专利名称：具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法
具有增强的产量相关性状的植物及其制备方法本发明一般涉及分子生物学领域并且涉及通过调节植物中编码产量增加多肽的 核酸的表达来增强产量相关性状的方法，所述多肽选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)， III类U盒蛋白和PQQC蛋白。本发明还涉及具有编码产量增加多肽的核酸的受调节表达的 植物，所述植物相对于对应的野生型植物或者其他对照植物具有增强的产量相关性状。本 发明还提供了可用于本发明方法的构建体。持续增长的世界人口和农业用可耕地供应萎缩刺激了有关增加农业效率的研究。 常规的作物及园艺学改良手段利用选择育种技术以鉴定具有受欢迎特性的植物。然而，此 类选择育种技术具有几个缺陷，即这些技术一般耗费很多劳动并且产生经常含有异源性遗 传组分的植物，所述异源性遗传组分可能不总是导致所希望性状从亲代植物中传递。分子 生物学进展已经允许人类改良动物及植物的种质。植物的遗传工程使得可以分离和操作遗 传物质(一般处于DNA或RNA形式)并且随后将该遗传物质导入植物中。此类技术具有产 生具备多种经济学、农学或园艺学改良性状的作物或植物的能力。具有特殊经济意义的性状是增加的产量。产量通常定义为来自作物的经济价值的 可测量结果。该结果可以就数量和/或品质方面进行定义。产量直接取决于几个因素，例 如器官的数目和大小、植物结构(例如枝条的数目)、种子产生、叶衰老等。根发育、养分摄 入量、胁迫耐受性和早期萌发势(early vigor)也可以是决定产量的重要因素。优化前述 因素因而可以对增加作物产量有贡献。种子产量是尤其重要的性状，因为许多植物的种子对于人类和动物的营养非常重 要。作物如谷物、稻、小麦、卡诺拉油菜(canola)和大豆占人类总卡路里摄取量的一半以 上，不论是通过种子本身的直接消费，还是通过由加工的种子所饲养的肉类产品的消费。它 们也是工业加工所用的糖类、油类和多类代谢物的来源。种子含有胚(新的芽和根的来源) 和胚乳(萌发以及幼苗早期生长过程中胚生长的营养源)。种子的发育涉及许多基因，并且 需要代谢物自根、叶和茎转移至正在生长的种子。特别是胚乳，吸收糖类、油类和蛋白质的 代谢前体，将其合成为贮存高分子，以使谷粒饱满。许多作物的一个重要性状是早期萌发势。提高早期萌发势是温带和热带稻栽培种 中现代稻育种程序的重要目标。长根对于水中播种的稻的正确土壤锚定是重要的。当稻直 接播种到被淹没的田间并且当植物必须快速出水时，较长的根与萌发势有关。当实施播种 机播种时，较长的中胚轴和胚芽鞘对于好的幼苗萌出是重要的。将早期萌发势改造到植物 中在农业中是重要的。例如，弱的早期萌发势局限于对于基于欧洲大西洋部玉米带种质的 玉米杂种的引入产生限制。另一重要的性状是提高的非生物胁迫耐受性。非生物胁迫是世界作物减产的主 要原因，对于多数作物植物，将平均产量减少50%以上(Wang etal.，Planta (2003) 218 1-14)。非生物胁迫可以由干旱、盐度、极端温度、化学毒性和氧化胁迫引起。提高植物对非 生物胁迫的耐受性的能力对于世界上的农场主将具有主要的经济利益并且将允许在不利 条件下和否则不可能栽培作物的领域中栽培作物。因此，通过优化上述因素之一可以提高作物产量。
取决于最终用途，某些产量性状的修饰可以相对于其他性状是有利的。例如，对于 诸如粮草或木材生产或生物燃料生产的应用，植物的营养部分的增加可以是想要的，对于 诸如面粉、淀粉或油生产的应用，种子参数的增加或改善可以是尤其想要的。甚至在种子参 数中，一些可以比其他有利，这取决于最终应用。多种机理可以促进提高种子产量，无论其 为增加的种子大小或增加的种子数目或任何其他种子相关性状的形式。提高植物中种子产量(种子产量和/或生物量)的一种方法是通过改变植物的内 在生长机理，如涉及植物生长或防御机理的细胞周期或多种信号途径。现在已经发现通过调节植物中编码产量增加多肽的核酸的表达可以增强植物中 产量相关性状，所述多肽选自 磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)，III类U盒蛋白和PQQC 蛋白。背景磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(也称作PEP羧化酶，PEPC酶，或者PEPC ；EC4. 1. 1. 31)是 羧基裂合酶家族的酶，其催化CO2加入到磷酸烯醇丙酮酸(PEP)以形成四碳化合物草酰乙 酸PEP+C02 —草酰乙酸 +Pi该反应用于所称的“CAM”或“C4”植物中的碳固定，其中它在光合作用中起关键作 用。除了植物外，在一些细菌中也发现此酶，但是在动物或真菌中没有发现。通过PEP羧化酶的碳固定将可利用的CO2同化到四碳化合物(草酰乙酸，其进一 步被转化为苹果酸)中，该四碳化合物可以被存储或者在植物细胞之间穿梭。这使得可以 分隔通过与空气接触进行的初始CO2固定和在光合作用的光独立反应期间通过RuBisCO进 行的次级CO2向糖的固定。在适于在极干燥条件下生长的肉质CAM植物中，PEP羧化酶在夜间固定CO2，此时 植物打开气孔以允许气体交换。在白天，植物关闭气孔以保留水分并释放叶子内夜间产生 的来自存储化合物的C02。这允许植物通过在白天进行光合作用而不通过开放的气孔释放 水分而在干旱气候中茁壮成长。在C4植物例如玉米中，PEP羧化酶在叶子的叶肉细胞中固定CO2并且所得的4碳 化合物穿梭到维管束鞘细胞中，在这里其释放CO2用于被RuBisCO固定。从而，这两个过程 在空间上分开，允许RuBisCO在低氧环境中工作以避免光呼吸作用。由于RuBisCO的固有 加氧酶活性而发生光呼吸作用，其中该酶使用氧气而不是二氧化碳，不向糖中掺入碳或者 产生ATP。这样，它对于植物而言是一种浪费的反应。相比较，通过PEP羧化酶进行C4碳固 定更有效。Radchuk et al. , 2007 (The Plant Journal 51，819-839)报导了棒杆菌 PEPC 在 Vicia narbonensis种子中过表达以改变种子代谢并且将碳引入有机酸中，导致更大的种 子存储能力和增加的蛋白质含量。U盒是 70个氨基酸的结构域，其存在于酵母到人类中。原型U盒蛋白酵母 Ufd2被鉴定为泛素链装配因子(E4)，其与泛素活化酶(El)、泛素缀合酶(E2)和E3协作
以催化以人工底物形成泛素链，Hatakeyama et al. , 2003 (Biochemical and BiophysicalResearch Communications 302, pp635_645)。 Azevedo et al.2001(Trends in Plant Science Vol.6 No. 8)报导，数据库研究揭示了拟南芥中37种预测的含有U盒的蛋白质， 尽管据报导UFD2是酵母中唯一的U盒蛋白，并且仅仅一些在人类基因组和秀丽隐杆线虫 (Caenorhabditis elegans)和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中被鉴定出来。基于 结构域分析，发现植物U盒(PUB)蛋白质形成5个不同的亚类。发现III类由12个成员组 成，具有含有 14%亮氨酸残基的结构域。与U盒结构域在其他类别成员中的位置相比，发 现III类成员中的U盒结构域在N-末端区。预测U盒蛋白为泛素化机器中的E3或E4因子。Cho et al.， 2006 (PlantPhysiology, December 2006，Vol. 142，pp. 1664-1682)从水胁迫的辣椒 (Capsicum annuum L. cv Pukang)中分离了推定的U盒蛋白1 (CaPUBl)，编码在其N末端 区中含有单个U盒基序的蛋白质。体外泛素化和位点定向诱变测定法揭示CaPUBl具有E3 泛素连接酶活性并且U盒基序对于其酶活性是必需的。它们在拟南芥CaPUBl中在花椰菜 花叶病毒35S启动子控制下过表达。据报导转基因拟南芥植物具有比野生型显著更长的 下胚轴和根并且生长更快，导致早抽苔表型。发现子叶的形态在黑暗中是相似的的。表明 35S: :CaPUBl的根具有增加数目的小尺寸细胞，导致在皮层、内胚层和中柱中有序的数目巨 大的细胞层。转基因植物也显示出对水胁迫和轻微盐度的增加的敏感性。在不存在任何明显辅因子的反应中，PqqC促进3a_(2_氨基_2_羧乙基)_4，5_ 二 氧-4，5，6，7，8，9-六氢喹啉-7，9- 二羧酸环化和氧化成PQQ。吡咯并喹啉醌[4，5- 二氢-4， 5-二氧-IH-吡咯并_[2，3_f]喹啉-2，7，9-三羧酸；PQQ]是一种芳族三环邻醌，其作为一 些细菌脱氢酶的氧化还原辅因子。最著名的实例是甲醇脱氢酶和葡萄糖脱氢酶。PQQ属于 醌辅因子家族，已经公知其为依赖吡啶核苷酸和黄素的辅因子之后的第三类氧化还原辅因 子。尽管植物和动物自身不产生PQQ，但是PQQ因为其存在于人奶中和其抗氧化性质而引起 了巨大的兴趣。已经从乙酸 丐不动杆菌(Acinetobacter calcoaceticus)、克雷伯菌 属(Klebsiella)、荧光假单胞菌(Pseudomonas Fluorescens)、嗜器官甲基杆菌 (Methylobacterium organophilum)禾口扭月兑甲基!flif (Methylobacterium extorquens)克 隆了涉及PQQ合成的基因。PqqC催化PQQ生物合成中的最后步骤。PqqC是251个残基的蛋白质(分子量 28. 91kDa)，其在溶液中形成同型二聚体，如从凝胶过滤实验证明。PqqC折叠成紧密的七螺 旋束，具有六个环形对齐的螺旋，部分包围第七个疏水螺旋。PqqC结构的分析表明这七个螺 旋为活性部位腔提供了支架。该腔排列着42个最亲水的残基和芳族残基，其在来自不同细 菌的PQQC蛋白内高度保守。该腔显示了不同的总的正电荷。概述令人惊奇地，现在已经发现调节编码产量增加多肽的核酸的表达得到了相对于对 照植物具有增强的产量相关性状，尤其增加的产量的植物，所述多肽选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)，III类U盒蛋白和PQQC 蛋白。尤其令人惊奇的是发现产量的增加不以更大的种子的形式表现(如已经从Radchuck et al.，2007的教导中预期)，而是以一组改变的产量相关性状的形式表现，所述 性状包括但不限于，相对于各自对照植物增加的地上部分面积、增加的萌发势、增加的种子 总数、增加的种子重量、增加的饱满率、每圆锥花序增加的小花数、增加的种子数目、增加的 收获指数、增加的高度和根厚度的增加。根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物中产量相关性状的方法，包 括调节植物中编码PEPC蛋白的核酸的表达。根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物中产量相关性状、尤其增加 的产量的方法，包括调节植物中编码III类U盒蛋白的核酸的表达。根据一个实施方案，提供了相对于对照植物增强植物中产量相关性状、尤其增加 的产量的方法，包括调节植物中编码PQQC蛋白的核酸的表达。定义多肽/蛋白质术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用并且指处于任意长度聚合形式的通 过肽键连接在一起的氨基酸。多核苷酸/核酸/核酸序列/核苷酸序列术语“多核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列”、“核酸”、“核酸分子”在本文中可互 换使用并且指处于任意长度聚合未分枝形式中的核苷酸，即核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸 或这二者的组合。对照植物选择合适的对照植物是实验设置的惯用部分并且可以包括对应的野生型植物或 无目的基因的对应植物。对照植物一般是与待评估植物相同的植物物种或甚至是相同的变 种。对照植物也可以是待评估植物的失效合子。失效合子是通过分离而缺少所述转基因的 个体。如本文中所用的“对照植物”不仅指整株植物，还指植物部分，包括种子及种子部分。同源物蛋白质的“同源物”包括这样的肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶，它们相对于非修饰的 上述蛋白质具有氨基酸取代、缺失和/或插入并且与所述肽、寡肽、多肽、蛋白质及酶来源 的非修饰蛋白质具有相似生物学活性和功能活性。缺失指从蛋白质中移除一个或多个氨基酸。插入指一个或多个氨基酸残基在蛋白质中预定位点内的引入。插入可以包含单个 或多个氨基酸的N端融合和/或C端融合以及序列内插入。通常，在氨基酸序列内部的插 入会比N端融合或C端融合小约1-10个残基级别。N端或C端融合蛋白或融合肽的实例 包括如酵母双杂交系统中所用转录激活物的结合结构域或激活结构域、噬菌体外壳蛋白、 (组氨酸)-6-标签、谷胱甘肽S-转移酶-标签、A蛋白、麦芽糖结合蛋白、二氢叶酸还原酶、 Tag · 100表位、c-myc表位、FLAG _表位、IacZ, CMP (钙调蛋白结合肽)、HA表位、C蛋 白表位和VSV表位。取代指以具有相似特性(如相似疏水性、亲水性、抗原性、形成或破坏α -螺旋 结构或片层结构的倾向)的其他氨基酸替换蛋白质的氨基酸。氨基酸取代一般是单 个残基的，不过可以是簇集性的，这取决于置于多肽的功能性约束；插入通常会是约1-10 个氨基酸残基级别。对于大的蛋白质，插入的数目甚至可以是50、100、150、200或更多级 别。氨基酸取代优选地是保守性氨基酸取代。保守性取代表是本领域众所周知的(见例如Creighton (1984) Proteins. W. H. Freeman and Company (编辑)禾口下表 1)。表1 保守性氨基酸取代的实例
权利要求
在植物中相对于对照植物增强产量相关性状的方法，包括调节植物中编码产量增加多肽的核酸的表达，所述产量增加多肽选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)，III类U盒蛋白和PQQC蛋白。
2.权利要求1的方法，其中所述产量增加多肽选自SEQID N0:2、SEQ ID N0:75和SEQ ID NO :105和其直向同源物和旁系同源物。
3.权利要求1或2的方法，其中所述产量增加蛋白质具有C-末端区，该C-末端区以递 增优选顺序与选自SEQ ID NO :2、SEQ ID NO 75和SEQ ID NO 105的多肽的C-末端区有 至少 70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99%或更高的序列同一性。
4.根据前面权利要求任一项的方法，其中所述PEPC蛋白质包含任意一个或多个下面 的基序基序I QEIMVGYSDSNKD,或以递增优诜顺序与基序I有至少65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的基序；基序II :FHGRGGSVGRGGGPAYKAIL,或以递增优诜顺序与基序II有至少65%、70%、 75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的基序；基序III :LRAIPWVF,或以递增优诜顺序与基序III有至少65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的基序；基序IV :GIAAGMRNTG，或以递增优选顺序与基序IV有至少65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的基序；基序V SGFLSSNffE，或以递增优选顺序与基序V有至少65 %、70 %、75 %、80 %、85 %、 90%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的基序；基序VI SYKEffPEDKR,或以递增优选顺序与基序VI有至少65 %、70 %、75 %、80 %、 85%、90%、95%、96%、97%、98%或 99% 同一性的基序。
5.根据权利要求4的方法，其中基序 I 优选为QE V/1 M I/L/V GYSDS G/N/S K D/F ；基序 II 优选为FHGRGG T/S V/1 GRGGGP T/S/A H/Y L/I/E/D/K AIL/Q/V ；基序 III 优选为LRAIPW I/L/V F ；基序 IV 优选为=G I/V A/S AG L/M Q/R/K N T/S G ；基序 V 优选为:S/G G F/1 L/T/V S/T S N/Q/G WE ；基序 VI 优选为:S/T Y S/L/K/A/R/Q E/K/D W S/P/T/D E E/D R/G/K/QR/K。
6.根据前面权利要求任一项的方法，其中通过在植物中导入并表达编码选自PEPC、 III类U盒和PQQC多肽的产量增加多肽的核酸实现所述受调节的表达。
7.根据前面权利要求任一项的方法，其中所述编码选自PEPC、III类U盒和PQQC多肽 的产量增加多肽的核酸编码表A中所列的任一种蛋白质或者是这种核酸的一部分，或者是 能够与这种核酸杂交的核酸。
8.根据前面权利要求任一项的方法，其中所述增强的产量相关性状包括下面的一种或 多种各自相对于对照植物增加的地上部分面积、增加的萌发势、增加的种子总数、增加的 种子重量、增加的饱满率、每圆锥花序增加的小花数、增加的种子数目、增加的收获指数、增加的高度和根厚度的增加。
9.根据前面权利要求任一项的方法，其中在非胁迫条件和轻微干旱条件下得到所述增 强的产量相关性状。9.根据前面权利要求任一项的方法，其中在氮缺乏条件下得到所述增强的产量相关性状。
10.根据前面权利要求任一项的方法，其中所述核酸有效连接到年轻绿色组织特异性 启动子。
11.根据前面权利要求任一项的方法，其中所述编码PEPC多肽的核酸是细菌来源或植 物来源。
12.通过前面权利要求任一项的方法可得到的植物或其部分，包括种子，其中所述植物 或其部分包含编码选自PEPC、III类U盒和PQQC多肽的产量增加多肽的重组核酸。
13.构建体，其包含(i)编码选自如权利要求1-5任一项定义的PEPC、III类U盒和PQQC多肽的产量增加 多肽的核酸；( )能够驱动(a)的核酸序列表达的一个或多个控制序列；和任选地 (iii)转录终止序列。
14.权利要求13的构建体，其中所述控制序列之一是年轻绿色组织特异性启动子。
15.根据权利要求13或14的构建体在用于制备植物的方法中的用途，所述植物具有下 面的一种或多种各自相对于对照植物增加的地上部分面积、增加的萌发势、增加的种子总 数、增加的种子重量、增加的饱满率、每圆锥花序增加的小花数、增加的种子数目、增加的收 获指数、增加的高度和根厚度的增加。
16.用根据权利要求13或14的构建体转化的植物、植物部分或植物细胞。
17.产生相对于对照植物具有增加的产量，尤其增加的生物量和/或增加的种子产量 的转基因植物的方法，包括(i)在植物中导入并表达编码选自如权利要求1到5任一项定义的PEPC、III类U盒 和PQQC多肽的产量增加多肽的核酸；和( )在促进植物生长和发育的条件下培养所述植物细胞。
18.转基因植物，其具有下面的一种或多种各自相对于对照植物增加的地上部分面 积、增加的萌发势、增加的种子总数、增加的种子重量、增加的饱满率、每圆锥花序增加的小 花数、增加的种子数目、增加的收获指数、增加的高度和根厚度的增加，所述转基因植物从 编码选自如权利要求1到5任一项定义的PEPC、III类U盒和PQQC多肽的产量增加多肽的 核酸的增加的表达得到，或者来自所述转基因植物的转基因植物细胞。
19.根据权利要求12、16或18的转基因植物，或来自其的转基因植物细胞，其中所述植 物是作物植物或单子叶植物或谷类，如稻、玉米、小麦、大麦、粟、黑麦、黑小麦、高粱和燕麦。
20.根据权利要求19的植物的可收获部分，其中所述可收获部分优选为苗生物量和/ 或种子。
21.来自根据权利要求19的植物和/或来自根据权利要求20的植物的可收获部分的女口广 PFt ο
22.编码选自PEPC、III类U盒和PQQC多肽的产量增加多肽的核酸的用途，用于增加产量，尤其增加下面的一种或多种各自相对于对照植物增加的地上部分面积、增加的萌发 势、增加的种子总数、增加的种子重量、增加的饱满率、每圆锥花序增加的小花数、增加的种 子数目、增加的收获指数、增加的高度和根厚度的增加。
全文摘要
本发明一般涉及分子生物学领域并且涉及通过调节植物中编码产量增加多肽的核酸的表达来增强产量相关性状的方法，所述多肽选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)，III类U盒蛋白和PQQC蛋白。本发明还涉及具有编码产量增加多肽的核酸的受调节表达的植物，所述植物相对于对应的野生型植物或者其他对照植物具有增强的产量相关性状，所述产量增加多肽选自磷酸烯醇丙酮酸羧化酶(PEPC)，III类U盒蛋白和PQQC蛋白。本发明还提供了可用于本发明方法的构建体。
文档编号C12N15/82GK101952441SQ200880025566
公开日2011年1月19日 申请日期2008年7月31日 优先权日2007年7月31日
发明者I·G·黄, J·S·穆恩, N-S·左, O·崔, S·K·崔, S·W·钟, W·T·金, Y·D·崔, Y-Ii·帕克 申请人:巴斯夫植物科学有限公司;植物功能基因组中心