专利名称：：离体扩增干细胞的培养物的制作方法离体扩增干细胞的培养物本发明涉及一种培养物，其包含扩增培养基和细胞因子组合物，所述细胞因子组合物如下构成i)白介素-6(IL6);ii)flt3-配体(FLT3);iii)干细胞因子(SCF)和iv)血小板生成素(TP0)，还涉及其用于离体扩增干细胞及/或亲本细胞和从其分化而来的细胞的用途，以及从所述扩增得到的所述细胞的用途。已知干细胞和/或亲本细胞潜在地在再生医学和其他医学、生物领域有变革性的应用。本领域已知的应用实例当中，研究最多并在临床水平已经明确的是骨髓移植，即使存在其他种类的治疗，如间充质干细胞在退化关节中的移植。干细胞和/或亲本细胞应用中产生的一个问题就是应用时可用的细胞数量减少。本领域已知一些方案用于增加所述干细胞和/或亲本细胞的数量。通过一个母干细胞分裂为至少两个子细胞，发生干细胞和/或亲本细胞数量的增加。本领域已知的、用于增加干细胞数量的方案的一个实例是使用饲养层。然而，所述方案存在第二个问题，因为其不能在子干细胞中维持与母干细胞的成熟状态类似的成熟状态。在本发明的上下文中，成熟状态是指细胞的总基因型和/或表型状态。在本申请的上下文中使用的、用于测量得自一次或多次分裂步骤的细胞的成熟的参数是自我维持概率(probabilityofself-maintenance)(或Psm)。Psm值能通过下文公式得出一个母干细胞扩增和/或分化产生的、与同一个母干细胞具有类似基因型和表型属性的子细胞数量--~--一个母干细胞扩增和/或分化产生的总细胞数量Psm在0-1之间变化，其值取决于多种因素，其中包括子细胞数量、分裂种类和分裂步骤的次数。例如，如果在单次分裂步骤中只有一个子细胞保留母干细胞的成熟状态，那么该单次步骤的Psm为0.5。在本发明的上下文中，Psm值能用于单个细胞的分裂或作为大量细胞分裂的平均，只考虑干细胞和/或亲本细胞，不考虑例如，从其得到的分化更多、没有再生能力的细胞。本领域已知，除了其扩增，干细胞和/或亲本细胞的扩增还包括干细胞在分化细胞中的分化。在本发明的上下文中，分化是指子细胞与母细胞相比具有不同基因型和表型属性，因此降低了所得的Psm值。在本发明的上下文中，本领域已知的用于定量细胞成熟的所有方法都可应用。所要采用的方法主要取决于要扩增的干细胞类型。一个优选的方法是流式细胞仪，例如Beckton-DickinsonFACS。所述方法的一个实例是测量造血干细胞的成熟状态的方法，其中测量在细胞表面上标记蛋白质CD34+CD133+CD45+/—的存在。本领域已提出的一些方案，其中描述了母细胞生长或分裂步骤中干细胞的扩增，Psm等于O.5。这是指对于干细胞每个分裂步骤，一个子细胞保留与母干细胞相同的成熟状态，但另一个是分化的。然而，所述的方案不能满足所要求的条件，因为这些方案使干细胞以0.5的Psm扩增仅仅一代或两代。在第一或第二次分裂步骤后，Psm值极大的下降。在本发明的上下文中，"代"是指至少一个母干细胞的分裂步骤的数量。因此，所述方案不能给出满意的结果，因为Psm仅仅在两代之后就降低，并因此，干细胞和/或母细胞总的增加相对较低，总生长不是指数形式。—个实例是从脐带血移植造血干细胞和/或母细胞，其中很好地体现了上文提到的关于干细胞和/或母细胞应用的问题。脐带血是同种异体的或自体的，富含造血干细胞。造血干细胞可用于对由于病理或一些病理随后的治疗而造血系统损毁或减弱的人的"骨髓移植"中。造血干细胞和/或母细胞数量减少可以用于测定功效降低带来的问题这在本领域是已知的并且被从脐带血的骨髓移植主要在体重减轻病人身上实施的事实所证明。第二个问题是细胞成熟状态脐带血中的造血干细胞/亲本细胞处于未成熟状态，这使得骨髓内进行移植后生根(post-transplantationrooting)。如果在骨髓中没有所述的生根，说明病人的免疫性脆弱，这是不希望出现的。问题在于用于生根的、具有所需成熟性的干细胞数量对于病人的需要太少。因此，必须在扩增的造血干细胞/亲本细胞中维持相似的成熟状态，以使所述扩增的细胞在骨髓中迅速生根并在短时间内开始履行其保护性作用。申请人:惊奇地发现解决以上问题包括使用存在于含有扩增培养基的培养物中的细胞因子组合。本发明的目标为存在于含有扩增培养基的培养物中的细胞因子组合。所述细胞因子组合如下构成i)白介素-6(IL6);ii)flt3-配体(FLT3);iii)干细胞因子(SCF);iv)血小板生成素(TP0)。所述的培养物，包含细胞因子组合及用于培养或维持存活的干细胞和/或亲本细胞的生长培养基，就其定义而言，还包括工业规模的生物反应器。在本发明的上下文中，"干细胞"是指具有以下特征的细胞參其为高度不成熟或非分化的，參其能增殖并同时自我维持或自我更新，禾口參其能产生相同或不同类型的子细胞。干细胞是本领域已知的哺乳动物的全能、多能(pluripotent)或多潜能(multipotent)细胞。全能干细胞是能更新且能分化成三种胚层_内胚层、中胚层和外胚层的细胞用于最终形成整个新生物体的细胞。多能干细胞从全能干细胞分化而来，保留其所有能力，除了不能形成只从多能细胞开始的完整的生物体。多潜能干细胞是能产生具有共同或相似种系发生细胞的干细胞，例如形成造血系统中所有细胞的造血干细胞或形成属于骨和/或脂肪组织的基质细胞的间充质干细胞。可选地，根据本发明的干细胞不包括来自人类胚胎的全能干细胞。可选地，根据本发明的干细胞不包括来自人类胚胎的干细胞。在干细胞定义内，还包括亲本细胞，S卩能够发展成单种细胞或密切相关细胞的细胞，例如淋巴细胞、浆细胞或内皮细胞，其保留了自我更新的能力。亲本细胞的一个实例是卫星细胞，其能融合(melt)并增加属于肌肉的细胞总质量。根据本发明的培养物中存在的生长培养基可以是本领域已知的、能为细胞提供必要营养物使之能扩增的任何培养基。优选地，所述生长培养基不包括除以上列出并随后在表1中记录的因子之外的其他因子，在本领域已知所述因子对干细胞生长具有剌激作用。根据本发明的、包含扩增培养基的培养物中存在的细胞因子组合的优点在于其简易性，以及不存在可能引起成熟状态变化的其他因子。所述优点在与本领域已知的生长培养基相比时有很好的体现，本领域已知的生长培养基例如饲养层，其中有其他"外源"细胞的污染，其中没有重现性并因此扩增不是标准化的过程，干细胞受到剌激自身分化为髓细胞。在优选的实施方式中，生长培养基是液体。本领域已知的培养基的实例是CellGroSCGM(CellGenix，弗莱堡，德国)或其衍生物。在优选的实施方式中，细胞因子在所述生长培养基中以表1记录的浓度存在表1:根据本发明细胞因子存在于液体生长培养基中的浓度<table>tableseeoriginaldocumentpage6</column></row><table>在优选的实施方式中，根据本发明的生长培养基不含有任何血清。使用无血清培养基具有优势，因为其使得降低污染(具有在扩增期间影响干细胞成熟状态的因子的污染)的可能性和/或降低培养基中感染的可能性。本发明的另一方面是扩增干细胞的方法，其中有至少一个步骤中将干细胞与培养物接触，优选的是如上所述根据本发明在培养物中混合。所述方法离体施行并且使用本领域已知的、用于在培养物中制备细胞群体的设备。根据本发明，扩增细胞的所述步骤对于至少3代干细胞，优选地至少5代，更优选地8代，更优选地10代，更优选地12代，更优选地15代，更优选地18代，还更优选地20代优选地具有的Psm值等于或高于0.4，优选地等于或高于0.5。Psm对于50代优选地等于或高于0.4，优选地等于或高于0.5。备选地，用倍数扩增参数定义所述细胞扩增。所述方法优选地在2周内将干细胞扩增至起始细胞数量的至少5倍，优选地至少10倍，更优选地至少15倍，还更优选地至少20倍。细胞能在2周内自身扩增多至初始细胞数量的60倍。若其中还包括分化的细胞，不管是不是得到了再生潜能，则所述方法优选地能在2周内将细胞扩增至初始细胞数量的180-650倍，优选地为初始细胞数量的200-650倍。可用本领域已知的方法进行对所产生的细胞群体分析，如用Burker血球计数器计数，或优选地使用上文提到的流式细胞仪。对于倍数扩增，测量所得群体相对于初始群体的倍增。在优选的版本中，使用通常来自"母"细胞的、造血性和内皮性的血_血管链(haemato-angiochain)扩增细胞。优选地，根据所述实施方式扩增的细胞是CD34+133+45+(造血干细胞)和CD34+133+45—(内皮细胞)。所述细胞可用本领域已知的用于选择细胞的任何方法进行选择，例如使用CliniMACS系统，MiltenyiBiotech,贝尔吉施格拉德巴赫，德国。根据本发明的方法的实施方式中，使用根据本发明的培养物进行的细胞扩增没有代数的限制，能以无限的方式继续。该方法的所述实施方式包括以使相同细胞延续更久的明显改变，然而这些改变对本领域技术人员是已知的，例如包括达到融合时进行细胞传代以及重配培养基和细胞因子的步骤。所述的方法能独立于代数而扩增干细胞，优选地其Psm等于或高于0.4，更优选地等于或高于0.5。在根据本发明方法的其他优选实施方式中，在所述的传代中将干细胞置于根据本发明的培养物中，初始浓度为1000个细胞/ml-10000个细胞/ml，优选地为在液体生长培养基中为3500个细胞/ml-6500个细胞/ml之间，更优选地为在无血清培养基中，如CellGroSCGM(CellGenix，弗莱堡，德国)或其衍生物。所述扩增没有最大的时间限制，时间长度取决于本领域技术人员应用该方法的方式。优选地，该方法持续io天-eo天，更优选地持续12天-30天，还更优选地持续13天-24天。在所述方法期间，根据本发明的培养物中存在的细胞因子浓度优选地至少一周两次回复其起始浓度(如表1中记录)。所述方法能够优选地扩增干细胞，优选地具有Psm等于或高于0.4，更优选地在2周内等于或高于0.5至少20代，优选地在2周内26-60代起始细胞数量。备选地，细胞在2周内以20倍的倍数扩增，扩增26-60次。若还包括所得分化的细胞，所述方法优选地能在2周内以起始细胞数量的至少50倍，优选地为起始细胞数量的180-650倍扩增细胞。在所述方法的优选实施方式中，在无菌条件下例如使用无菌超净台工作，从所述实施方式得到的细胞群体含有内毒素水平低于O.05IU/ML的界线(欧洲药典)且不显示支原体或细菌霉菌污染。使用根据本发明培养物或上述方法的另一个优点在于所得细胞不显示改变的核型，并在连续移植时不产生肿瘤。在该方法的实施方式中，所得细胞在扩增步骤后冷冻。所述的步骤能使用本领域已知的干细胞冷冻方法，例如将扩增的细胞加入含有10%v/v二甲基亚砜，70%v/v自体血浆(优选地经过2500rad的辐射)和20%v/v市售培养基的溶液里，接着冷冻所得溶液。在根据本发明方法的其他优选实施方式中，扩增干细胞的方法能与下文描述的用于制备药物的方法相结合。所述药物的制备能在细胞扩增步骤之后，优选地是之后立即施行。备选地，所述药物在解冻一等份按上文描述冷冻的细胞之后生产。在制备所述药物时，优选地使用已经预防性地与细胞因子分离的细胞。包括本领域已知的用于分离细胞因子的所有方法，例如离心法，其中细胞因子留在上清中，细胞在沉淀中。根据另一方面，本发明涉及根据本发明方法可获得的细胞和其用途。可获得的细胞包括更大量的干细胞，其具有与亲本细胞相同的基因型和/或表型谱。所述得到的细胞可得自具有以下特征的过程独立于扩增的传代次数，Psm等于或高于0.4，优选地等于或高于O.5;此外还具有的特征是核型没有发生变化，所得细胞中没有产生肿瘤。在优选的实施方式中，所述细胞以足够量与从其分化的细胞一起存在于组合物中，以使之能应用于下文提到的治疗过程。在本发明所述方面的实施方式中，细胞以冷冻等份形式存在。所述等份包括如上文描述根据本发明方法可获得的所述细胞以及用于在冷冻时维持细胞活力的本领域已知的组合物，优选地，这些含有5-20%v/v二甲基亚砜，例如溶液含有10%v/v二甲基亚砜，70%v/v自体血浆(优选地经过2500rad的辐射)和20%v/v市售培养基。根据本发明扩增方法直接得到的干细胞及从其分化的所得细胞能用作药物。所述药物进一步包含赋形剂和/或佐剂和/或稳定剂和/或载体，并且可根据本领域已知方法配制。对组合物中的这些赋形剂和/或佐剂和/或稳定剂和/或载体的选择取决于其用途而变化，但必须维持根据本发明的方法可获得的细胞的适应性。所述药物可以是本领域已知的任何剂型，优选地所述药物以注射液形式存在。所述药物可以以本领域已知的任何形式给药，优选地为胃肠外给药，如注射。在优选的实施方式中，作为药物的所述用途是用于制备药物，所述药物用于移植优选地属于造血系统和/或内皮系统的细胞，用于再次使属于造血系统和/或内皮系统的细胞群体以被认为是正常的水平重新生长。所述的应用可针对遭受缺乏属于造血系统的细胞的人。所述的缺乏可能是由于对与存在的细胞相联系的病理的治疗，例如由于对患有白血病的病人的骨髓性或淋巴性抑制的放射性治疗。备选地，如果细胞属于内皮系统，所述应用可针对患有由急性或慢性病症导致的血管病变(如心肌梗死或糖尿病型血管病变)的人。使用所述细胞制备这种药物的优点在于存在显著更大量的细胞，因此能治疗任何体型的人，并且改善了细胞对骨髓的生根率。在另一个优选的实施方式中，作为药物的所述用途是用于制备药物，所述药物治疗恶性病理，例如急性或慢性白血病或骨髓发育不良综合征，非恶性和先天性病理，例如严重的联合免疫缺陷，Wiskott-Aldrich综合征，恶性骨质疏松症，地中海贫血、范科尼贫血(Fanconianemia)，黏多醣代谢病，以及获得性非恶性病理，例如严重再生障碍性贫血。所述药物进一步含有赋形剂和/或佐剂和/或稳定剂和/或载体，并且这可根据本领域已知方法配制。对组合物中的这些赋形剂和/或佐剂和/或稳定剂和/或载体的选择取决于其用途而变化，但必须维持根据本发明的方法可获得的细胞的适应性。在另一个优选的实施方式中，根据本发明的方法扩增的细胞能用在基因治疗的方案中。在本发明的上下文中，"基因治疗"是指离体基因治疗的方法，包括以下步骤-从相关的人中取出体细胞-培养所述的细胞-通过合适的载体(例如病毒载体)，在培养期间用目的基因转染细胞，-可选地，只在培养中分离并培养受到转染的细胞-将转染的细胞重新引入受试者的体内。可以使用本领域已知的通用技术进行所述步骤。基因治疗能通过替换野生型基因或与野生型基因互补用于补救至少异常基因，或用于引入人工基因以在细胞中引入与某种蛋白质或相应基因相关的所需活性。如上文描述的，在培养物转染之前、之中或之后，根据本发明的培养物用于扩增细胞的用途使整个治疗的功效得到改善。在其他更优选的实施方式中，在根据本发明方法扩增之前或与根据本发明的培养一起将待转染的基因引入细胞内，这样使得只有有用和所需的细胞得到扩增。可选地，得自所述转染的细胞随后可以离体使用，用于制备在基因治疗的特异性方案中使用的药物。在另一个实施方式中，转染引入如下基因，该基因使干细胞(及随后其后代)在重新引入人体时对对于正常细胞有害的治疗产生抗性。本领域已知的一个实例由"多药抗性"(Multi-drugresistance(MDR))基因组成，其使得能用毒性或有害物质治疗特定的疾病，其中无法以明确方式定义对细胞的治疗。在本发明另一个实施方式中，根据本发明的方法可获得的细胞能用于离体制备自体细胞群体或自体组分。例如，可使用根据本发明的细胞制备血小板血组分。所述制备包括将根据本发明的方法可获得的细胞与包括血小板生成素、白介素-11、白介素_6和肝素的溶液接触，例如通过混合。以此方式，获得了CD4r和CD61+细胞的扩增，这些细胞是巨核细胞未成熟亲本，其随后产生血小板血组分。根据本发明的方法可获得的细胞可用于体外诊断测定法，用于评估化学化合物或环境因素的作用。所述化合物包括蛋白质或生物来源的其他种类的分子。环境因素包括，例如，可用于以合适方式培养或维持细胞的培养基和用于制备所述培养基的液体。所述的诊断测定法还能用于在开始临床方案前评估新药对新扩增细胞培养物的危害。实施例1-用于扩增CD34+干细朐的实验方案i)第0天-将一包热灭活同种异体血桨(HIAP)置于超净台内于室温解冻。-解冻一等份脐带血，用CliniMACS系统(MiltenyBiotech,贝尔吉施格拉德巴赫，德国)选择CD34+细胞。所述选择得到数量为0.36X106个，等于所选择细胞总群体的88X的CD34+细胞群体。-计算培养基(含有CellGro培养基，HIAP和细胞因子)的体积使得在培养基中的细胞浓度为5X103个细胞/mL。-根据计算结果(72mL)加入lOml，作为对照管。-计算要取出的HIAP体积使其浓度为培养物终体积的10%(v/v)。-通过减去所用的HIAP体积和各细胞因子溶液计算要取出的CellGro培养基体积。细胞因子终浓度必须对于IL6和TPO为10ng/mL，对于SCF和FLT-3为50ng/mL。-基于前面一点计算的培养基的量得出10mL管的所需要数量，准备这些管并目测检验其完整性。-在超净台中按以下顺序取出并转移下列成分首先，定量的CellGro培养基，接着是定量的HIAP和定量的细胞因子(已经计算成单个混合物)。从所述的混合物中取出10ml加入对照管(有试剂但没有细胞)内，然后引入培养箱内。-将用于要准备的每管的lml完全培养基加到另一个含有细胞的管中。-在管内分配9mL完全培养基接着加入lml从前面步骤制备的会细胞管中搜集的细胞悬液。-用显微镜观察每管(使用倒置显微镜)找出可能的异常，然后将管置于培养箱中(37°C，5%C02下)。ii)第3、7、10天-添加细胞因子。_第3天，从培养箱中取出管。-制备每400微升含有lOOngTPO，lOOngIL6，500ngflt-3及500ngSCF的溶液。每管加入400微升，包括对照管。-再次将管置于培养箱中(37°C，5%C02下)。-第7天，重复操作。-第IO天，重复操作。iii)第14天，释放扩增的产品-在超净台中，无菌条件下离体制备含有2%p/v人白蛋白的生理溶液，其组成了再灌注缓冲液。-第14天，从培养箱中收集所有含有扩增细胞的管。-对每管进行目视(充盈度)和显微镜(使用倒置显微镜)控制。-控制之后，将每管的内容物倒入50mL管，每管用总共5mL的再灌注缓冲液洗涤，再将这5mL加入含有细胞悬液的50mL管。-室温下1400RPM离心10分钟。-离心结束时分离上清液到50mL管中，对管标记产品编号和"r洗涤上清液"字样，存放于超净台内。-加入50ml再灌注缓冲液重悬沉淀，再次在室温下1400RPM离心10分钟。-离心结束时分离上清液到50mL管中，对管标记产品编号和"2。洗涤上清液"字样，存放于超净台内。-重悬所得沉淀并加至50ml再灌注缓冲液以形成最终管。-从所述的最终管中取出800微升细胞悬液，并用Burker血球计数板进行有核细胞总数的计数。平均计数为124.6X1()6个有核细胞。-根据最终管中的平均浓度，从最终管取出250，000个细胞并通过流式细胞仪方法进行分析。对1°和2°洗涤上清溶液进行以下测试-无菌测试，根据Eu.Ph.2.6.1，-微等离子体的培养测试，根据Eu.Ph.2.6.7，及_在DigestBroth中用PlusAerobic/F*禾口PlusAnaerobic/F*CultureVialsSoybean-Case(两者为Becton，DickinsonandCompanyCome生产的试剂盒)进行BACTEC测试。根据GMP，所述的试剂盒是在释放前通过上清液评估微生物对细胞污染的快速方法。-LAL显色测试，根据Eu.Ph.2.6.14.第0天，选择0.36X106个CD34+细胞(纯度为88%)进行扩增。扩增后，通过荧光细胞测定方法计数124.6Xl(f个有核细胞的总群体，其中有9.97X106个CD34+细胞，9.06X106个CD3133+细胞；0.007X106个CD19+细胞；0.007X106个NK细胞；0.017Xl()6个CD3+细胞及1.4X106个CD61+细胞。实施例2-将根据本发明扩增的细胞移植到患有地中海贫血的儿竜、镰刀状细胞贫血的儿竜和难治性贫血的中以实施例1描述的方法进行扩增得到的脐带血解冻后，将从中收集的血液输液给患有地中海贫血(PT1)、镰刀状细胞贫血(PT2)和难治性贫血(PT3)的三个儿童。表2显示了所述细胞的扩增结果。在扩增之前，按上文描述进行对CD34+细胞的选择。表2:用于三位病人输血的三等份解冻脐带血扩增结果<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>在所有三个病人中，通过低分辨率血清学或对抗原HLA-A或-B的分型以及对HLA-DRB1的DNA的高分辨率分型确定组织兼容性。从移植前4天到前2天，从不相关供体每天移植抗胸腺细胞球蛋白(Anti-thymocyteglobulin,ATG)至每天3mg/kg的剂量。根据本领域已知方法对GVHD-移植物抗宿主病进行分类(GlucksbergHetal.，Clinicalmanifestationsofgraft_versus_hostdiseaseinhumanrecipientsofbonemarrowfromHLA-matchedsiblingdonors,Transplantation,1974;18;295-304禾口19以及StorbRetal.PredictivefactorsinchronicgraftiersusHiostdiseaseinpatientswithaplasticanemiatreatedbybonemarrowtransplantationfromHLA-identicalsiblings,AnnInternMed1983;98:461-466)。对于GVHD的条件反射疗法和预防，用的是与现在用于从家系供体或从非亲缘供体移植非经操作的胎盘血相同的药物。条件反射方法预见了根据不同给药计划(一般开始于移植前大约3周)在不同组合中以下药物的给药白消安，塞替派，氟达拉宾，环磷酰胺，美法仑。简言之，使用环孢菌素-A、类固醇和抗_淋巴细胞血清使得对GVHD的预防变得清晰起来。已确定的是当观察到中性粒细胞浓度连续3天超过0.5X109/L时髓细胞会成功生根，而当观察到连续九天超过30X107L时血小板生根。所有三个病人都存活，分别对于PT1，PT2和PT3，在移植后29个月、22个月和19个月之后都没有发生任何病理性并发症。涉及相对临床结果的结果记录在表3中。扩增的细胞是用于离体应用的、在盐溶液中的无菌无热原细胞悬液形式，用注射器在超净台中无菌取出人白蛋白，用于治疗的细胞一般通过中心静脉给药。表3.对患有造血疾病的儿童移植根据本发明扩增的脐带血细胞的临床结果PT1PT2PT315个月后的结果存活且临床状况相对良好存活且临床状况相对良好存活且临床状况相对良好观察到髓细胞生根的时间(天)(>0.5X107L)161829观察到血小板生根的时间(天)(>30X107D313359急性GVHD无无有慢性GCHD无无无严重病毒、细菌或支原体感染无无无病症重新发展无无无需要注意的是，考虑到脐带血是不够用于所有三个儿童的，如果没有根据本发明的方法使用根据本发明的培养物对其进行扩增，则无法取得所述的非常好的结果。在所有三个病例中，脐带血中的细胞水平低于3.7X107个有核细胞每kg病人体重，Gluckman等人指出，(GluckmanEetal.forEurocordTransplantGroupandEuropeanBloodandMarrowTransplantGroup(EBMT).CIinicaloutcomeinrecipientsofcordbloodtransplantfromrelatedandunrelateddonors.NEnglJMed1997;337:373-381)从脐带血进行移植若要取得积极的结果，需要至少3.7X107有核细胞每kg病人。所述的实施例显示了中长期的积极结果，但是，本领域已知——如LocatelliF等人指出的——其能同样地进行长期应用(LocatelliFetal.RelatedumbilicalcordbloodtransplantinpatientswithThalassemiaandSickleCellDisease,Blood，2003;101:2137-43)。輔你l3-附广脂麵,假雄X顿。按实施例1中记录，在扩增14天时对所培养细胞进行染色体制备后，使用QF带及差异化着色对染色体进行荧光分析以在数量上(如三体、单体)和结构上(如易位、缺失和12倒位)鉴定结构异常。在扩增的细胞中未观察到染色体异常。实施例4-多能干细朐的扩增通过使用"悬滴(hangingdroplets)"法培育孤雌细胞来制备"胚小体"(EmbryoidBodies,EB)细胞，在含有加入2mM谷氨酰胺的低葡萄糖浓度培养基DMEM/F10(1:1)，0.ImM2-巯基乙醇，75yg/ml青霉素和50yg/ml链霉素，1%p/v非必需氨基酸(Gibco，Invitrogen,意大利)，1%p/v核苷混合物，10%v/v敲除血清替代物(GibcoInvitrogen意大利)和5%v/vFBS(Gibco，Invitrogen意大利)的培养基中9天，其中每天使培养基恢复到各成分的起始浓度。在无菌环境下解离EB，并根据类似实施例1的方法在扩增培养基中制备，其中唯一的差别在于期限为三周而不是2周。这样，在第14和第17天使用细胞因子混合物恢复培养基，扩增的产物在第21天释放。起始群体为8400EB细胞，3周后用细胞荧光测定方法计数得219000个EB细胞。权利要求一种培养物，包含扩增培养基和细胞因子组合物，所述细胞因子组合物如下构成i)白介素-6(IL6)；ii)flt3-配体(FLT3)；iii)干细胞因子(SCF)；iv)血小板生成素(TPO)。2.根据权利要求l的培养物，其中所述培养物为液体。3.根据权利要求2的培养物，其中细胞因子IL6的浓度为l-20ng/ml，优选地为5-15ng/ml，还更优选地为9-llng/ml。4.根据权利要求2或3的培养物，其中细胞因子FLT3的浓度为20-80ng/ml，优选地为35-65ng/ml，还更优选地为49_51ng/ml。5.根据权利要求2-4中任一项的培养物，其中细胞因子SCF的浓度为20-80ng/ml，优选地为35-65ng/ml，还更优选地为49_51ng/ml。6.根据权利要求2-5中任一项的培养物，其中细胞因子TPO的浓度为l-20ng/ml，优选地为5-15ng/ml，还更优选地为9-llng/ml。7.根据权利要求1-6中任一项的培养物，其中所述扩增培养基是无血清的。8.扩增干细胞的方法，其中至少一个步骤中将干细胞与根据权利要求1-7中一项或多项的培养物相接触。9.根据权利要求8的方法，其中所述方法进一步包括干细胞在由其分化的细胞中的分化。10.根据权利要求8或9的方法，其中在所述步骤中细胞浓度初始为1000个细胞/ml-10000个细胞/ml，优选地为3500个细胞/ml-6500个细胞/ml。11.根据权利要求8-10中任一项的方法，其中所述的步骤持续10天-30天，优选地为12-20天，还更优选地为13-16天。12.根据权利要求8-11中任一项的方法，其中每周两次使所述细胞因子恢复到初始浓度。13.根据权利要求8-12中任一项的方法，其中2周内扩增的干细胞至少为初始细胞的20倍，优选地为初始细胞的26-60倍。14.根据权利要求8-13中任一项的方法，其中2周内扩增的干细胞及其后代至少为初始细胞的50倍，优选地为初始细胞的120-650倍。15.根据权利要求8-14中任一项的方法可获得的干细胞。16.根据权利要求9-14中任一项的方法可获得的干细胞及由其分化的细胞。17.根据权利要求15或16的细胞，以冷冻等份形式。18.根据权利要求15或16的细胞，用作药物。19.根据权利要求15或16的细胞用于制备药物的用途，所述药物用于细胞的移植及/或细胞的再生长，这些细胞属于造血系统和/或属于内皮系统。20.根据权利要求15或16的细胞用于制备药物的用途，所述药物用于治疗恶性病理、先天性非恶性病理和获得性非恶性病理。21.根据权利要求15或16的细胞用于制备药物的用途，所述药物用在基因治疗的特定方案中。22.根据权利要求15或16的细胞用于体外制备自体细胞群体或更小尺寸的组分的用途。23.根据权利要求15或16的细胞用于体外诊断测定的用途。全文摘要本发明涉及一种培养物，其包含生长培养基和细胞因子组合，所述细胞因子组合的构成为i)白介素-6(IL6)；ii)flt3-配体(FLT3)；iii)干细胞因子(SCF)和iv)血小板生成素(TPO)，还涉及该培养物用于离体扩增干细胞及/或亲本细胞和从其分化而来的细胞的用途，以及从所述扩增得到的所述细胞的用途。文档编号C12N5/00GK101743305SQ200880024832公开日2010年6月16日申请日期2008年7月9日优先权日2007年7月16日发明者G·斯尔契亚,L·拉扎伊,P·瑞布拉,R·乔尔达诺,T·蒙特姆罗申请人:Irccs基金会大宫殿医院马焦雷综合诊所