新型GPIIIa基因的制作方法

专利名称：新型GPIIIa基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及新型GPIIIa基因，该基因是用于测定新生儿异体免疫性凝血细胞减 少性紫癜或其发病风险的标记，更具体地，本发明涉及用于检测所述GPIIIa基因中的突变 的装置(means)，和用于该突变的检测方法和检测试剂盒。
背景技术：
血小板粘附于血管疾病部位，然后彼此结合(凝集)形成血栓，并且这些功能由存在于血小板膜上的各种蛋白质控制。已知的此类膜蛋白质的实例包括GPI (糖蛋白I)、 GPIIb (糖蛋白lib)和GPIIIa(糖蛋白Ilia)。关于GPIIIa，从正常人的血小板分离出了编 码GPIIIa蛋白质的全长cDNA，并确定了其基因结构(J. Biol. Chem. 262 (9) p. 3936-3939)。 进一步地，已对存在于这些膜蛋白质上的血小板抗原(HPA-1 7)进行了研究(J.Clin. Invest 40 pl597(1961)、Prog. Hematol. 4 p222(1964)、Vox Sang 4pl61(1959)、Vox Sang 39 pll3(1980))。血小板抗原作为新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫癜(NAITP，neonatal alloimmune thrombocytopenic purpura)、输血后紫癒(post—transfusion purpura)、血 小板输注治疗无效(refractoriness to platelettransfusion therapy)等的原因己为人 所知。在日本人中，据说抗HPA-2b抗体与血小板输注治疗无效有关，且抗HPA-4b抗体与 NAITP有关。因此，血小板抗原的类型在临床上日益变得重要。血小板抗原类型由于数种糖蛋白的多态性(polymorphism)而发生(表1)，该 多态性在蛋白质水平上通过单一氨基酸置换而产生，而在基因水平上通过单一碱基置 换而产生。因此，在基于基因的血小板抗原的分型中，该类单一碱基中的差异被评定
(JapaneseJournal of TransfusionMedicine. Vol. No. 139(1) :204_211，1993)。 然而，还存在未知的血小板抗原类型，目前尚未对其实现充分的阐明。关于HPA-7， 迄今仅报道的基因多态型是HPA-7a，其中GPIIIa基因的第1297位碱基是胞嘧啶(第407 位的氨基酸为脯氨酸)；和HPA-7b，其中基因的第1297位的碱基是鸟嘌呤(第407位的氨 基酸是丙氨酸)(Blood 83 =70-76,1993)。

发明内容
本发明人已在新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫癜(NAITP)的分析中发现了 新型的血小板特异性抗原。具体地，本发明人发现存在于GPIIIa基因的外显子9中的第 1297位的核苷酸残基通常是胞嘧啶，但在患有新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫癜的患 者中，该胞嘧啶被置换成了胸腺嘧啶。进一步地，本发明人发现该置换与新生儿异体免疫 性凝血细胞减少性紫癜相关联(实施例1)。本发明以该发现为基础。本发明的目的在于提供新型的GPIIIa突变基因和蛋白质，用于检测所述基因和 所述蛋白质中的突变的装置，用于所述突变的检测方法和检测试剂盒。根据本发明，提供包含GPIIIa基因的核苷酸序列的多核苷酸，其中该GPIIIa基因 的第1297位的核苷酸残基是胸腺嘧啶残基；或包含该胸腺嘧啶残基的其片段(以下称作 “本发明所述的多核苷酸”)。根据本发明，提供包含GPIIIa蛋白质的氨基酸序列的蛋白质，其中GPIIIa蛋白质 的第407位的氨基酸残基是丝氨酸残基，或包含该丝氨酸残基的其片段(以下称作“本发明 所述的蛋白质”)。
根据本发明，提供可以与本发明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列杂交的引物，且该引物用于通过核酸扩增法来扩增包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基 或与其配对的残基的区域(以下称作“本发明所述的引物”)。根据本发明，提供包含两种以上的本发明所述的引物的引物组(primer set)，其 用于通过核酸扩增法来扩增包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基或与其配对的残基 的区域(以下称作“本发明所述的引物组”)。根据本发明，提供可以与本发明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列杂交 的探针，并且该探针用于GPIIIa基因的第1297位的胸腺嘧啶残基的检测(以下称作“本发 明所述的探针”)。根据本发明，提供抗本发明所述的蛋白质或其片段的抗体(以下称作“本发明所 述的抗体”)。根据本发明，提供通过检测GPIIIa基因的突变来判定新生儿异体免疫性凝血细 胞减少性紫癜或其发病风险的方法，该方法包括使用本发明所述的引物、引物组或探针来 检测GPIIIa基因的第1297位的胸腺嘧啶残基的步骤。进一步地，根据本发明，提供通过检测GPIIIa基因的突变来判定新生儿异体免疫 性凝血细胞减少性紫癜或其发病风险的方法，该方法包括使用本发明所述的抗体来检测 GPIIIa蛋白质的第407位的丝氨酸残基的步骤(以下，上述两种方法合并称作“本发明的 第一实施方式的方法”)。根据本发明，提供通过检测GPIIIa基因的突变来判定血小板输注中血小板输注 治疗无效的发病可能性的方法，该方法包括使用本发明所述的引物、引物组或探针来检测 GPIIIa基因的第1297位的胸腺嘧啶残基的步骤。进一步地，根据本发明，提供通过检测GPIIIa基因的突变来判定血小板输注中血 小板输注治疗无效的发病可能性的方法，该方法包括使用本发明所述的抗体来检测GPIIIa 蛋白质的第407位的丝氨酸残基的步骤(以下，上述两种方法合并称作“本发明的第二实施 方式的方法”)。根据本发明，提供用于判定新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫癜或其发病风险 的试剂盒，其至少包含本发明所述的引物、引物组、探针或抗体。根据本发明，提供用于判定血小板输注中血小板输注治疗无效的发病可能性的试 剂盒，其至少包含本发明所述的引物、引物组、探针或抗体。本发明所述的探针、引物、引物组或抗体可以作为标记用于判定新生儿异体免疫 性凝血细胞减少性紫癜或其发病风险。因此，本发明对新生儿异体免疫性凝血细胞减少性 紫癜的基因诊断等有用。进一步地，本发明所述的探针、引物、引物组或抗体可以作为标记 用于判定血小板输注中血小板输注治疗无效的发病可能性。因此，本发明对血小板输注中 的输注效果的预测等有用。
具体实施例方式[突变基因和突变蛋白质]本发明所述的多核苷酸可以作为竞争杂交中的标记 标准核酸用于检测GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基的突变，即置换为胸腺嘧啶残基 (以下，称作“GPIIIa基因的1297T多态性”(实施例1)。进一步地，它还可以用作所述检测中所用的寡核苷酸探针的核苷酸序列。在本说明书中，“GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基”意指从下述起点计算的 位于第1297位的核苷酸残基，所述起点即第一残基，其是GPIIIa基因中编码信号肽的区域 的起始密码子的腺嘌呤残基。GPIIIa基因的第1至78位构成编码信号肽的区域，GPIIIa基因的第79至2364 位构成编码成熟蛋白质的区域。用于检测GPIIIa基因的1297T多态性的标记标准核酸可以是能够检测GPIIIa基 因中的第1297位的核苷酸残基置换为胸腺嘧啶残基的标记标准核酸，并且也可以是本发 明所述的多核苷酸的片段。具体地，作为本发明所述的多核苷酸的片段，是GPIIIa基因的 核苷酸序列中第1297位的核苷酸残基为胸腺嘧啶残基的多核苷酸的片段，其中所述片段 包含胸腺嘧啶残基。本发明所述的多核苷酸包括选自以下的(i)、(ii)、(iii)和(iv)的多核苷酸(i) 包含SEQ ID NO :1的核苷酸序列的多核苷酸；(ii)下述多核苷酸，该多核苷酸由SEQ ID NO 1的核苷酸序列中插入、置换和/或缺失了一个或多个核苷酸和/或向其一端或两端添 加了一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成，并且该多核苷酸编码与由SEQ IDNO 2的氨基 酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质(前提是在所述多核苷酸中，SEQ ID N0:1的 核苷酸序列的第1297位的核苷酸残基是胸腺嘧啶残基)；(iii)下述多核苷酸，该多核苷酸 在严格条件下与由SEQ ID NO :1的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸杂交，且该多核 苷酸编码与由SEQ ID NO :2的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质(前提是 在所述多核苷酸中，对应于SEQ ID NO :1 核苷酸序列的第1297位的核苷酸残基是胸腺嘧 啶残基)；和(iv)下述多核苷酸，该多核苷酸与由SEQ ID NO :1的核苷酸序列组成的多核 苷酸具有70%以上的同一性，且该多核苷酸编码与由SEQ IDNO 2的氨基酸序列组成的蛋 白质具有同等功能的蛋白质(前提是在所述多核苷酸中，对应于SEQ ID NO :1的核苷酸序 列的第1297位的核苷酸残基是胸腺嘧啶残基)。SEQ ID NO=I的核苷酸序列的第1至78位的序列是编码信号肽的序列(GenBank 登录号NM_000212)。在本发明中，编码信号肽的序列并不局限于该序列，只要它可以编码能 够起信号肽功能的肽即可。本发明所述的多核苷酸优选为编码下述蛋白质的多核苷酸，所述蛋白质由SEQ ID NO :2的氨基酸序列组成或者由其一部分组成，该部分包含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的第 407位的氨基酸残基。在本发明中，当SEQ ID NO :2的氨基酸序列给定时，编码其的核苷酸序列可容易地 被确定，且可选择各种编码SEQ ID NO :2的氨基酸序列的核苷酸序列。因此，编码由SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸，除了 SEQ ID NO 1的DNA序列的部分或全部之外，还意指编码同一氨基酸的DNA序列，其具有存在简并 关系的密码子作为DNA序列。本发明进一步包括与这些序列对应的RNA序列。编码由SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成的蛋白质的多核苷酸的优选实例包括由 SEQ ID NO 1的核苷酸序列组成的多核苷酸。在本说明书中，蛋白质是否与 由SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成的蛋白质具有同 等功能，可以通过评价与由SEQ ID NO :2的氨基酸序列组成的蛋白质的表达相关的生物学现象或功能来确定。本发明所述的多核苷酸优选为，由SEQ ID NO 1的核苷酸序列组成的多核苷酸或包含SEQ ID NO 1的第1297位的核苷酸残基的其片段。本发明所述的多核苷酸更优选为， 至少包含由SEQ ID NO 7的核苷酸序列(SEQ ID NO 1中的第1201至1391位的核苷酸序 列)组成的多核苷酸的多核苷酸。本发明所述的多核苷酸进一步优选为，至少包含由SEQ IDNO 3的核苷酸序列(SEQ ID NO=I中的第1281至1320位的核苷酸序列)组成的多核苷 酸的多核苷酸。本发明所述的蛋白质可作为抗原用于制备下述抗体，该抗体能够检测GPIIIa蛋 白质的第407位的氨基酸残基的突变，即，置换为丝氨酸残基(以下称为“GPIIIa蛋白质的 407S多态性”)。在本说明书中，“GPIIIa蛋白质的第407位的氨基酸残基”意指从起点计算位于第 407位的氨基酸残基，所述起点即是第一残基，其是构成GPIIIa成熟型蛋白质的氨基酸序 列中的N末端的甘氨酸残基。“GPIIIa成熟型蛋白质”是指，由GPIIIa基因的第79至2364位的核苷酸序列编 码的蛋白质，其不包含信号肽。例如，它是由SEQ ID NO :6的氨基酸序列组成的蛋白质。本发明所述的蛋白质包括选自以下(V)、(vi) , (vii)和(viii)的蛋白质(ν)包 含SEQ ID NO :2的氨基酸序列的蛋白质；(vi)下述蛋白质，该蛋白质由SEQ ID NO :2的氨 基酸序列中插入、置换和/或缺失了一个或多个氨基酸和/或向其一端或两端添加了一个 或多个氨基酸的氨基酸序列组成，并且该蛋白质与由SEQ ID NO :2的氨基酸序列组成的蛋 白质具有同等功能(前提是SEQ ID NO 2的氨基酸序列的第407位的氨基酸残基是丝氨 酸残基)；(vii)由下述多核苷酸编码的蛋白质，该多核苷酸在严格条件下，与由编码SEQ ID NO 2的氨基酸序列的多核苷酸的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸杂交，且所述 蛋白质与由SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能(前提是对应于SEQ ID NO :2的氨基酸序列的第407位的氨基酸残基的氨基酸残基是丝氨酸残基)；和(viii) 下述蛋白质，该蛋白质由与SEQ ID NO :2的氨基酸序列具有70%以上的同一性的氨基酸序 列组成，且该蛋白质与由SEQ ID NO :2的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能(前提是 对应于SEQ ID NO :2的氨基酸序列的第407位的氨基酸残基的氨基酸残基是丝氨酸残基)。本发明所述的蛋白质优选为，由SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成的蛋白质或包含 SEQ ID NO :2的第407位的氨基酸残基的其片段。本发明所述的蛋白质更优选为，至少包 含由SEQ ID NO 8的氨基酸序列(SEQ IDNO :2中的第381至450位的氨基酸序列)组成的 多肽的蛋白质(多肽)。本发明所述的蛋白质进一步优选为，至少包含由SEQ ID N0:4的 氨基酸序列(SEQ ID NO 2中的第395至420位的氨基酸序列)组成的多肽的蛋白质(多 肽)。用于制备能够检测GPIIIa蛋白质的407S多态性的抗体的抗原，可以是能够检测 GPIIIa蛋白质中的第407位的氨基酸残基向丝氨酸残基的置换的抗原，并且也可以是本发 明所述蛋白质的片段(肽)。具体地，本发明所述的蛋白质的片段，是GPIIIa蛋白质的氨基 酸序列中第407位的氨基酸残基是丝氨酸残基的蛋白质的片段，其中所述片段包含丝氨酸残基。本发明所述的蛋白质的片段是具有至少6个氨基酸残基的多肽(例如，8、10、12或15个氨基酸残基以上)。在本发明中，“GPIIIa基因”已知为编码血小板膜蛋白的基因，且已经以GenBank 登录号M35999(SEQ ID NO :5 (碱基序列)，SEQ IDNO :6 (氨基酸序列))或登录号NM_000212登记。
GPIIIa基因不仅包括以下(i')的多核苷酸，还包括选自以下(ii ‘ )、(iii') 和(iv')的同源多核苷酸(i')包含SEQ ID NO :5的核苷酸序列的多核苷酸；(ii ‘) 下述多核苷酸，该多核苷酸由SEQ ID NO :5的核苷酸序列中插入、置换和/或缺失了一个或 多个核苷酸和/或向其一端或两端添加了一个或多个核苷酸的核苷酸序列组成，并且该多 核苷酸编码与由SEQ IDNO :6的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质；(iii') 下述多核苷酸，该多核苷酸在严格条件下与由SEQ ID NO :5的核苷酸序列的互补序列组成 的多核苷酸杂交，且该多核苷酸编码与由SEQ ID NO :6的氨基酸序列组成的蛋白质具有同 等功能的蛋白质；和(iv')下述多核苷酸，该多核苷酸与由SEQ ID NO 5的核苷酸序列组 成的多核苷酸具有70%以上的同一性，且该多核苷酸编码与由SEQ IDNO 6的氨基酸序列 组成的蛋白质具有同等功能的蛋白质。SEQ ID NO 5的核苷酸序列的第1至78位的序列是编码信号肽的序列(GenBank 登录号NM_000212)。在本发明中，编码信号肽的序列并不局限于该序列，只要它可以编码能 够起信号肽功能的肽即可。GPIIIa基因优选为包含SEQ ID NO 5的核苷酸序列的多核苷酸。进一步地，GPIIIa基因优选为编码包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的蛋白质的多 核苷酸。作为GPIIIa蛋白质，除了以下(ν')的蛋白质之外，还提供选自(vi ‘ )>(vii') 和(viii')的同源蛋白质(多肽)(v')包含SEQ ID NO :6的氨基酸序列的蛋白质； (vi')下述蛋白质，该蛋白质由SEQ ID NO :6的氨基酸序列中插入、置换和/或缺失了一个 或多个氨基酸和/或向其一端或两端添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成，并且该 蛋白质与由SEQ ID NO 6的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能；(vii')由下述多核 苷酸编码的蛋白质，该多核苷酸在严格条件下与由编码SEQ ID NO :6的氨基酸序列的多核 苷酸的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸杂交，且所述蛋白质与由SEQ ID N0:6的氨 基酸序列组成的蛋白质具有同等功能；和(viii')下述蛋白质，该蛋白质由与SEQ ID NO 6的氨基酸序列具有70%以上的同一性的氨基酸序列组成，且该蛋白质与由SEQ ID NO 6 的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能。GPIIIa蛋白质优选为由SEQ ID NO 5的核苷酸序列编码的蛋白质。进一步地，作为GPIIIa蛋白质，更优选地提供包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的 蛋白质。在本说明书中，“插入、置换和/或缺失了一个或多个核苷酸和/或向其一端或两 端添加了一个或多个核苷酸”以及“插入、置换和/或缺失了一个或多个氨基酸和/或向其 一端或两端添加了一个或多个氨基酸”意指，已经通过位点定向诱变等公知的技术方法，或 者通过可以自然发生程度的多个核苷酸或氨基酸的置换等，进行了改变。待改变的核苷酸 或氨基酸的数目可以是例如1至30个，优选1至20个，更优选1至10个，还更优选1至4 个，尤其优选1至2个的插入、置换或缺失，和/或向一端或两端的添加。
本发明所述的多核苷酸的经改变的核苷酸序列是，对GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基不产生影响的经改变的核苷酸序列，且可以优选为具有一个或多个(例如，一 个或几个，或1、2、3或4个)突变的本发明所述的多核苷酸的核苷酸序列，其中所述突变不 影响由SEQ IDNO 2的氨基酸序列组成的蛋白质的功能。GPIIIa基因的经改变的核苷酸序列可优选为，具有一个或多个(例如，一个或几 个、或1、2、3或4个)突变的GPIIIa基因的核苷酸序列，其中所述突变不影响由SEQ ID NO 6的氨基酸序列组成的蛋白质的功能。本发明所述的蛋白质的经改变的氨基酸序列是，对GPIIIa蛋白质的第407位的氨 基酸残基不产生影响的经改变的氨基酸序列，且可以优选为具有一个或多个(例如，一个 或几个，或1、2、3或4个)保守置换的SEQ ID NO :2中所示的本发明所述的蛋白质的氨基 酸序列。GPIIIa蛋白质的经改变的氨基酸序列可以优选为，具有一个或多个(例如，一个 或几个，或1、2、3或4个)保守置换的SEQ ID NO :6中所示的GPIIIa蛋白质的氨基酸序 列。在本说明书中，“保守置换(一个或多个)”意指，一个或多个氨基酸残基被其化学 相似的氨基酸残基(一个或多个)置换以使蛋白质的功能实质上不被改变。其实例包括下 述情形某疏水性残基被另一个疏水性残基置换的情形；某极性残基被另一个具有相同电 荷的极性残基置换的情形。此类可被置换的功能相似的氨基酸(一个或多个)，对每一氨 基酸而言是为本领域公知的。作为非极性(疏水性)氨基酸，其具体实例包括丙氨酸、缬氨 酸、异亮氨酸、亮氨酸、脯氨酸、色氨酸、苯丙氨酸和蛋氨酸。极性(中性)氨基酸的实例包 括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天门冬酰胺和半胱氨酸。具有正电荷的(碱 性)氨基酸的实例包括精氨酸、组氨酸和赖氨酸。具有负电荷的(酸性)氨基酸的实例包 括天门冬氨酸和谷氨酸。在本说明书中，“杂交”意指在严格条件下与目标多核苷酸杂交，而不与该目标核 苷酸之外的核苷酸杂交。所述“严格条件”可基于探针序列或引物序列及其互补链所形 成的双链的熔解温度(°c)、以及溶液的盐浓度等来决定。在选择探针序列或引物序列之 后设置合适的严格条件是本领域技术人员所熟知的技术(例如，Molecular Cloning 2nd edition, ColdSpring Harbor Laboratory(1989))。杂交可根据已知方法进行。在使用市售文库的情形中，其可根据附于其中的使用 说明书中记载的方法来进行。在本说明书中，关于碱基序列或氨基酸序列的术语“同一性”意指，待比较的序列 之间、构成各序列的碱基或氨基酸残基的一致程度。在本说明书中所示的每一“同一性”的 数值，可以是通过本领域技术人员已知的同源性检索程序算出的数值，并且可通过FASTA、 BLAST等、使用默认(初始设定)参数而容易地算出。与SEQ ID NO 2的氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸序列可以是优选与 其具有80 %以上，更优选85 %以上，还更优选90 %以上，还更优选95 %以上，特别优选98 % 以上，且最优选99 %以上的同一性的氨基酸序列。与SEQ ID NO :6的氨基酸序列具有70%以上同一性的氨基酸序列可以是优选与 其具有80 %以上，更优选85 %以上，还更优选90 %以上，还更优选95 %以上，特别优选98 %以上，且最优选99%以上的同一性的氨基酸序列。在本发明中，当SEQ ID NO :6的氨基酸序列给定时，编码其的核苷酸序列可容易地 被确定，且可选择各种编码SEQ ID NO :6的氨基酸序列的核苷酸序列。因此，编码包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸，除了 SEQ ID NO 5的DNA序列的部分或全部之外，还意指编码同一氨基酸的DNA序列，其具有存在简并关系 的密码子作为DNA序列。本发明进一步包括与这些序列对应的RNA序列。 编码包含SEQ ID NO 6的氨基酸序列的蛋白质的多核苷酸的优选实例包括包含 SEQ ID NO :5的核苷酸序列的多核苷酸。在本说明书中，蛋白质是否与由SEQ ID NO 6的氨基酸序列组成的蛋白质具有同 等功能，可以通过评价与由SEQ ID NO :6的氨基酸序列组成的蛋白质的表达相关的生物学 现象或功能来确定。根据本发明，提供由包含GPIIIa基因的核苷酸序列的多核苷酸的核苷酸序列的 互补序列组成的多核苷酸，其中所述GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基是胸腺嘧啶残 基，或者提供包含与该胸腺嘧啶残基配对的残基的其片段。[引物和引物组]本发明所述的引物可以与本发明所述的多核苷酸特异性地杂 交，以通过核酸扩增法来扩增包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基或与其配对的残 基的区域。因此，本发明所述的引物可被用作标记用于判定新生儿异体免疫性凝血细胞减 少性紫癜或其发病的风险。进一步地，本发明所述的引物可用作标记用于判定血小板输注 中血小板输注治疗无效发病的可能性。本发明所述的引物意指，由脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等构成的引物， 且优选由DNA构成的引物。本发明所述的引物可以通过核酸扩增法，来扩增本发明所述的多核苷酸的核苷酸 序列或其互补序列中包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基或与其配对的残基的区 域。其实例包括由下述多核苷酸组成的那些，所述多核苷酸具有本发明所述的多核苷酸的 核苷酸序列或其互补序列中的至少10个，优选至少15个，更优选至少20个，进一步优选至 少21个连续核苷酸残基。进一步地，本发明所述的引物的实例包括由下述多核苷酸组成的 那些，该多核苷酸具有本发明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列中的10至30个， 12至30个，15至30个，20至30个，或21至30个连续核苷酸残基。进一步地，本发明所述的引物可以是能够与本发明所述的多核苷酸的核苷酸序列 或其互补序列中包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基或与其配对的残基的区域进行 杂交的引物。此处，包含本发明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列中的连续核苷酸的 多核苷酸，可以起本发明所述的引物的作用，并且其实例也包括下述经改变的多核苷酸，该 经改变的多核苷酸包含本发明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列中的连续核苷 酸中导入了一个或多个(例如1、2、3或4个)对GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基不 产生影响的突变(其可选自例如插入、置换、缺失和添加)的核苷酸。经改变的多核苷酸的 实例包括包含SEQ ID NO 1的核苷酸序列或其互补序列中的至少12至30个连续核苷酸 中导入了一个或多个突变的核苷酸、且作为本发明所述的引物起作用的多核苷酸。本发明所述的引物的长度可以是至少10个碱基，且优选至少15个碱基，更优选至少20个碱基，还更优选至少21个碱基。进一步地，本发明所述的引物长度为12至30个碱 基，20至30个碱基，或21至30个碱基。根据本发明所述的引物的优选实施方式，提供具有12至30个碱基长度的引物，其 由具有至少10个(更优选至少15个，更优选至少20个，还更优选至少21个)本发明所述 的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列中的连续核苷酸的多核苷酸组成；该引物可通过核 酸扩增法来扩增包含GPIIIa基因的核苷酸序列中的第1297位的核苷酸残基的区域，并且 该引物被用于GPIIIa基因的1297T多态性的检测。本发明所述的引物也可以用作引物组，该引物组包含两种或更多种本发明所述的 引物的组合。本发明所述的引物组能以下述方式选择，以便本发明所述的多核苷酸的核苷酸序 列或其互补序列中，包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基或与其配对的残基的区域 可以通过核酸扩增法来扩增。核酸扩增法是已知的，且本领域技术人员可选择适用于核酸 扩增的引物对。例如，在PCR方法中，可以按下述方式选择引物，以便两个引物中的一个与 GPIIIa突变基因的正链配对，另一个引物与GPIIIa突变基因的负链配对，且由一个引物延 伸的延伸链为另一个引物所配对。进一步地，在LAMP方法(W0 00/28082)中，相对于目的 基因，分别定义了自3'端起的三 个区域，即F3c、F2c和Flc;以及自5'端起的三个区域， 即Bi、B2和B3，这六个区域可用于设计四种引物。本发明所述的引物和引物组，可根据常规方法，用作已知核酸扩增法比如PCR 方法(Saiki，R. K.，Bugawan, T. L.，etal. (1986)Nature,324,163-166)、NASBA 方法 (Comptom, J. (1991)Nature，650，91-92)、TMA 方法(Kacian, D. L.，和 Fultz, T. J. (1995) US. Patent5, 399，491)、SDA 方法(Walker, G. Τ.，Little, Μ. C.，et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA，89，392-396)或 PCR-SSCP 方法(Orita，Μ.，Iwahara, H.，eal. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA，86，2776-2770)中的引物和引物组。本发明所述的引物可以以本说明书中所公开的核苷酸序列为基础而化学合成。引 物的制备是公知的，且可根据常规方法进行。[探针]本发明所述的探针与本发明所述的多核苷酸特异性地杂交，且可以检测 GPIIIa基因的1297T多态性。因此，本发明所述的探针可以用作标记用于判定新生儿异体 免疫性凝血细胞减少性紫癜和/或其发病风险。进一步地，本发明所述的探针可用作标记 用于判定血小板输注中血小板输注治疗无效的发病可能性。本发明所述的探针意指由脱氧核糖核酸(DNA)、核糖核酸(RNA)等构成的探针，且 优选为由DNA构成的探针。本发明所述的探针的实例包括能够与本发明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其 互补序列中包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基或与其配对的残基的区域进行杂交 的探针。本发明所述的探针的实例包括由包含本发明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其 互补序列中的至少10个、优选至少14个、更优选至少15个、还更优选至少16个连续核苷 酸残基的多核苷酸构成的探针。进一步地，本发明所述的探针的实例包括由包含本发明所 述的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列中的10至20个、12至20个、14至20个、15至 20个、16至20个、10至30个、12至30个、14至30个、15至30个、或16至30个连续核苷酸残基的多核苷酸构成的探针。此处，包含本发明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列中的连续核苷酸的 多核苷酸，可以作为本发明所述的探针起作用，并且其实例也包括下述经改变的多核苷酸， 该经改变的多核苷酸包含本发明所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列中的连续核 苷酸中导入了一个或多个(例如1、2、3或4个)对GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基 不产生影响的突变(其可选自例如插入、置换、缺失和添加)的核苷酸。经改变的多核苷酸 的实例包括下述多核苷酸，该多核苷酸包含SEQ IDNO=I的核苷酸序列或其互补序列中的 至少12至30个连续核苷酸中导入了一个或多个突变的核苷酸，且所述多核苷酸作为本发 明所述的探针起作用。本发明所述的探针的长度为至少10个碱基。进一步地，本发明所述的探针的长度 为12至30个碱基。根据本发明所述的探针的优选实施方式，提供具有12至30个碱基长度的探针和 引物，其由包含至少10个(更优选为至少15个)本发明所述的多核苷酸的核苷酸序列或 其互补序列中的连续核苷酸的多核苷酸构成，且其可以与包含GPIIIa基因的核苷酸序列 中的第1297位的核苷酸残基的区域杂交，并且所述探针和引物用于GPIIIa基因的1297T 多态性的检测。本发明所述的探针可以按照常规方法，作为探针用于Northern印迹方法、 Southern印迹方法或原位杂交方法等已知的方法中。本发明所述的探针可以以本说明书中所公开的核苷酸序列为基础而化学合成。引 物的制备是公知的，且可根据常规方法进行。[抗体]本发明所述的抗体可以特异性地识别本发明所述的蛋白质，且可以检测 GPIIIa蛋白质的407S多态性。因此，本发明所述的抗体可以用作标记用于判定新生儿异体 免疫性凝血细胞减少性紫癜或其发病风险。进一步地，本发明所述的抗体可用作标记用于 判定血小板输注中血小板输注治疗无效的发病可能性。根据本发明所述的抗体的优选实施方式，提供识别下述区域的抗体，该区域包含 本发明所述的蛋白质的氨基酸序列中的GPIIIa蛋白质的第407位的氨基酸残基。通过使 用这种抗体，可以检测GPIIIa蛋白质的407S多态性。这种抗体的实例包括对抗下述蛋白 质的抗体，所述蛋白质包含具有SEQ ID NO :2的氨基酸序列中的第407位的氨基酸残基的 至少6个氨基酸残基。对抗本发明所述的蛋白质的抗体的实例包括对抗具有SEQ IDNO 2的氨基酸序 列或其一部分的蛋白质的抗体。本发明所述的抗体的实例包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、单链抗体 (scFv)、人源化抗体、多特异性抗体、和抗体片段比如Fab、Fab'、F(ab' )2、Fc和Fv。本发明所述的抗体可以使用本领域技术人员所熟知的方法获得。[检测方法]GPIIIa基因的核苷酸序列中，第1297位的核苷酸残基向胸腺嘧啶残 基的置换，可以为新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫癜或其发病风险的指标。因此，根据 本发明，新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫癜或其发病风险可以通过检测GPIIIa基因 的1297T多态性来判定。存在下述可能性，即 GPIIIa基因中第1297位的核苷酸残基被置换为胸腺嘧啶残基的血小板抗原(HPA-7抗原)会由于抗原的差异而在血小板输注时引起血小板输注治疗无效。因此，该置换可以是血小板输注中是否发生血小板输注治疗无效的指标，即血小板输 注中输注效果的指标。因此，根据本发明，血小板输注中血小板输注治疗无效的发病可能性 可以通过检测GPIIIa基因的1297T多态性而判定。本发明所述的检测方法没有特别限定，只要它能检测试验样品中的GPIIIa基因 的1297T多态性或GPIIIa蛋白质的407S多态性即可，并且其实例包括杂交方法、核酸扩增 法和抗原-抗体反应法。此处，“试验样品”可以包含下述区域，该区域含有GPIIIa基因的第1297位的核 苷酸残基或者GPIIIa蛋白质的第407位的氨基酸残基，并且该样品可通过从待试验人(对 象)提取基因、mRNA或蛋白质而获得。mRNA可以在使用前根据需要转换为cDNA。在本说 明书中，“基因”同样包括这种cDNA。此处，“对象”除了新生儿，还可以是该新生儿的血亲亲属。本发明的有利方面在于 可在出生以前判定新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫癜的发病风险。对象的基因、mRNA或蛋白质可以从人体中的任何细胞提取，且所述细胞优选为白 细胞。根据本发明，提取的基因或mRNA可以直接用于限制性片段长度多态性方法(RFLP 方法)(Southerns，Ε. Μ. (1975) J. Mol. Biol. 98，503)、等位基因特异的寡核苷酸探针法 (AS0 方法)(Wallace，R. B.，Schaffer，N. J.，etal. (1979) Nucleic Acid Res.，6，3543)或 寡核苷酸连接分析法，以检测所述GPIIIa基因的1297T多态性。根据本发明所述的检测方法，试验样品中的GPIIIa基因的1297T多态性可以通 过下述方式来检测使用本发明所述的引物或引物组，利用核酸扩增法来扩增核酸样品 (mRNA或其逆转录产物)，并分析该扩增产物。利用核酸扩增法检测GPIIIa基因的1297T多态性，例如可以通过以下步骤来进 行(c)将来源于试验样品的多核苷酸作为模板，使用本发明所述的引物或引物组来施行 核酸扩增法；和(d)分析所形成的扩增产物。在步骤(c)中，可以使用由试验样品制备的mRNA或由该mRNA逆转录的互补DNA 作为模板。基因扩增可以使用核酸扩增法进行，比如PCR方法(Saiki，R. K.，Bugawan, T. L.， et al. (1986) Nature，324，163-166)、NASBA 方法(Comptom, J. (1991) Nature，650，91-92)、 TMA 方法(Kacian，D. L.，and Fultz, Τ. J. (1995)US. Patent 5,399, 491)或 SDA 方法 (Walker, G. Τ.，Little, Μ. C.，et al (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89，392-396)。通过这些方法扩增的基因，根据其扩增产物的特征可以用来检测GPIIIa基因的 1297T多态性。例如，对于用PCR方法扩增的片段，通过碱基序列确定方法可以容易地确定 核苷酸序列，并且由此可以确定GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基是否是胸腺嘧啶。通过PCR的基因扩增也可使用识别一个碱基差异的PCR-SSCP方法(Orita，Μ.， Iwahara,H. , et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86, 2776-2770)来进行。PCR-SSCP 方 法是下述方法，该方法中通过PCR扩增的核酸片段被热变性为单链后，在恒定温度下使用 非变性聚丙烯酰胺凝胶分离。所述方法可以通过将核苷酸片段的差异所致的高级结构的形 成中的差异作为电泳迁移率中的差异来评价而检测一个碱基的差异。
通过其它PCR方法扩增的片段，可以通过限制性片段长度多态性方法(RFLP方法) (Southerns, Ε. Μ. (1975) J. Mol. Biol. 98，503)、等位基因特异的寡核苷酸探针法(AS0方 法)(Saiki,R. K,Bugawan,T. L.，et al, (1986)Nature，324，163-166)、寡核苷酸连接分析法 (Landegren, U, Kaiser, R. , etal. (1990)PCR Protocols, Academic Press, Inc. p92_98)、 PCR-PHFA 方法(Oka, Τ. , Matsunaga, H, et al. (1994) Nucleic Acids Res. 22，1541-1547)、 PCR-rSSO 方法(Kawai,S. , et al, (1994)Hum Immunol, 41 (2), 121-126)等来分析。在同时 处理多个样品时，优选PCR-PHFA方法或PCR-rSSO方法。根据本发明所述的检测方法，可以通过使用能够与本发明所述的多核苷酸的核苷 酸序列或其互补序列中包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基或与其配对的残基的区 域杂交的本发明的引物或引物组，通过核酸扩增法扩增核酸样品(mRNA或其逆转录产物)， 并检测该扩增产物，从而检测试验样品中的GPIIIa基因的1297T多态性。根据本发明所述的第一实施方式，第1297位的核苷酸残基被确定为胸腺嘧啶的 对象，由于被评价为检测到了 GPIIIa基因的1297T多态性，因此可以被诊断或判定为患有 新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫癜的患者或具有其发病风险。根据本发明所述的方法的第二实施方式，第1297位的核苷酸残基被确定为胸腺 嘧啶的对象，由于被评价为检测到了 GPIIIa基因的1297T多态性，因此可被诊断或判定为 具有血小板输注中血小板输注治疗无效发病可能性。 根据本发明所述的检测方法，可以通过将本发明所述的探针与核酸样品(mRNA或 其逆转录产物)杂交，并检测杂交复合物即双链核苷酸，来检测试验样品中的GPIIIa基因 的1297T多态性。对于杂交方法的详细步骤，可以参照Nucleic Acid hybridization BiosScientific Publishers(1999)。利用杂交方法检测GPIIIa基因的1297T多态性，例如可以通过以下步骤来进行 (a)使来自试验样品的多核苷酸与本发明所述的探针接触；和(b)检测杂交复合物。在步骤(a)中，可以将从试验样品制备的mRNA或从该mRNA逆转录得到的互补 DNA(cDNA)作为来自待试验细胞样品的多核苷酸，与所述探针接触。在使用探针的检测方法中，探针可以被标记。标记的实例包括使用放射性物质、酶 和荧光物质的标记。杂交产物的检测可以利用熟知的方法比如Northern杂交、Southern杂交或菌落 杂交来进行。根据本发明所述的第一实施方式，第1297位的核苷酸残基被确定为胸腺嘧啶的 对象，由于被评价为检测到了 GPIIIa基因的1297T多态性，因此可以被诊断或判定为患有 新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫癜的患者或具有其发病风险。根据本发明所述的方法的第二实施方式，第1297位的核苷酸残基被确定为胸腺 嘧啶的对象，由于被评价为检测到了 GPIIIa基因的1297T多态性的评价，因此可被诊断或 判定为具有血小板输注中血小板输注治疗无效发病可能性。根据本发明所述的检测方法，可以通过使本发明所述的抗体与试验样品接触，并 检测抗原_抗体反应，来检测该试验样品中的GPIIIa蛋白质的407S多态性。使用抗原-抗体反应的GPIIIa蛋白质的407S多态性的检测，例如可以通过以下步骤来进行(e)使来自试验样品的蛋白质与本发明所述的抗体接触；和(f)检测抗原-抗 体复合物。检测抗原-抗体反应的方法是本领域技术人员所熟知的，例如，被认为包含多巴 胺分泌(dopamine-producing)神经细胞增殖前体细胞的待试验细胞样品中的GPIIIa蛋白 质，可以通过免疫学方法检测。对于所述免疫学方法，可以对已经根据需要进行了适当处理 (比如细胞的分离和提取操作)的细胞样品施用以前已知的方法比如免疫组织染色方法、 酶免疫测定法、Western印迹方法、凝集法、竞争法或夹心法。免疫组织染色法例如可以通 过使用标记抗体的直接法、或使用对抗该抗体的标记抗体的间接法来进行。作为标记试剂， 可以使用已知的标记物质比如荧光物质、放射性物质、酶、金属和染料。 根据本发明所述方法的第一实施方式，检测到抗原-抗体复合物的对象，由于被 评价为检测到了 GPIIIa蛋白质的407S多态性，因此可被诊断或判定为患有新生儿异体免 疫性凝血细胞减少性紫癜的患者或具有其发病风险。根据本发明方法所述的第二实施方式，检测到抗原-抗体络合物的对象，由于被 评价为检测到了 GPIIIa蛋白质的407S多态性，因此可以被诊断或判定为具有血小板输注 中血小板输注治疗无效的发病可能性。[检测试剂盒]根据本发明，提供用于进行本发明所述的检测方法的试剂盒。用于进行本发明所述的检测方法的检测试剂盒的实例包括，用于检测GPIIIa基 因的1297T多态性的试剂盒，其至少包含本发明所述的探针、引物或引物组。进一步地，用 于进行本发明所述的检测方法的检测试剂盒的实例包括，用于检测GPIIIa蛋白质的407S 多态性的试剂盒，其至少包含本发明所述的抗体。本发明所述的探针、引物、引物组和抗体可以是经标记的那些。至少包含本发明所述的探针的本发明所述的检测试剂盒，通过杂交方法来检测 GPIIIa基因的1297T多态性。根据需要，本发明所述的试剂盒可以进一步地包含用于进行杂交方法的各种试 齐U，比如用于检测标记的底物；杂交缓冲液；说明书；和/或仪器。至少包含本发明所述的引物或本发明所述的引物组的本发明所述的检测试剂盒， 通过核酸扩增法来检测GPIIIa基因的表达。根据需要，本发明所述的试剂盒可以进一步地包含用于进行核酸扩增法的各种试 齐U，比如缓冲液；指示PCR可正常进行的内标；说明书；和/或仪器。至少包含本发明所述的抗体的本发明所述的检测试剂盒，通过检测抗原-抗体反 应来检测GPIIIa蛋白质的407S多态性。根据检测方法的第三实施方式，本发明所述的试剂盒可以进一步地包含用于进行 抗原-抗体反应的各种试剂，比如用于ELISA法等的第二抗体；染色剂；缓冲液；说明书；和 /或仪器。
实施例现在本发明将借助于实施例具体地描述，但本发明例如引物序列、探针序列等并 不受其限定。实施例1 :GPIIIa(HPA-7)基因中的多态性和新生儿异体免疫性凝血细胞减少性^M^Mffi^关于被诊断为新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫癜(NAITP)的患儿，预 测包含在母亲血清中的抗体将与患儿的血小板反应。因为该患儿是第二个孩子，故认为在 第一个孩子的妊娠期间对来源于父亲的血小板特异性抗原产生敏化的母亲，获得了对抗该 抗原的抗体产生能力，并且患儿的血小板受到在第二个孩子的妊娠期间产生的抗体的侵 袭。因为患儿的血小板特异性抗原源自于父亲，故通过MPHA方法证实了患儿和其母亲的 血清对父亲的血小板的反应性(Japanese Journal of Transfusionand Cell Therapy, Vol. 52. No. 652(6)678-683，2006)。首先，将父亲的血小板固定于微孔板的孔上，然后使该血小板与患儿和母亲的血 清，以及其稀释液反应。将反应物与涂覆有人IgG抗体的羊红细胞反应，并观测生成的凝集 图像。结果，分别为至多1024倍和16倍稀释的母亲血清和患儿血清显示了对父亲血小 板的阳性反应。然后，使用PCR-PHFA方法分析了血小板抗原基因的类型(W098/02574)。结果，观测到了不相容性，因为血小板抗原之中，对于HPA-2，母亲具有(a-b+)， 父亲具有(a+b_)且患儿具有(a+b+)；而对于HPA-3，母亲具有(a+b_)，父亲和患儿具有 (a+b+)。然而，对于HPA-1、4、5和6的血小板抗原类型，观测到了相容性，因为父母和患儿 均具有(a+b_)。另一方面，对于HPA-7，与之前报道的用于HPA-7a和HPA_7b的标准DNAs 通过PHFA方法比较，结果显示所用个体中均存 在HPA-7a基因，而不存在HPA_7b基因。来源于父亲的血小板特异性抗原被认为存在于患儿中。因此，检查了父亲的血小 板对已知抗体的反应性，虽然该血小板对HPA-I至HPA-6抗体为阴性，但是对HPA-7b抗体 却显示反应性。此处，因为父亲的血小板与HPA-7b抗体反应，故预测到GPIIIa基因之中对 应于HPA-7的区域中的某碱基的置换。基于该考虑，使用以下引物扩增了父亲染色体DNA 中的GPIIIa基因的外显子9，并且使用Wizard Plus SV Gel与PCRClean系统纯化了扩 增产物，然后将其连接到pT7Blue-T载体(由Novagen制造)中并导入E. coli JM109株 (由 TAKARA 制造)中。WHPA7-A :5，-TCCAGAGCTGGAGTGTTAACTG(SEQ ID NO :9)WHPA7_B 5，-CTGGCAGGCACAGTCACAATC (SEQ ID N0:10)培养获得的白色菌落然后纯化质粒，随后使用M13-R18引物(由TAKAEA制造)进 行测序，以确认克隆区域的碱基序列。测序使用BigDyeterminator ver. 1. 1 (由Applied Biosystems制造)来进行。测序结果如表2所示。HPA_7a表示HPA_7a基因，HPA_7b表示
HPA-7b基因，且HPA-7新表示不同于HPA_7a基因和HPA_7b基因的新型基因。如表2和表3中所示，确认了GPII工a基因的第1297位的碱基是胸腺嘧啶，且由该基因产生的蛋白质的第407位的氨基酸是丝氨酸的基因(HPA一7新)(SEQ工D N。7(碱基序列)，SEQ ID N0:8(氨基酸序列))。关于HPA-7基因，作为基因多态性，迄今已经报道了 GPIIIa基因的第1297位的碱基是胞嘧啶、第407位的氨基酸是脯氨酸的HPA-7a基因；和 GPIIIa基因的第1297位的碱基是鸟嘌呤、第407位的氨基酸是丙氨酸的HPA_7b基因，但此 次确认的基因被证实具有不同于它们的新序列。实施例2 通过PCR-PHFA方法构津HPA-7的新型等位基因检测系统现在将描沭通 过PCR-PHFA方法构建HPA-7的新型等位基因检测系统。在PHFA方法中，将用非标记引物 扩增样品所得的产物(样品DNA)和用标记引物扩增相同区域所得的产物(标准DNA) —起 混合，并热变性，然后基于在温度梯度下退火时产生的链置换的程度来检测样品DNA和标 准DNA的序列是否相同。(1)标记标准DNA的制备使用以下引物，扩增分别整合了 HPA_7a基因、HPA_7b基 因和实施例1中所确认的新型等位基因(HPA-7新)的质粒，以制备一端标记有DNP(二硝基 苯基)而另一端标记有生物素的PCR产物，将该产物分别用作HPA-7a、HPA-7b和HPA-7新的 标准 DNA。DNP-WHPA7-A 5' -TCCAGAGCTGGAGTGTTAACTG (SEQ ID NO 11)生物素-WHPA7-B 5’ -CTGGCAGGCACAGTCACAATC(SEQ ID NO 12)(2)样品DNA的制备使用以下非标记引物通过PCR扩增分别整合了 HPA_7a、 HPA-7b和HPA-7新的质粒，以获得样品DNA。进一步地，使用相同引物扩增事先已知基因 型的染色体 DNA 以获得样品 DNA。WHPA7-A :5，-TCCAGAGCTGGAGTGTTAACTG (SEQ ID NO 9) WHPA7-B :5’ -CTGGCAGGCACAGTCACAATC(SEQ ID NO 10)(3)竞争杂交使用30 μ 1的3XSSC(终浓度)，将两端具有标记的1 μ 1标准DNA和 20 μ 1的样品DNA混合，并将所得混合物在98°C下加热10分钟，以将DNA变性为单链。将 混合物按l°c /10分钟的速度渐渐冷却至70°C以退火。此时，具有完全匹配序列的互补链， 相较于具有误配(一个或多个)的那些优先地重新构建。即，在具有完全相同于标准DNA 的序列的样品DNA的情形中，标准DNA两端的标记被数学地稀释，使得可预测具有两标记的 分子的比例约为总数的1/21。相反，样品DNA中不存在相同于标准DNA的序列时，在两端具 有标记的原始标准DNA优先被重新构建。(4)重新构建的标准DNA的检测向预先涂覆有链霉亲和素的微型板的孔中添加在 两端均具有标记的标准DNA，将该DNA通过末端的生物素维持在孔中。通过对其添加标记有 抗-DNP抗体的碱性磷酸酶，预计该碱性磷酸酶将通过标准DNA被捕获于孔中。对其添加作 为该酶底物的PNPP (对硝基酚)，则引起出现黄色。该颜色通过测定405nm处的吸光度来定 量和检测。在样品DNA中存在相同于标准DNA的序列的情形中，所述吸光度低，而在不存在 相同序列时，则该吸光度高。关于指标值，将混合有水的各标准DNA所测得的吸光度定义为 100，并显示了与各样品混合、热变性和温度梯度后所测得的吸光度的比例。该数值为20以 下时，判定样品对标准DNA为阳性，而该数值为20以上时，判定该样品为阴性。对于由HPA_7a、HPA_7b和 HPA-7新基因制备的标准DNA，测量了各样品DNA所显示
的指标值。结果示于表4。 由克隆了各基因的质粒制备的样品相对于它们各自的标准DNA显示了低指标值。此处，样品No. 1、No. 3至No. 7的指标值相对于HPA_7a为20以下，而它们相对于 HPA-7b和HPA-7新却均显示超过50的数值，故推测它们具有HPA_7a的同源基因型。另一 方面，样品No. 2相对于HPA-7a和HPA-7新的标准DNA显示20以下的指标值，故推测其具 有HPA-7a/新的杂合基因型。由以上结果，显示GPIIIa基因的1297T多态性可以通过PCR-PHFA方法来检测。实施例3 通过荧光珠法构建检测新型等位基因的方法现在将描述通过荧光珠法 构建检测新型等位基因的方法。在所述荧光珠法(Clin Chem. 43 (9)pl799-801 (1997))中， 可以通过用2种荧光染料来染色珠子(beads)以便各染料实现10个梯度，从而来识别100 种珠子。通过将不同的探针固定在各珠子上，并与样品DNA进行杂交，从而在测定中同时检 测到对多个DNA探针的反应性。(1)基因扩增使用以下引物根据常规方法对人染色体DNA进行PCR扩增。 生物素-P6/7FC :5，-CCATCCAGGTGAGCTTCAGC(SEQ ID NO: 13)生物素-P6/7RC-2 5’ -AGTGGTTGCAGGTATATGAGGG(SEQ IDNO 14)(2)Luminex珠子的预备作为探针序列，将具有以下核苷酸序列的低聚核苷酸根 据常规方法固定在Luminex珠子(由Luminex制造)上。珠子No. 1 (用于检测HPA_7a 的珠子)5，-GCTGTCCCCAGGAG-3' (SEQ ID NO 15)珠子 No. 2 (用于检测 HPA_7b 的珠 子)5' -GAGGCTGTGCCCAGGA-3' (SEQ ID NO 16)珠子 No. 3 [用于检测 HPA-7 新的珠子) 5，-GAGGCTGTTCCCAGG-3' (SEQ ID NO 17)珠子 No. 4 (用于检测 HPA-7 的共通珠子) 5’-TGAACCTAATAGCCATCGC-3’ (SEQ ID NO 18)(3)杂交和检测作为样品，使用以下物质样品No. 1 具有HPA_7a基因的质粒样 品No. 2 具有HPA-7b基因的质粒样品No. 3 具有HPA-7新基因的质粒样品样品No. 4 染色 体 DNA No. 001 样品 No. 5 染色体 DNA No. 019 样品 No. 6 染色体 DNA No. 193通过利用这些作为样品，进行了 PCR扩增和与探针的杂交，测量通过结合至珠子 的探针捕获到的PCR产物的荧光值。
首先，将5μ1的PCR反应液与5μ 1的碱溶液混合，以将DNA变性为单链。将所得混合 物与25 μ 1的含有上述4种珠子和荧光标记链霉亲和素[由BD Biosciences制造)的杂交 溶液混合，从而中和。将所得混合物在55°C下孵育30分钟，以使探针与PCR产物杂交，同时 进行PCR产物的荧光标记。然后，在添加洗涤液并混合所得混合物后，通过离心除去上清， 以除去未结合至探针的PCR产物和过量的荧光标记链霉亲和素。将珠子混悬于洗涤液，并 使用Luminex设备，进行与珠子上的探针杂交的荧光标记PCR产物，和四种珠子的识别。检 关于荧光值，通过设定截断值为2000，染色的细胞变为阳性。因为样品No. 1、样品 No. 2和样品No. 3分别是具有HPA-7a、HPA_7b和HPA-7新的序列的质粒，故它们分别与它 们各自的探针特异性地反应，而给出比截断值高的荧光值。进一步地，它们均与具有共通序 列(commonsequence)作为探针的珠子No. 4反应而给出高荧光值。另一方面，因为染色体 DNA即样品No. 4和No. 5对结合有ΗΡΑ-la和共通序列的珠子给出高荧光值，故可看出它们 具有同型接合的HPA-7a。因为样品No. 6相对于结合有HPA_7a、HPA-7新和共通序列的珠 子给出高荧光值，故可看出它具有杂合的HPA-7a和HPA-7新。由以上结果，显示GPIIIa基因的1297T多态性可以通过使用荧光珠法来检测。
权利要求
包含GPIIIa基因的核苷酸序列的多核苷酸，其中所述GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基是胸腺嘧啶残基，或包含所述胸腺嘧啶残基的其片段。
2.权利要求1所述的多核苷酸或其片段，选自以下(i)、(ii)、(iii)和(iv)(i)包含SEQ ID NO 1的核苷酸序列的多核苷酸；( )下述多核苷酸，该多核苷酸由SEQ ID NO :1的核苷酸序列中插入、置换和/或缺 失了一个或多个核苷酸和/或向其一端或两端添加了一个或多个核苷酸的核苷酸序列组 成，并且该多核苷酸编码与由SEQ IDNO 2的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能的蛋 白质；(iii)下述多核苷酸，该多核苷酸在严格条件下与由SEQID NO :1的核苷酸序列的互 补序列组成的多核苷酸杂交，且该多核苷酸编码与由SEQ ID NO :2的氨基酸序列组成的蛋 白质具有同等功能的蛋白质；和(iv)下述多核苷酸，该多核苷酸与由SEQID NO 1的核苷酸序列组成的多核苷酸具有 70%以上的同一性，且该多核苷酸编码与由SEQ IDNO 2的氨基酸序列组成的蛋白质具有 同等功能的蛋白质。
3.权利要求1所述的多核苷酸或其片段，编码由SEQID NO :2的氨基酸序列或其一部 分组成的蛋白质。
4.权利要求1所述的多核苷酸或其片段，由SEQID NO 1的核苷酸序列或其一部分组成。
5.包含GPIIIa蛋白质的氨基酸序列的蛋白质，其中所述GPIIIa蛋白质的第407位的 氨基酸残基是丝氨酸残基，或者包含所述丝氨酸残基的其片段。
6.权利要求5所述的蛋白质或其片段，选自以下(ν)、(vi)、(vii)和(viii) (ν)包含SEQ ID NO 2的氨基酸序列的蛋白质；(vi)下述蛋白质，该蛋白质由SEQID NO :2的氨基酸序列中插入、置换和/或缺失了 一个或多个氨基酸和/或向其一端或两端添加了一个或多个氨基酸的氨基酸序列组成，并 且该蛋白质与由SEQ ID NO :2的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能；(vii)由下述多核苷酸编码的蛋白质，该多核苷酸在严格条件下，与由编码SEQID NO 2的氨基酸序列的多核苷酸的核苷酸序列的互补序列组成的多核苷酸杂交，且所述蛋白质 与由SEQ ID NO 2的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功能；和(viii)下述蛋白质，该蛋白质由与SEQID NO :2的氨基酸序列具有70%以上的同一性 的氨基酸序列组成，且该蛋白质与由SEQ ID NO :2的氨基酸序列组成的蛋白质具有同等功 能。
7.权利要求5所述的蛋白质或其片段，由SEQID NO :2的氨基酸序列或其一部分组成。
8.引物，其可以与权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列 杂交，且其用于通过核酸扩增法来扩增包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基或与其 配对的残基的区域。
9.权利要求8所述的引物，由下述多核苷酸组成，所述多核苷酸包含权利要求1-4中任 一项所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列的至少10个连续核苷酸。
10.权利要求8或9所述的引物，具有至少12至30个碱基的长度。
11.引物组，其由权利要求8-10中任一项所述的两种或更多种引物组成，且其用于通过核酸扩增法来扩增包含GPIIIa基因的第1297位的核苷酸残基或与其配对的残基的区 域。
12.权利要求8-10中任一项所述的引物或权利要求11所述的引物组，用于测定新生儿 异体免疫性凝血细胞减少性紫癜或其发病风险，或血小板输注中血小板输注治疗无效的发 病可能性。
13.探针，其可以与权利要求1-4中任一项所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序 列杂交，且其用于GPIIIa基因的第1297位的胸腺嘧啶残基的检测。
14.权利要求13所述的探针，包含与下述区域杂交的多核苷酸，所述区域包含权利要 求1-4中任一项所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列中的、GPIIIa基因的第1297位 的核苷酸残基或与其配对的残基。
15.权利要求13或14所述的探针，由下述多核苷酸组成，该多核苷酸包含权利要求 1-4中任一项所述的多核苷酸的核苷酸序列或其互补序列的至少10个连续核苷酸。
16.权利要求13-15中任一项所述的探针，具有至少12至30个碱基的长度。
17.权利要求13-16中任一项所述的探针，用于测定新生儿异体免疫性凝血细胞减少 性紫癜或其发病风险，或血小板输注中血小板输注治疗无效的发病可能性。
18.抗体，该抗体抗权利要求5-7中任一项所述的蛋白质或其片段。
19.用于通过检测GPIIIa基因中的突变来判定新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫 癜或其发病风险、或血小板输注中血小板输注治疗无效的发病可能性的方法，其包括使用 权利要求8-10中任一项所述的引物、权利要求11所述的引物组或权利要求13-16中任一 项所述的探针，来检测GPIIIa基因的第1297位的胸腺嘧啶残基的步骤。
20.用于通过检测GPIIIa基因中的突变来判定新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫 癜或其发病风险、或血小板输注中血小板输注治疗无效的发病可能性的方法，其包括使用 权利要求18所述的抗体来检测GPIIIa蛋白质的第407位的丝氨酸残基的步骤。
21.用于判定新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫癜或其发病风险、或血小板输注中 血小板输注治疗无效的发病可能性的试剂盒，至少包含权利要求8-10中任一项所述的引 物、权利要求11所述的引物组、权利要求13-16中任一项所述的探针或权利要求18所述的 抗体。
全文摘要
本发明的目的是提供用于测定新生儿异体免疫性凝血细胞减少性紫癜或其发病风险的探针、引物、引物组和抗体。根据本发明，提供探针、引物、引物组和抗体，以用于GPIIIa基因的第1297位的胸腺嘧啶残基的检测。
文档编号C12P21/08GK101849003SQ20088002506
公开日2010年9月29日 申请日期2008年5月26日 优先权日2007年5月25日
发明者冈孝纪, 前川尻真司, 永田希美, 石井博之, 谷上纯子 申请人:日本赤十字社;湧永制药株式会社