳粉的乳饮料用转谷氨酰胺酶处理，然后进行化学酸化，在进行热灭菌后由于乳蛋 白沉淀较少而保持不透明的白色混浊。EP0671885描述了用于产生乳样产品的方法，其包 括转谷氨酰胺酶处理，然后酸化。在本文中，用转谷氨酰胺酶处理的乳样产物，其中酸化作 为生物发酵进行，显示出与半固体酸乳酪的稠度(consistency)。此外，与未处理的对照相 比，由用转谷氨酰胺酶处理的脱脂乳制备的复原酸乳酪具有更均一的稠度。已知在发酵乳产品产生过程中用转谷氨酰胺酶处理可增加产物的粘度。 W02007/060288证明在发酵乳产品如酸乳酪的产生过程中加入转谷氨酰胺酶可以降低乳底 物的蛋白质含量，从而仍然获得具有高粘度的酸乳酪。在产生发酵乳饮料的工业过程中，理想的是在进行发酵前浓缩乳底物，然后在生 产过程中后面的步骤稀释发酵乳底物，以获得具有理想的乳固体含量的乳饮料。发酵前的 浓缩和后面的稀释可降低对发酵罐容量(capacity)的要求，并因此降低生产成本。然而， 现有技术教导增加待发酵乳底物中的蛋白质含量将导致发酵产物的粘度更高(参见，例 如，W02007/060288)，并且用转谷氨酰胺酶处理将进一步增加粘度。本发明的一个目的是提供用于制造稳定的发酵乳饮料的方法，其中减少了保存时 的脱水收缩。另一个目的是提供从浓缩的乳底物产生稳定的发酵乳饮料的方法，所述饮料 是可饮用的，即自由流动液体。发明概述本发明的发明人令人惊讶地发现，通过用转谷氨酰胺酶处理待发酵的乳底物可产 生保存时显示非常小的脱水收缩的发酵乳饮料，所述转谷氨酰胺酶获得自链霉菌属的细菌。因此，在一个方面，本发明涉及用于产生酸化的乳饮料的方法，所述方法包括a)提供包含蛋白质的乳底物；b)用具有转谷氨酰胺酶活性的酶处理乳底物，所述具有转谷氨酰胺酶活性的酶获 得自属于链霉菌属的细菌；和c)用微生物发酵乳底物；其中b)步骤在步骤c)之前、期间或之后进行。本发明人还令人惊讶地发现，由具有高蛋白质含量的乳底物产生的发酵乳饮料可 以用转谷氨酰胺酶稳定，并仍然保持低粘度，这对于要作为饮料消费的产品是理想的。因此，在另一个方面，本发明涉及用于产生酸化的乳饮料的方法，所述方法包括a)提供具有高于5%的蛋白质含量的乳底物；b)用具有转谷氨酰胺酶活性的酶处理乳底物；和c)用微生物发酵乳底物；其中b)步骤在步骤c)之前、期间或之后进行。本发明人还令人惊讶地发现，通过降低待发酵乳底物中的溶氧水平并用转谷氨酰 胺酶处理所述底物，可以产生保存时显示非常小的脱水收缩的发酵乳饮料。因此，在第三方面，本发明涉及用于产生酸化的乳饮料的方法，所述方法包括a)提供包含蛋白质的乳底物；b)将乳底物的溶氧水平降至饱和水平的80%以下；c)用具有转谷氨酰胺酶活性的酶处理乳底物；和d)用微生物发酵乳底物；其中b)步骤在步骤c)之前或期间进行；并且其中步骤c)在步骤d)之前、期间或 之后进行。由本发明任一方法所产生的酸化乳饮料是可饮用的，即可作为饮料被消费。在优选的实施方案中，将发酵的乳底物与糖浆混合，并将混合物均质化，以获得酸 化的乳饮料。在另一个优选的实施方案中，将乳底物在发酵前进行巴氏灭菌，并且在巴氏灭菌 之前进行转谷氨酰胺酶处理。在另一个优选的实施方案中，在转谷氨酰胺酶处理之前将乳底物进行热处理。优 选地，这种热处理导致乳底物中乳清蛋白超过50%失活。发明详述酸化的乳饮料根据本发明，“酸化的乳饮料”包括基于酸化的乳底物的任何可饮用产品，由此包 括发酵乳饮料和液体酸乳酪饮料。在本发明的方法中，酸化作为用微生物发酵进行。根据本发明，酸化的乳饮料是可饮用的是指它们为液体形式，并且作为饮料被消 费，即它们适合于饮用而不是用匙食用。“液体形式”指产品为物质的流体状态，因此表现出 易于流动的特性。因此，液体的形状通常由装液体的容器确定，与例如凝胶样物质相反，后 者是软的，但是不能自由流动，如酸奶或布丁。根据本发明的酸化乳饮料可具有允许消费者 在需要时使用吸管饮用所述产品的粘度。
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在优选的方面，根据本发明酸化的乳饮料具有的粘度可以由10ml移液管的释放 时间测定，其基本上与未用转谷氨酰胺酶产生的酸化的乳饮料的释放时间相同。在本上下 文中，基本上相同的释放时间表示增加少于20%，优选增加少于15%，并且更优选增加少 于 10%。根据本发明的酸化的乳饮料具有的pH可以小于4. 6，优选小于4. 4，更优选小于 4. 2，并且甚至更优选约pH 4或者更低。在一个方面，酸化的乳饮料具有的pH小于3. 8，如 小于3. 6。根据本发明的酸化的乳饮料具有的脂肪含量可以为0至2%，优选1. 5%以下， 以下或0.5%以下，更优选约0. 或更低。酸化的乳饮料具有的非脂乳固体含量小于
20 %，优选小于8. 5 %，小于8 %，小于7. 5 %，小于7 %，小于6. 5 %或小于6 %，并且更优选 约5%。根据本发明的酸化的乳饮料具有的蛋白质含量可为0.5-4%。在一个优选的方面， 酸化的乳饮料具有的蛋白质含量为1 %以下。在另一个优选的方面，酸化的乳饮料具有的蛋 白质含量为2% -3%。根据本发明的酸化的乳饮料具有的保存期可长于7天，优选长于14天，更优选长 于28天，如长于3个月。根据本发明的酸化的乳饮料具有增加的稳定性。可以在将酸化的乳饮料保存适当 天数后，通过测量因为脱水收缩而聚集在表面的乳清的高度而确定稳定性。也可以在加速 脱水收缩后确定稳定性，如通过离心进行。产生酸化的乳饮料的方法如上所述，用于产生根据本发明的酸化的乳饮料的方法包括a)提供包含蛋白质的乳底物；b)用具有转谷氨酰胺酶活性的酶处理乳底物，所述具有转谷氨酰胺酶活性的酶获 得自属于链霉菌属的细菌；和c)用微生物发酵乳底物；其中b)步骤在步骤c)之前、期间或之后进行。在另一个方面，根据本发明用于产生酸化的乳饮料的方法包括a)提供具有高于5%的蛋白质含量的乳底物；b)用具有转谷氨酰胺酶活性的酶处理乳底物；和c)用微生物发酵乳底物；其中b)步骤在步骤c)之前、期间或之后进行。在第三方面，根据本发明用于产生酸化的乳饮料的方法包括a)提供包含蛋白质的乳底物；b)将乳底物的溶氧水平降至饱和水平的80%以下；c)用具有转谷氨酰胺酶活性的酶处理乳底物；和d)用微生物发酵乳底物；其中b)步骤在步骤c)之前或期间进行；并且其中步骤c)在步骤d)之前、期间或 之后进行。“乳底物”，在本发明的上下文中，可以是任何生的和/或加工过的乳材料，其能根据本发明的方法进行酸化。因此，有用的乳底物包括，但不限于包含乳蛋白的任何乳品或乳 样产品的溶液/悬浮液，如全脂乳或低脂乳、脱脂乳、酪乳、复原乳粉(reconsitituted milk powder)、浓缩乳、乳粉、乳清、乳清渗透物、乳糖、来自乳糖结晶的母液、乳清蛋白浓缩物，或 奶油。明显地，乳底物可以来源于任何哺乳动物。在本发明的一个方面，乳底物比生乳品更浓缩，即蛋白质含量高于生乳品。在这 个方面，蛋白质含量高于5%，优选高于6%，如高于7%，更优选高于8%，如高于9%或高 于10%。优选地，乳糖含量也高于生乳品，如高于7%，高于8%，高于9%，高于10%，高于 11 %或高于12%。在这个方面的一个优选实施方案中，乳底物是脱脂乳粉的浓缩水溶液，所 述脱脂乳粉具有高于5%的蛋白质含量和高于7%的乳糖含量。在本发明的上下文中，定义乳底物含量或酸化的乳饮料含量的百分比是质量百分 比，即底物(例如蛋白质或乳糖)质量相对于全部溶液(乳底物或酸化的乳饮料)质量的 百分比。因此，在具有高于5%的蛋白质含量的乳底物中，蛋白质的质量占乳底物质量的超 过5%。优选地，乳底物中至少部分蛋白质是乳品中天然存在的蛋白质，如酪蛋白或乳清 蛋白。然而，部分蛋白质可以是乳品中非天然存在的蛋白质。术语“乳品”应理解为通过对任何哺乳动物如牛、绵羊、山羊、水牛或骆驼挤奶而获 得的乳状分泌物。在优选的实施方案中，乳品是牛奶。在发酵之前，乳底物可以根据本领域的已知方法均质化并巴氏灭菌。在本文中使用时，“均质化”指强烈混合以获得可溶的悬浮液或乳液。如果在发酵 前进行均质化，可以将乳脂破碎成更小的尺寸，使其不再从乳品中分离。这可以通过迫使乳 品在高压经过小孔而实现。在本文中使用时，“巴氏灭菌”指处理乳底物以减少或消除活生物体如微生物的存 在。优选地，通过将特定温度维持特定的时间而实现巴氏灭菌。通常通过加热实现特定的 温度。可以选择温度和持续时间，以杀死或使某些细菌(如有害细菌)失活。然后可以进 行快速冷却步骤。在本发明的方法中，通过用微生物发酵将乳底物酸化。可选地，这种通过发酵的酸 化与乳底物的化学酸化组合。在本发明的方法中的“发酵”指通过微生物的作用将糖转化成醇或酸。优选地，本 发明的方法中的发酵包括将乳糖转化成乳酸。在本发明的上下文中，“微生物”可包括能发酵乳底物的任何细菌或真菌。用于大多数发酵乳产品的微生物选自通常称为乳酸细菌的细菌组。如本文所 使用的，术语“乳酸细菌”指革兰氏阳性、微需氧或厌氧细菌，其发酵糖产生酸，包括乳酸 作为主要产生的酸，还包括乙酸和丙酸。工业上最有用的乳酸细菌可在“乳杆菌”目中找 到，其中包括乳球菌属菌种(Lactococcusspp.)、链球菌属菌种(Streptococcus spp.)、 乳杆菌属菌种(Lactobacillus spp.)、明串珠菌属菌种(Leuconostoc spp.)、假明串 珠菌属菌禾中(Pseudoleuconostocspp.)、片球菌属菌禾中(Pediococcus spp. ) > felf |if M 菌禾中(Brevibacterium spp.)、肠球菌属菌禾中(Enterococcus spp.)禾口丙酸杆菌属菌 种(Propionibacterium spp.)。此外，属于严格厌氧细菌组的产生乳酸的细菌双歧杆菌 (bifidobacteria)，即双歧杆菌属菌种(Bifidobacterium spp.)通常包括在乳酸细菌组中，其常单独或与乳酸细菌组合用作食品发酵剂(f00d cultures) 0通常向乳品业提供乳酸细菌，作为冷冻或冻干培养物用于生产用起子(bulk starter)繁殖，或者作为所谓的“直投式发酵剂”(DVS)培养物，意欲用于直接接种到发酵 容器或罐中用于产生乳制品，如酸化的乳饮料。这样的培养物通常称作“起子培养物”或“起 子”。常用的乳酸细菌的起子培养物菌株通常分为最适生长温度在约30°C的嗜温 性生物体，和最适生长温度在约40至约45°C范围的嗜热性生物体。属于嗜温组的典 型生物体包括乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(Lactococcus lactis subsp. cremoris)、肠膜明串珠菌乳月旨亚禾中(Leuconostocmesenteroides subsp. cremori s)、肠膜假明串珠菌乳月旨亚种(Pseudoleuconostocmesenteroides subsp. cremoris)、戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)、乳酸乳球菌乳酸亚种双乙酰 生物突变禾中(Lactococcus lactis subsp. lactis biovar. diacetylactis)、干酪乳 杆菌干酪亚种(Lactobacillus casei subsp. casei)和副干酪乳杆菌副干酪亚种 (Lactobacillus paracasei subsp. pEtracEisei)。
热链球菌(Streptococcus thermophilus)、屎肠球菌(Enterococcusfaecium)、德式乳杆 菌季L酸亚禾中(Lactobacillus delbrueckii subsp. lactis) >Jfnfdr Llf|if (Lactobacillus helveticus)、德式杆liff呆；t)口禾ll亚亚禾中(Lactobacillus delbrueckiisubsp. bulgaricus) 和嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)。属于双歧杆菌属的严格厌氧细菌也常用作乳品起子培养物，包括两歧双歧杆菌 (Bifidobacterium bifidum)和长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)，并且通常包括在 乳酸细菌组中。此外，丙酸杆菌的菌种用作乳品起子培养物，特别是在乳酪的生产中。此外， 属于短杆菌属的生物体常用作食品起子培养物。另一组微生物培养物是真菌培养物，包括酵母培养物和丝状真菌的培养物，其 特别用于某些类型的乳酪和饮料的产生中。真菌的实例包括娄地青霉(Penicillium roqueforti)、白青霉(Penicillium candidum)、白地霉(Geotrichumcandidum)、幵菲尔圆 酵母(Torula kefir)、幵菲尔酵母(Saccharomyces kefir)和酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)0在本发明的优选实施方案中，用于乳底物发酵的微生物是干酪乳杆菌或嗜热链球 菌与德式乳杆菌保加利亚亚种的混合物。可选地，可以对已发酵乳底物进行热处理，以失活微生物。用于酸化的乳饮料生产的发酵方法是公知的，并且本领域的技术人员知道如何选 择合适的工艺条件，如温度、氧、微生物的量和特性和处理时间。显然，应选择发酵条件以支 持本发明的实现，即获得适于产生酸化的乳饮料的发酵乳制品。同样地，技术人员知道是否及何时将添加剂，例如糖、香料、矿物质、酶(例如凝乳 酶、乳糖酶和/或磷脂酶)用于根据本发明的酸化的乳饮料生产中。可选地，可以稀释已发酵的乳底物以获得酸化的乳饮料。在一个实施方案中，将已 发酵的乳底物稀释至少1. 5倍，优选至少2倍，至少2. 5倍或至少3倍。可以用水或任何种 类的水溶液稀释。在本发明的上下文中的“稀释至少1. 5倍”表示稀释已发酵的乳底物，使 其体积增加至少50%。
在一个实施方案中，向已发酵的乳底物加入糖浆。本发明的上下文中的“糖浆”是能够为终产物即酸化的乳饮料带来香味(flavour) 和/或甜味的任何其它添加剂组分。可以是包含下述的溶液例如，糖、蔗糖、葡萄糖、果糖 的液体糖、阿斯巴甜、糖醇、水果浓缩物、橙汁、草莓汁和/或柠檬汁。可以使用本领域已知的任何方法将已发酵的乳底物和糖浆的混合物均质化。可以 进行均质化以获得平滑(smooth)而稳定的液体均质溶液。可以通过本领域已知的任何方 法进行酸化乳底物和糖浆的混合物的均质化，如通过迫使乳品在高压经过小孔来进行。在本发明的另一个实施方案中，向已发酵的乳底物加水，并且将已发酵的乳底物 和水的混合物均质化。本发明的方法包括用具有转谷氨酰胺酶活性的酶处理乳底物。酶处理可以在发酵 前进行，如在接种微生物之前。酶处理可以与发酵同时进行。在一个实施方案中，在用微生 物接种乳底物之前、同时或之后加入酶，并且在乳底物上的酶反应基本上与乳底物的发酵 同时发生。或者，可以在发酵后进行酶处理。如果酸化的乳底物与糖浆混合并可选地均质化， 那么酶处理可以在此之前或之后进行。可以与糖浆同时或在糖浆之后但是要在均质化前加 入酶，或者可以在将酸化的乳底物和糖浆混合并均质化之后加入酶。在优选的实施方案中，酶处理在发酵前或期间进行。在更优选的实施方案中，在发 酵前将乳底物巴氏灭菌，并且在巴氏灭菌前进行酶处理。因此巴氏灭菌可以使酶失活。在另一个优选的实施方案中，在用转谷氨酰胺酶处理之前，将乳底物进行热处理， 如巴氏灭菌。可以进行热处理，使乳底物中超过50 %，优选超过60 %，超过70 %或超过80 % 的乳清蛋白变性。在本发明的上下文中，当在PH4. 5沉淀时可使乳清蛋白变性。在更优选 的实施方案中，将乳底物进行热处理，然后均质化，之后用转谷氨酰胺酶处理。在另一个优选的实施方案中，在用转谷氨酰胺酶处理之前向乳底物加入酵母提取 物或还原剂如谷胱甘肽。在酶处理后，可以进行另一次热处理，如巴氏灭菌，以使酶失活。以合适的量加入具有转谷氨酰胺酶活性的酶，从而在选择的反应条件下实现期望 程度的蛋白质修饰。可以以0. 0001-lg/L乳底物，优选0. 001-0. lg/L乳底物的浓度加入酶。本发明的方法中的酶处理可以通过如下进行向乳底物中加入酶并使酶反应在合 适的温度以合适的保持时间(holding-time)发生。酶处理可以根据本领域公知的原理，在 经选择以适合所选的蛋白质修饰酶的条件下进行。还可以通过使乳底物与已被固定化的酶 接触而进行处理。酶处理可以在任何合适的pH进行，如在2-10的pH范围中，如，在4-9或5-7的 pH。可以优选使酶在乳底物的天然pH作用，或者，如果因为发酵而实现酸化，酶可以在发酵 过程中在乳底物的天然PH作用，即pH将从未发酵乳底物的天然pH逐渐降低至发酵乳底物 的pH。酶处理可以在任何适当的温度进行，例如在1-80°C，如2_70°C的范围中。在本发 明的一个实施方案中，酶处理可以优选在40-50°C的范围中进行。在另一个实施方案中，酶 处理可以优选在10°C以下的温度进行。可选地，使酶作用于乳底物之后，可以通过本领域已知的任何方法将酶蛋白去除、
8减少和/或失活，如通过热处理和/或降低PH进行。可选地，可以向酸化的乳饮料中加入其它成分，如着色剂；稳定剂，例如果胶、淀 粉、改性淀粉、CMC等；或多不饱和脂肪酸，例如脂肪酸。这些成分可以在生产过程期间 的任意点加入，即发酵之前或之后，酶处理之前或之后，和可选地加入糖浆之前或之后。在 优选的实施方案中，转谷氨酰胺酶处理与加入CMC组合。在本发明的一个方面，将乳底物的溶氧水平降至饱和水平的80%以下(below)。 优选地，将溶氧水平降至饱和水平的70%以下，更优选60%以下并且甚至更优选50%以 下。乳底物中的溶氧浓度是在溶液中发现的氧的量。可以以毫克每升底物(mg/1)或 等同的单位氧比水百万分之一(ppm)测量。其依赖于多种因素，如温度、压力和乳底物中多 种溶解或悬浮固体的量。其可以用溶氧探针如氧传感器测量。溶氧水平是底物中溶解或携带的氧量的相对量度。可以作为相对于在相同温度和 相同压力乳底物完全饱和时乳底物中溶氧浓度的百分比来计算。通过如下计算百分比饱和度(percent saturation)用测量的溶氧浓度除以相同 条件下的饱和水平，并乘以100。可以通过本领域已知的任何方法降低乳底物的溶氧水平。可以通过吹氮气 (nitrogen flushing)或吹二氧化碳或使用氧清除酶(oxygen scavenging enzyme)而降 低，所述氧清除酶优选氧化还原酶，如糖氧化酶、纤维二糖氧化酶、葡萄糖氧化酶、己糖氧化 酶或乳糖氧化酶。具有过氧化氢酶活性的酶可以与氧化还原酶一起加入。可以在用转谷氨酰胺酶处理之前或同时降低乳底物的溶氧水平。可以在发酵之前 或同时降低。并且如果将乳底物巴氏灭菌，可以在巴氏灭菌之前或之后降低溶氧水平。具有转谷氨酰胺酶活性的酶在本发明的方法中，可以使用具有转谷氨酰胺酶活性的酶生产酸化的乳饮料，从 而减少保存时的脱水收缩。在本发明的上下文中，具有转谷氨酰胺酶活性的酶可以是催化结合肽的谷氨酰胺 的羧基酰胺基团(酰基供体)和伯胺(酰基受体)如结合肽的赖氨酸之间的酰基转移 的酶。游离酸酰胺和氨基酸也可以反应。因此蛋白质和肽可以这种方式交联。如果不存 在胺，转谷氨酰胺酶还可以，例如，以h20为酰基受体催化蛋白质中谷氨酰胺残基的脱胺基 (deamination)。
根据本发明的转谷氨酰胺酶还称为，例如，蛋白质谷氨酰胺_ Y _谷氨酰基转移 酶、Xllla因子、纤维蛋白连接酶、纤维蛋白稳定因子、谷氨酰肽谷氨酰基转移酶、多胺 转谷氨酰胺酶、组织转谷氨酰胺酶，或R-谷氨酰基-肽胺谷氨酰基转移酶。转谷氨酰 胺酶组包括但不限于划分入EC 2.3.2. 13亚类的酶。在本发明的上下文中，转谷氨酰胺酶 还称为TGase。根据本发明要使用的转谷氨酰胺酶优选经过纯化。本文使用的术语“纯化”涵盖 酶蛋白制备物，其中所述制备物已富集了所述的酶蛋白。这种富集可以是例如去除产生酶 蛋白的生物体的细胞，通过蛋白质特异性沉淀或使用色谱步骤去除非蛋白材料，在所述色 谱步骤中将所述酶蛋白选择性吸附在色谱基质上并从该基质上洗脱。将转谷氨酰胺酶纯化 到一定程度，使得仅存在少量的其它蛋白质。表述“其它蛋白质”具体涉及其它酶，即基本上不含来自产生所述蛋白质生物体的其它组分，所述生物体可以是天然存在的微生物，或 是用于重组生产转谷氨酰胺酶的遗传修饰的宿主微生物。然而，对于根据本发明的用途，转谷氨酰胺酶并不需要那么纯。其可以，例如，包括 其它酶。在优选的方面，本发明的方法中使用的转谷氨酰胺酶经过纯化，以在总蛋白质中 包含重量百分比至少20 %，优选至少30 %，至少40 %或至少50 %的转谷氨酰胺酶。转谷氨 酰胺酶的量可以由如下计算制备物的活性测量值除以转谷氨酰胺酶的比活性(活性/mg EP)，或者可以通过SDS-PAGE或本领域中已知的任何其它方法定量。总蛋白质的量可以，例 如，通过氨基酸分析测量。在本发明的方法的一个实施方案中，重组产生具有转谷氨酰胺酶活性的酶。在本发明的一些方面，具有转谷氨酰胺酶活性的酶可以是动物、植物或微生物来 源。优选的酶获得自微生物来源，特别是来自丝状真菌或酵母，或来自细菌。就本发明而言， 用于本文与给定的来源有关的术语“获得自”，意思是酶由所述来源产生。酶可以由所述来 源或其中已插入编码所述酶的核苷酸序列的菌株(即，重组菌株)产生。在优选的实施方 案中，获得自给定来源的多肽是胞外分泌的。酶可以，例如，获得自如下的菌株蘑菇属(Agaricus)，例如双孢蘑菇 (A. bisporus) ；Ascovaginospora ；曲霉属(Aspergillus)，例如，黑曲霉(A.niger)、泡盛 曲霉(A. awamori)、臭曲霉(A. foetidus)、日本曲霉(A. japonicus)、米曲霉(A. oryzae)； 毛壳属(Chaetomium) ；Chaetotomastia ；网柄菌属(Dictyostelium)，例如盘基网柄菌 (D. discoideum)；毛霉属(Mucor)，例如爪哇毛霉(M. javanicus)、高大毛霉(M. mucedo)、 细孢毛霉(M. subtilissimus)、脉孢菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N. crassa)； 根毛霉属(Rhizomucor)，例如微小根毛霉(R. pusillus)；根霉属(Rhizopus)，例如少 根根霉(R. arrhizus)、日本根霉(R. japonicus)、匍枝根霉(R. stolonifer)；核盘菌属 (Sclerotinia)，例如大豆核盘菌(S. libertiana)；毛癣菌属(Trichophyton)，例如红 色毛癣菌(T.rubrum)；维氏核盘菌属(Whetzelinia)，例如；W. sclerotiorum ；芽孢杆菌 属(Bacillus)，例如巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、枯草芽孢杆菌(B. subtil is)、短小 芽孢杆菌(B. pumilus)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)、苏云金芽孢杆菌 (B. thuringiensis)；金黄杆菌属(Chryseobacterium)；梓樣酸杆菌属(Citrobacter)， 例如弗氏柠檬酸杆菌(C. freundii)；肠杆菌属(Enterobacter)，例如产气肠杆菌 (E. aerogenes)、阴沟肠杆菌(E. cloacae)；爱德华氏菌属(Edwardsiella)、迟钝爱德 华菌(E. tarda)；欧文氏菌属(Erwinia)，例如草生欧文氏菌(E. herbicola)；埃希氏 菌属(Escherichia)，例如大肠杆菌(E. coli)；克雷伯氏菌属(Klebsiella)，例如肺 炎克雷伯氏菌(K. pneumoniae) ；Miriococcum ；Myrothesium ；毛霉属(Mucor)；脉抱 菌属(Neurospora)，例如粗糙脉孢菌(N. crassa)；疫霉属(Phytophthora)，例如恶疫 霉(P.cactorum)；变形菌属(Proteus)，普通变形菌(P. vulgaris)；普罗威登斯菌属 (Providencia)，例如斯氏普罗威登斯菌(P. stuartii)；密孔菌属(Pycnoporus)，例如朱 红密孑L菌(Pycnoporuscinnabarinus)、血红密孑L菌(Pycnoporus sanguineus)；沙门氏菌 属(Salmonella)，例如鼠伤寒沙门氏菌(S. typhimurium)；沙雷氏菌属(Serratia)，例如 S. liquefasciens、粘质沙雷氏菌(S. marcescens)；志贺氏菌属(Shigella)，例如福氏志贺菌(S. flexneri)；链霉菌属(Str印tomyces)，例如抗生素链霉菌(S. antibioticus)、 栗色球孢链霉菌(S. castaneoglobisporus)、利迪链霉菌(S. lydicus)、茂原链霉菌 (S. mobaraensis)、S. violeceoruber ；Streptoverticilium,例如 S. mobaraensis ；栓菌属 (Trametes)；木霉属(Trichoderma)，例如里氏木霉(T. reesei)、绿色木霉(T. viride)；耶 尔森氏菌属(Yersinia)，例如小肠结肠炎耶尔森氏菌(Y. enterocolitica)。在优选的实施方案中，酶是获得自细菌的转谷氨酰胺酶，例如来自放线菌 (Actinobacteria)纲的放线菌，如来自放线菌亚纲，如来自放线菌目，如来自链霉菌亚目， 如来自链霉菌科，如来自链霉菌属的菌株，如利迪链霉菌或茂原链霉菌。在另一个实施方案中，酶是获得自真菌的转谷氨酰胺酶，例如获得自卵菌纲 (Oomycetes)，如获得自露菌目(Peronosporales)，如获得自腐霉科(Pythiaceae)，如获得 自腐霉属(Pythium)或疫霉属(Phytophthora)，如获得自恶疫霉的菌株。在这个实施方案 中优选的酶是具有如下序列的转谷氨酰胺酶，所述序列与SEQ ID NO :3或其转谷氨酰胺酶 活性片段至少50 %，如至少60 %，至少70 %，至少80 %，或至少90 %同一。对于本发明的所有方面，优选的酶是具有如下序列的转谷氨酰胺酶，所述序列与 SEQ ID N0 1或其转谷氨酰胺酶活性片段至少50 %，如至少60 %，至少70 %，至少80 %，或 至少90%同一。另一个优选的酶是具有如下序列的转谷氨酰胺酶，所述序列与SEQ ID NO 2或其转谷氨酰胺酶活性片段至少50 %，如至少60 %，至少70 %，至少80 %，或至少90 %同
o根据本发明，可以通过本领域已知的任何方法确定转谷氨酰胺酶活性，如通过将 酶与结合蛋白质或肽的谷氨酰胺的羧酰胺基团和氨基基团，例如结合蛋白质或肽的赖 氨酸在多种PH和温度在缓冲液中温育，例如在pH 6. 5在37°C在50mM MES中温育30分钟。 可以通过氨的释放(例如获得自R0cheNH3-l 1877984的试剂盒)，或使用羟胺作为氨基供 体(检测在510nm处测量的在酸性条件与铁离子形成的红色复合物作为反应中形成的谷 氨酸Y —氧月亏酸(glutamic acid gamma-hydroxamate)的量)，或通过由氨基酸分析测定
谷氨酰基)赖氨酸，来进行酶活性的检测。实施例1酸化的乳饮料样品的制备和脱水收缩的测量SKMP溶液(脱脂乳粉溶液)使用前将600ml水+135g脱脂乳粉(来自Kerry, Ireland，可即时分散)在50°C 温育10分钟，从而获得均勻溶液。糖溶液33g 蔗糖105g 葡萄糖向460ml 20mM乳酸缓冲液，pH 4. 0中加入这些糖，并在90°C搅拌温育5分钟，然 后冷却至5°C。包含果胶的糖溶液3拟蔗糖2.25g 果胶(来自 CP Kelco 的 Geno 果胶 YM-115-I)105g 葡萄糖
向460ml 20mM乳酸缓冲液，pH 4. 0中加入这些糖，并在90°C搅拌温育5分钟，然 后冷却至5°C。酶
Activa TG(来自Ajinomoto，Japan的茂原链霉菌转谷氨酰胺酶)，1620TGHU/g，稀 释以给出表中所示的终浓度(TGHU =转谷氨酰胺酶氧肟酸单位)。步骤将25ml SKMP溶液转移至100ml量筒中。加入2ml酶或水(对照)并在50°C温育 120分钟。在85°C在水浴中将溶液温育30分钟，并且之后在43°C (水浴)以磁力搅拌温育 10分钟。加入3ml 4U/1 YF-3331 (混合菌株培养物，包含来自 Chr. Hansen A/S，Denmark 的 嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种)，并在43°C温育16小时。然后在0-5 °C冰/水浴中将样品温育20分钟。加入包含或不包含果胶的60ml糖溶液(0-5°C，冰浴)，并在冰浴上用超声均质化 (7x5秒，9秒暂停)。将样品在5°C放置4天，并测量脱水收缩。测量脱水收缩高度并计算总乳饮料高度的相对脱水收缩。脱水收缩测量倌 实施例2酸化的乳饮料制备物的粘度测量通过测量从10ml移液器中释放时间(以秒数计)，作为来自实施例1的酸化的乳 饮料制备物的粘度。粘度测量倌 实施例3在转谷氨酰胺酶处理过程中除氧的影响SKMP 溶液使用前将600ml水+135g脱脂乳粉(来自Kerry, Ireland，可即时分散)在50°C 温育10分钟，从而获得均勻溶液。糖溶液33g 蔗糖105g 葡萄糖向460ml 20mM乳酸缓冲液，pH 4. 0中加入这些糖，并在90°C搅拌温育5分钟，然 后冷却至5°C。酶Activa TG(来自Ajinomoto，Japan的茂原链霉菌转谷氨酰胺酶)，1620TGHU/g，稀 释以给出表中所示的终浓度(TGHU =转谷氨酰胺酶氧肟酸单位)。iM将375 u 1 SKMP溶液转移至2ml eppendorf管中。加入30 u 1酶或水(对照)并
13用N2吹30秒钟(对照不吹N2)，之后在40°C温育120分钟。在85°C在水浴中将溶液温育30分钟，并且之后在Eppendorf Thermomixer中在 43 °C (水浴)混合(lOOOrpm)温育10分钟，。加入溶于9% SKMP的45iil 4U/1 YF-3331 (混合菌株培养物，包含来自Chr. Hansen A/S,Denmark的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种)，并在43°C温育16小时。然后在0_5°C冰/水浴中将样品温育20分钟。加入900 u 1糖溶液(0_5°C，冰浴)，并在冰浴上用超声均质化(6x5秒，9秒暂停)。将样品在5°C放置7天，并测量脱水收缩。测量脱水收缩高度并计算总乳饮料高度的相对脱水收缩。两次测定结果示于下表。脱水收缩测量倌 实施例4在巴氏灭菌前使用不同SKMP浓度的转谷氨酰胺酶处理的影响SKMP 溶液使用前将231ml水+69g脱脂乳粉(来自Kerry，Ireland，可即时分散)在50°C温 育10分钟，从而获得均勻溶液。糖溶液5.66g 蔗糖18. 0g 葡萄糖向46ml 20mM乳酸缓冲液，pH 4. 0中加入这些糖，并在90°C搅拌温育5分钟，然后 冷却至5°C。塵Activa TG(来自Ajinomoto，Japan的茂原链霉菌转谷氨酰胺酶)，1620TGHU/g，稀 释以给出表中所示的终浓度。j^m针对样品1、2、3 和 4，分别将 293ii 1 SKMP 溶液+0ii l、82ii lU89u 1 和 457 ii 1 水转移至2ml eppendorf管中。加入30 u 1酶或水(对照)并在40°C温育120分钟。在85 °C在水浴中将溶液温育30分钟，并且在Eppendorf Thermomixer中在 43 °C (水浴)混合(lOOOrpm)温育10分钟。然后，针对样品1、2、3和4，分别加入457 yl、 375 u l、268ii 1 禾口 Oil 1加入溶于9 % SKMP的45 ill 4U/1 YF-3331 (混合菌株培养物，其包含来自Chr. Hansen A/S,Denmark的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种)，并在43°C温育16小时。然后在0_5°C冰/水浴中将样品温育20分钟。加入525 u 1糖溶液(0_5°C，冰浴)，并在冰浴上用超声均质化(6x5秒，9秒暂停)。将样品在5°C放置4天，并测量脱水收缩。测量脱水收缩高度并计算总乳饮料高度的相对脱水收缩。两次测定结果示于下表。酶浓度以每升酸化的乳饮料显示。脱水收缩测定倌 实施例5TGase处理和乳脂或CMC及最终热处理的组合乳品使用购自超市的 Aria express 乳品(Bagsvaerd, Denmark)脱脂乳3. 5%蛋白质，4. 7%糖和0. 脂肪；半脱脂乳3. 4%蛋白质，4. 7%糖和1. 5%脂肪；和全脂乳3. 4%蛋白质，4. 7%糖和3. 5%脂肪。使用前在95 °C将乳品温育5分钟。糖溶液18%蔗糖，20mM 乳酸，pH 4. 0。
0. 75%〔1 ，18%蔗糖，201111乳酸，口11 4.0。0.375% CMC，18%蔗糖，20mM 乳酸，pH 4.0。0. 15% 01 ，18%蔗糖，201111乳酸，口11 4.0。塵将纯化的GMM茂原链霉菌(SM) TGase 25mg/ml稀释以给出下表中所示的终浓度。^M将375 u 1乳品转移至2ml eppendorf管中。加入30 yl酶或水(对照)，之后在 40°C温育120分钟。在85°C在水浴中将溶液温育30分钟，并且之后在Eppendorf Thermomixer中在 43°C (水浴)混合(lOOOrpm)温育10分钟。加入溶于脱脂乳的45iU 4U/1 YF_3331 (混合菌株培养物，其包含来自Chr. Hansen A/S,Denmark的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种)，并在43°C温育16小时。然后在0-5 °C冰/水浴中将样品温育20分钟。加入900ia糖溶液(0_5°C，冰浴)，并在冰浴上用超声均质化(6x5秒，50%振 幅，9秒暂停)。将这个溶液在80°C温育5分钟，并在EppendorfThermomixer中以混合 (lOOOrpm)冷冻至25°C。在冰浴上用超声再进行一次均质化(6x5秒，50%振幅，9秒暂停)。 将样品在室温20-24°C放置10天，并测量脱水收缩。测量脱水收缩高度，并计算总乳饮料高度的相对脱水收缩。两次测定结果示于下表。MD是平均偏差。酶浓度以每升酸化的乳饮料显示。
实施例6TGase处理和乳脂或CMC而无最终热处理的组合乳品使用购自超市的 Aria express 乳品(Bagsvaerd, Denmark)脱脂乳3. 5%蛋白质，4. 7%糖和0. 脂肪；半脱脂乳3. 4%蛋白质，4. 7%糖和1. 5%脂肪；和全脂乳3. 4%蛋白质，4. 7%糖和3. 5%脂肪。
使用前在95 °C将乳品温育5分钟。糖溶液18%蔗糖，20mM 乳酸，pH 4. 0。0. 75%〔1 ，18%蔗糖，201111乳酸，口11 4.0。0.375% CMC，18%蔗糖，20mM 乳酸，pH 4.0。0. 15% 01 ，18%蔗糖，201111乳酸，口11 4.0。酶将纯化的GMM茂原链霉菌(SM) TGase 25mg/ml稀释以给出下表中所示的终浓度。麵将375 u 1乳品转移至2ml eppendorf管中。加入30 yl酶或水(对照)，之后在 40°C温育120分钟。在85°C在水浴中将溶液温育30分钟，并且之后在Eppendorf Thermomixer中在 43°C (水浴)混合(lOOOrpm)温育10分钟。加入溶于脱脂乳的45iU 4U/1 YF-3331 (混合菌株培养物，其包含来自Chr. HansenA/S,Denmark的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种)，并在43°C温育16小时。然后在0-5 °C冰/水浴中将样品温育20分钟。加入900 u 1糖溶液(0_5°C，冰浴)，并在冰浴上用超声均质化(6x5秒，50%振幅， 9秒暂停)。将样品在5°C放置14天，并测量脱水收缩。测量脱水收缩高度，并计算总乳饮料高度的相对脱水收缩。两次测定结果示于下表。MD是平均偏差。酶浓度以每升酸化的乳饮料显示。
实施例7三种不同TGase的比较乳品使用购自超市的Aria express脱脂乳(Bagsvaerd，Denmark)，使用前在95°C将乳 品温育5分钟。糖溶液18%蔗糖，20mM 乳酸，pH 4. 0。塵将纯化的茂原链霉菌(SM) TGase 25mg/ml，利迪链霉菌(SL) TGase 28mg/ml和恶 疫霉(PC)6mg/ml稀释以给出表中所示的终浓度。^M将375 u 1乳品转移至2ml eppendorf管中。加入30 yl酶或水(对照)，之后在 40°C温育120分钟。在85°C在水浴中将溶液温育30分钟，并且之后在Eppendorf Thermomixer中在 43°C (水浴)混合(lOOOrpm)温育10分钟。加入溶于乳品的45 u 1 4U/1 YF-3331 (混合菌株培养物，其包含来自Chr. Hansen A/S，Denmark的嗜热链球菌和德氏乳杆菌保加利亚亚种)，并在43°C温育16小时。然后在0-5 °C冰/水浴中将样品温育20分钟。
加入900 u 1糖溶液(0_5°C，冰浴)，并在冰浴上用超声均质化(6x5秒，50%振幅， 9秒暂停)。将样品在5°C放置14天，并测量脱水收缩。测量脱水收缩高度，并计算总乳饮料高度的相对脱水收缩。两次测定结果示于下表。MD是平均偏差。酶浓度以每升酸化的乳饮料显示。
权利要求
用于产生酸化的乳饮料的方法，所述方法包括a)提供包含蛋白质的乳底物；b)用具有转谷氨酰胺酶活性的酶处理所述乳底物，所述酶获得自属于链霉菌属(Streptomyces)的细菌；和c)用微生物发酵所述乳底物；其中b)步骤在步骤c)之前、期间或之后进行。
2.用于产生酸化的乳饮料的方法，所述方法包括a)提供具有高于5%的蛋白质含量的乳底物；b)用具有转谷氨酰胺酶活性的酶处理所述乳底物；和c)用微生物发酵所述乳底物；其中b)步骤在步骤c)之前、期间或之后进行。
3.用于产生酸化的乳饮料的方法，所述方法包括a)提供包含蛋白质的乳底物；b)将所述乳底物的溶氧水平降至饱和水平的80%以下；c)用具有转谷氨酰胺酶活性的酶处理所述乳底物；和d)用微生物发酵所述乳底物；其中b)步骤在步骤c)之前或期间进行；并且其中步骤c)在步骤d)之前、期间或之后 进行。
4.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述乳底物在发酵之前进行巴氏灭菌，并且 在巴氏灭菌之前进行所述酶处理。
5.前述权利要求中任一项的方法，其中将所述乳底物在用具有转谷氨酰胺酶活性的酶 处理之前进行热处理。
6.前述权利要求中任一项的方法，其中在用具有转谷氨酰胺酶活性的酶处理之前向所 述乳底物加入谷胱甘肽。
7.前述权利要求中任一项的方法，其中所述微生物是乳酸细菌。
8.前述权利要求中任一项的方法，其中将发酵的乳底物与糖浆混合，并且将该混合物 均质化。
9.前述权利要求中任一项的方法，其中将发酵的乳底物稀释至少1.5倍，以获得酸化 的乳饮料。
10.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酸化的乳饮料作为饮料被消费。
11.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酸化的乳饮料的非脂乳固体含量小于8%。
12.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酸化的乳饮料的脂肪含量小于2%。
13.权利要求12的方法，其中所述酸化的乳饮料的脂肪含量小于0.5%。
14.前述权利要求中任一项的方法，其中具有转谷氨酰胺酶活性的酶是重组产生的。
15.权利要求2至14中任一项的方法，其中具有转谷氨酰胺酶活性的酶获得自属于链 霉菌属的细菌。
16.前述权利要求中任一项的方法，其中所述酶与SEQID NO :1或SEQID N0:2，或者与 它们中任一个的转谷氨酰胺酶活性片段具有至少50%同一性。
全文摘要
本发明涉及用具有转谷氨酰胺酶活性的酶产生酸化的乳饮料的方法。
文档编号A23C9/127GK101854806SQ200880025397
公开日2010年10月6日 申请日期2008年8月1日 优先权日2007年8月2日
发明者克里斯特尔·T·乔尔根森, 斯蒂芬·厄恩斯特, 杰普·W·塔姆斯, 珀·M·尼尔森 申请人:诺维信公司;克尔·汉森公司