用于杂交核酸的方法

专利名称：用于杂交核酸的方法
用于杂交核酸的方法本发明涉及核酸与用于操作、分离、检测或扩增核酸的寡核苷酸-寡聚阳离子缀 合物(oligonucleotide-oligocation conjugate)的杂交，以及其在分子生物学和诊断领 域中的应用。基于核酸的技术广泛用于细胞和分子研究以及用于诊断。该技术依赖于合成的寡 核苷酸与其互补核酸链之间的序列识别。亲和力和特异性是确定任何基于核酸杂交的测定 的效率的两个主要特征。已开发了不同的方法来改进核酸杂交。其中，一个方法是减少带负电荷的核酸链 之间的静电排斥。最近，包括将阳离子基团接枝至寡核苷酸且完全基于用于寡核苷酸合成 的亚磷酰胺化学的自动化固相合成公开于WO 2007/069092中。所得的寡核苷酸-寡聚阳 离子缀合物经显示通过减少链间磷酸排斥来稳定与短互补序列的杂交(Pons等人，2006)。如同海底捞针一样，提高复杂核酸生物样品例如总基因组中的独特序列的特异性 检测是更加困难的挑战。在这样的情况下，预期寡核苷酸_寡聚阳离子缀合物的阳离子部 分非特异性结合基因组DNA的磷酸基团，从而减少对靶向的序列的特异性识别。当聚阳离 子是聚胺时，该问题可变得更加尖锐，如WO 2007/069092和(Pons等人，2006)中所举例说 明的。事实上，聚胺例如精胺或亚精胺天然地与原核和真核细胞中的基因组DNA相互作用 (综述于Tabor和Tabor，1984 ；Pegg等人，1986)。此外，已确定，由于控制核酸碱基配对 相互作用的机制，结合亲和力与序列特异性通常负相关(Demidov和Frank-Kamenetskii， 2004)。因此，预期用于靶向整个基因组中的特定序列的寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物耐受 错配，从而导致特异性的降低。本发明公开了预料之外的发现，即从WO 2007/069092中描述的分子中特异性选 择的寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物对于它们的靶序列显示了非常高的亲和力和令人惊讶 的严格特异性，从而导致基于杂交的方法的总体改进。特别地显示，所述寡核苷酸_寡聚阳 离子缀合物改善了聚合酶链式反应。有利地，与标准寡核苷酸相比，所述寡核苷酸_寡聚阳离子缀合物作为引物和探 针特别有效。“标准寡核苷酸”是指包含天然核碱基(nucleobase)的未修饰的寡核苷酸。因此，本发明的目的是提供杂交方法，其基于靶向性核酸使用特定寡核苷酸_寡 聚阳离子缀合物。本发明的另一个目的涉及寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物作为引物或探针的用途。根据另一个目的，本发明涉及所述缀合物的生物学应用。通过与寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物杂交来检测、分离、扩增或操作样品中的靶 核酸的方法包括使所述核酸与寡核苷酸_寡聚阳离子缀合物反应，所述缀合物包含至少直 接地或通过连接体连接在一起的Ai和B」部分，其中聚体寡核苷酸，i = 3至50，其中Ai是具有天然发生的或非天然发生的核 碱基和/或戊呋喃糖基(pentafuranosyl)和/或天然磷酸二酯键的寡聚体，其任选地包含 标记物基团
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. Bj是j聚体有机寡聚阳离子部分，j = 1至50，其中B是-HPO3-R1-(NH-R2) n-NH-R3_0-，其中R1、R2和R3是相同或不同的低级亚烃基 (alkylene)，当η大于1时，NH-R2部分是相同的或不同的；-HPO3-R1-CH(X)-R3-O-,其中R1和R3是相同或不同的低级亚烃基，X是腐胺、亚精 胺或精胺残基；“低级亚烃基”，如说明书和权利要求中所使用的，是指任选地经取代的C1-C6线 性、分支或环状亚烃基。Ai选自脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和非天然发生的核碱基例如锁(LNA)核苷酸、 PNA以及它们的化学修饰物或取代物例如硫代磷酸酯(phosphorothioate)(也称为硫代磷 酸酯(thiophosphate))、2'-氟或 2' _0_ 烷基。Ai可包含生色团/荧光团和/或猝灭基团，或化学部分例如氨基或巯基修饰剂、 间隔子基团(spacer group)、生物素、疏水链、胆固醇衍生物、抗原、蛋白质、肽、磷酸基团或 糖。在第一实施方案中，游离-OH存在于Ai的位点3'上。寡核苷酸-寡聚阳离子缀 合物从而可用作DNA或RNA聚合酶的底物。在该第一实施方案中，寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物因而可用作核酸合成的引 物。根据所述第一实施方案的混合的寡核苷酸_寡聚阳离子缀合物具有结构IHO-3，Ai5，-BrR4或结构IIHO-3，Ai5，-R5-Bj-R4或结构IIIHO-3，Ail5，-BrAi2-R4其中UPAi2是相同的或不同的，且如上文中对于&所定义的；Ai2以3'至5'或5' 至3'方向排列，-R4是H或连接体、猝灭剂、标记物例如生色团或荧光团、或化学部分例如生物素、 疏水链、胆固醇衍生物、抗原、蛋白质、肽、糖或磷酸基团；-R5,与Hji和B」不同，是Ai与B」之间的连接体，并且由化学上稳定的或可切割的 连接体组成。本发明因而涉及方法例如上述方法，其中结构I、II或III的分子在结合靶核酸后 用作引物。这样的方法有利地包括步骤-将引物例如上文中定义的引物与所述靶核酸分子在允许所述引物分子结合所述 靶核酸分子的条件下一起温育和-以所述靶核酸分子作为模板延伸所述引物。在所述实施方案中，所述分子是催化核酸合成的DNA或RNA聚合酶的底物。如实施例中所显示的，与包含天然核碱基的标准未修饰的寡核苷酸相比，相应于所述分子的引物能够以预料之外的高序列特异性显著提高对它们的靶核酸的亲和力。特别地，所述分子因而是用于逆转录和核酸扩增法例如聚合酶链式反应的强有力 的工具。所述引物确实使得能够进行高效、特异和灵敏的扩增反应例如PCR。由于对它们的靶的优异的亲和力，当与标准引物(未修饰的寡核苷酸)相比时，本 发明的引物可在减少多至10倍的极低浓度上使用。此外，可在低盐浓度，更特别地低MgCl2 浓度下高效地使用它们。与标准引物相比较，杂交温度可增加数度。其可根据寡聚阳离子的长度来进行调
iF. ο因此，可以免除对杂交温度和盐浓度，更特别地MgCl2浓度的限制性调整。所述引物可用于应用例如多重PCR或高通量PCR。所述引物还允许改善已知难以通过PCR扩增的富含AT的区域的扩增。特别地，本发明的分子使得能够设计用于特殊应用例如具有高度变异性的基因组 的保守区域中的扩增的短引物。如实施例中所显示的，所述引物还可在应用例如逆转录中用作oligo (dT)、六聚物 或特异性引物。由于它们的优异的亲和力，它们对于检测低表达的基因可以是特别有价值 的。所述引物还可用于DNA测序。在一些情况下，使用在寡核苷酸和寡聚阳离子部分之间具有可切割的连接体的本 发明的分子可以是有利的。在其中需要电泳分离扩增产物的方法中，聚阳离子在分离之前 的扩增后切割可以是有价值的。在第二实施方案中，Ai的位点3 ‘上的-OH被封闭，从而Ai在聚合酶存在的情况下 不能进行延伸。所述第二组的分子具有结构IVR4-Bj-3，Ai5' -R6或结构VR4-Bj-R5-3' Ai5，-R6或结构VIR7-3，Ai5' BrR4或结构ΥΠR7-3，Ai5' -R5-BrR4或结构VDIR7-3' Ail5' -Bj-3' Ai25' -R4或结构IXR7-3' Ail5' -Bj-5' Ai23' -R8或结构XR4-Bjl-3' Ai5' -Bj2-R6其中
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-Ail和Ai2相同或不同，且如上文中对于Ai所定义；-Bjl和Bj2相同或不同，且如上文中对于Bj所定义；-R4和R6是相同的或不同的，R4如上文中所定义，且R6例如上文中对于R4所定义 的，和-R7和R8是相同的或不同的，它们与H不同，并且选自连接体、猝灭剂、标记物例如 生色团或荧光团、或化学部分例如生物素、疏水链、胆固醇衍生物、抗原、蛋白质、肽、磷酸基 团或糖。所述第二实施方案的分子用于在包含DNA或RNA聚合酶的测定中检测靶核酸。它 们更特别地可用作探针来检测通过体外核酸扩增法例如PCR产生的互补核酸。所述第二实施方案的分子更特别地用作监控实时核酸扩增的探针。本发明涉及用于检测靶核酸的方法，其中结构IV至X的分子可用作与靶核酸杂交 的探针。本发明因而涉及用于检测靶核酸的方法例如上文中定义的方法，其包括步骤-在RNA或DNA聚合酶存在的情况下，将所述靶核酸与探针例如上文中定义的探针 在允许所述探针与所述靶核酸分子杂交的条件下一起温育；和-检测所述杂交。有利地，所述分子是有价值的杂交探针和双重标记的探针(用于实时PCR)。如实 施例中所示，本发明的探针减少荧光背景，从而提高扩增子检测的性能。特别地，与标准探针(含有天然核碱基的双重标记的探针)相比，本发明的双重标 记的探针在扩增不存在的情况下显示更大的荧光发射的猝灭。此外，如实施例中所示，缀合 的探针以更高的灵敏性检测靶。本发明因而涉及用于区分野生型和突变型靶核酸的方法，例如上文中定义的方法。有利地，所述分子允许设计可用于扩增法例如PCR的更短的探针(通过促进引物 /探针组的设计)。短探针具有更大的区分能力。特别地，所述分子从而是用于等位基因区分的强有 力的工具。如实施例中所显示的，与标准寡核苷酸相比较，相应于本发明的分子的探针特别 适用于检测和分析突变例如SNP (单核苷酸多态性)。在另一个方面，所述第二实施方案的分子有利地用作夹钳(clamp)，从而提供了用 于抑制靶核酸的扩增和/或检测的方法。在第三实施方案中，本发明的分子更常见地用于基于杂交的测定(其中靶核酸不 是聚合酶的模板)。本发明涉及用于核酸操作的方法，其中结构I至X的分子例如上文中定义的分子 在结合靶核酸后用作一个或多个酶的底物。本发明涉及用于核酸操作的方法，其中结构I至X的分子例如上文中定义的分子 在一个或多个酶存在的情况下，在允许所述酶修饰所述靶核酸的条件下结合靶核酸。本发明涉及用于操作、检测、捕获靶核酸的方法，其包括使结构I至X的分子例如 上文中定义的分子与靶核酸杂交。
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本发明因而涉及用于检测靶核酸的方法例如上文中定义的方法，其包括步骤-将所述靶核酸与本发明的探针例如上文中定义的探针在允许所述探针与所述靶 核酸分子杂交的条件下一起温育；和-检测所述杂交。所述第三实施方案的分子更特别地用作用于检测固定的靶核酸例如固体支持物 上的或固定的组织上的靶核酸的探针。所述探针可用于原位杂交方法。如实施例中所显示的，本发明的短探针可在不容许标准探针的严格条件下以高特 异性检测固定在支持物上的靶核酸。考虑到它们的生物学应用，具有含有修饰的核苷酸例如硫代磷酸酯核苷酸的Ai的 分子是特别有利的，因为硫代磷酸酯寡核苷酸在细胞裂解物或生物学液体中不被水解。按照WO 2007/069092的方法通过亚磷酰胺途径，有利地在寡核苷酸合成仪上逐 步合成上文定义的混合的寡核苷酸_寡聚阳离子缀合物。通过保护聚胺的氨基，然后进行α，ω-双羟基烷基化产生与寡核苷酸合成相容 的二元醇来有利地获得活化的且被保护的寡聚阳离子B。使用碱不稳定的(base-labile) TFA保护基团有利地一起进行经典的DMT和亚磷 酰胺延伸化学。在下列实施例(其中参考

图1至9)中提供本发明的其他特征和有利方面，所述图 1至9分别表示-图1，寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物的结构；-图2，在常规梯度PCR中使用本发明的引物获得的结果；-图3，在实时PCR实验中在高退火温度和低盐(MgCl2)下使用本发明的引物获得 的结果；-图4，在实时PCR实验中以低浓度使用所述引物获得的结果；-图5，在实时PCR实验中在富含AT的背景中使用所述引物获得的结果；-图6，在RT-qPCR中获得的关于用本发明的引物引发的cDNA的结果；-图7，在5'核酸酶测定中使用本发明的双重标记的荧光探针获得的荧光特征和
结果；-图8，在实时PCR中使用本发明的荧光杂交探针获得的结果；-图9，使用用于检测固定在固体支持物上的靶核酸的本发明的荧光探针获得的结果。在下列实施例中，“S”表示下列结构的精胺残基-HPO3- (CH2) 4-NH2+- (CH2)「ΜΙ/- (CH2)「ΜΙ/- (CH2) 3_NH2+- (CH2) 4_0_，Sn 表示精胺残 基的数量，η = 1至50。- “Nm”表示m聚体寡核苷酸。实施例1 本发明的寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物的结构按照WO 2007/069092进行合成，并在图1中举例说明寡核苷酸-寡聚阳离子缀合 物的结构。实施例2 寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物作为PCR引物的用途将特异于人乳头瘤病毒16型(HPV 16)的基因E7和Ll的两对寡核苷酸-寡聚阳离子引物与它们的标准对应物(非缀合的寡核苷酸)相比较。还将本发明的分子与锁核酸 (LNA)修饰的引物相比较。E7引物的序列来自Hesselink等人，2005。Ll引物的序列改编自de Roda Husman 等人，1995。E7引物对(46%和48% GC)和Ll引物对(30%和20% GC)举例说明了两个不同 的GC含量。含有1至2个拷贝的整合的HPV16的SiHa细胞(宫颈癌，ATCCHTB35)的基因组 DNA用作靶基因组DNA。不包含病毒的A549细胞(肺癌，ATCC CCL185)的基因组DNA用作 阴性对照。
本发明的引物是结构I的实例。
标准寡核苷酸的序列(E7引物)
SEQ ID N。1 的正向引物(E7F) 5' -GAG GAG GAG GAT GAA ATA GATGGT-3‘ SEQ ID N° 2 的反向引物(E7R) 5' -GCC CAT TAA CAG GTC TTC CAA-3‘ 根据本发明的寡核苷酸_寡聚阳离子缀合物的序列(S4-E7引物) SEQ ID N。3 的正向引物(S4-E7F) 5 ‘ -S4-GAG GAG GAG GAT GAAATA GAT
SEQ ID N。4 的反向引物(S 4-E7R) 5' -S4-GCC CAT TAA CAG GTCTTC CAA-3‘ 含有LNA的寡核苷酸的序列(LNA-E7引物)
SEQ ID N。5 的正向引物(LNA-E 7F) 5 ‘ -GaG GAg GAG GAT GAA ATAGAT
GGT-3
GGT-3‘SEQ ID N° 6 的反向引物(LNA-E7R) 5' -GCc CAT tAA CAG GTC TTCCAA-3‘LNA核苷酸以下划线和小写字母标示S4 = 4个精胺部分 标准寡核苷酸的序列(Li引物)
SEQ ID N。7 的正向引物(LlF) 5' -TTT GTT ACT GTT GTT GAT ACTAC-3‘ SEQ ID N。8 的反向引物(LlR) 5' -GAA AAA TAA ACT GTA AAT CATATT C_3' 根据本发明的引物的序列(Sn-Ll引物)
SEQ ID N。9 的正向引物(Sn-LlF) 5' -Sn-TTT GTT ACT GTT GTT GATACT AC-3' SEQ ID N° 10 的反向引物(Sn-LlR) 5' -Sn-GAA AAA TAA ACT GTAAAT CAT ATT C-3'Sn = η个精胺部分；η = 4禾口 5·含有LNA的寡核苷酸的序列(LNA-L1引物)SEQ ID N。11 的正向引物(LlF) 5' -TTt GTT aCT GTT GTT GAT ACTAC-3‘SEQ ID N。12 的反向引物(LlR) 5' -GAa AAA tAA ACT GTA AAT CATATT C-3'LNA核苷酸以下划线和小写字母标示图2描述了本发明的引物在常规PCR中的用途。使用梯度PCR法在PCR的终点将 扩增性能评估为退火温度的函数。在25 μ 1的反应体积中扩增靶和对照基因组DNA。在0. 4mM DNA, IOmM Tris-HCl (pH9) ,50mM KCl, 1. 5mM MgCl2,0. 1% Triton X-100,200 μ M dNTP (各个)，0. 04U/
9μ 1的EconoTaq DNA聚合酶(Lucigen)和下列引物对存在的情况下扩增各样品-IOOnM的E7标准引物(图2a 上图)或S4-E7引物(图2a 下图)或-500nM的Ll标准引物(图2b 上图)；LNA-Ll引物(图2b 中图)；和具有5个 精胺部分的S5-L1引物(图2b 下图)，-500nM的Ll标准引物(图2c 上面部分)；具有4个精胺部分的S4-L1引物(图 2c 中间部分)；和具有5个精胺部分的S5-L1引物(图2c 下面部分)。如下在iCycler热循环仪(Biorad)中进行梯度扩增初始变性在95°C下进行 3分钟，循环35个(a，c)和30个(b)循环在94°C下进行20秒，在60°C -69°C (a)下进 行20秒或在52°C -61°C (b,c)下进行20秒，在72°C下进行15秒；终延伸在72°C下进行 5分钟。在4%的琼脂糖凝胶上分析终PCR反应物。E7和Ll的产物大小分别是159bp和 142bp。如图2a中所示，根据本发明选择的在5'末端上具有4个精胺残基的缀合物特异 性扩增它们的靶。与标准引物一样，它们确实从靶SiHa细胞的基因组DNA扩增具有预期的 159bp大小的病毒序列片段。相反地，在相同的扩增条件下从A549细胞的基因组DNA没有 获得扩增。有利地，通过使用本发明的寡核苷酸缀合物，可在更高的温度(4至7°C，取决于引 物对)下进行杂交反应(图2a和2b)。有利地，通过使用本发明的寡核苷酸缀合物，可在比含有LNA的引物更高的温度 (4-5°C，参见图2b)下进行杂交反应。图2c中给出的结果显示可利用缀合至寡核苷酸的精胺的数目调控温度的增加。就它们在实时PCR实验中作为引物的用途来评估本发明的分子。将引物缀合物与 它们的未修饰的标准对应物以及与含有LNA的引物相比较。在Rotor-gene 6000仪(Corbett)中于10 μ 1的终体积中进行所有反应。使用 Sensimix NoRef DNA试剂盒(Quantace)在0. 5Χ的终浓度下进行反应。通过扩增掺杂(spiked)在IOng的对照基因组DNA，即HPV阴性细胞(A549细胞) 的3000个基因组中的靶HPV16阳性细胞(SiHa细胞)的基因组DNA的系列稀释物来评估 效率和灵敏性。使用用于检测的SYBR Green I在不同的杂交温度、MgCl2浓度或引物浓度的条件 下扩增样品。图3 =MgCl2浓度和退火温度对实时扩增的影响。使用IOOnM的各引物对IOng靶基因组DNA进行反应。终MgCl2浓度是1. 5mM或 3mM，如所标示的。在95°C下进行10分钟的热起动，然后进行45个循环在94°C下进行20 秒，在63°C (a)或66°C (b)下进行20秒，和在72°C下进行15秒。如图3a中所示，当在1.5mM MgCl2中于63°C下退火时，本发明的分子(S4-E7)是 最佳的。相比之下，标准引物和含有LNA的引物是低效的，如循环阈值的增加(16个，对于 本发明的缀合物；33个，对于标准引物；24个，对于含有LNA的引物)所显示的。增加MgCl2 浓度提高了标准引物和含有LNA的引物的性能。还可从图3得出，标准引物和含有LNA的 引物需要较低的退火温度，而所述S4-E7缀合物在63°C下高效地运行。如图3b和3c中所示，在固定的引物浓度(IOOnM)和低MgCl2浓度(1. 5mM)下，使
10用所述S4-E7缀合物，在66°C的杂交温度下可以以高重现性、特异性和效率检测到直至3个 拷贝的靶。使用本发明的引物缀合物，在对于标准引物和含有LNA的引物通常不是最适宜的 温度或MgCl2条件下获得特异性、有效且灵敏的扩增。引物浓度的影响通过图4举例说明。图4a 在1. 5mM MgCl2中使用IOnM的本发明的引物缀合物扩增靶基因组DNA的10 倍系列稀释物。图4b 使用可变量的引物10、20和30nM的本发明的引物缀合物(上图)；10、25 和50nM的标准引物(中图)和含有LNA的引物(下图)，扩增2ng的掺杂在IOng的对照基 因组DNA中的靶基因组DNA。对于本发明的缀合物，MgCl2的浓度是1. 5mM ；对于标准引物 和含有LNA的引物，MgCl2的浓度为3mM。如下进行扩增在95°C下进行10分钟，然后进行45个循环的在95°C下10秒、在 60°C下1分钟。图4a显示IOnM的本发明的引物分子在两步PCR反应中驱动有效且灵敏的扩增。 事实上可定量检测到3个拷贝的靶。如图4b中所示，引物浓度的减少不引起Ct值的增加。 只有反应终点处的扩增子的最终的量减少。相比之下，在3mM MgCl2中50nM的标准寡核苷 酸或含有LNA的引物不足以以与缀合的引物所进行的一样的最佳方式扩增靶。有利地，与标准寡核苷酸和含有LNA的引物相比较，本发明的引物缀合物显示更 大的对它们的靶的亲和力，从而允许在低MgCl2浓度下进行使用。与标准寡核苷酸和含有 LNA的引物相比较，所述分子允许引物浓度减少多至10倍，而不丧失灵敏性、效率、特异性 或重现性。如图5中所示，本发明的引物分子改善了富含AT的序列中的PCR。有利地，所述分 子允许在标准化条件(1.5mM MgCl2，在60°C下退火)中进行有效反应。在图5a中，使用IOOnM的本发明的缀合物扩增靶基因组DNA的5倍系列稀释物。 终MgCl2浓度是1. 5mM。将反应物在95°C下温育10分钟，然后进行45个循环在94°C下进 行20秒，在60°C下进行20秒和在72°C下进行15秒。在这些条件下，本发明的缀合物驱动 有效(参见标准曲线(E = 0. 89 ；R2 = 0. 992))且灵敏的扩增，如由1个拷贝的靶的检测所 显示的。相比之下(图5b)，标准引物和含有LNA的引物低效地扩增600个拷贝的靶。条件 如下使用150nM的本发明的缀合物(具有4或5个精胺)(上图)；150nM、500nM和1 μ M 的标准引物(中图)和含有LNA的引物(下图)，利用两步扩增方案(在95°C下进行10分 钟，然后进行45个循环在95°C下进行10秒，在60°C下进行1分钟)扩增2ng的掺杂在 IOng的对照基因组DNA中的靶基因组DNA(代表600个拷贝的靶)。对于本发明的缀合物， MgCl2浓度为1. 5mM，对于标准引物和含有LNA的引物，MgCl2浓度为3mM。实施例3 寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物用作用于逆转录的引物的用途就它们用作用于逆转录的引物的用途评估本发明的分子。使用含有20个残 基的缀合有4个精胺部分的多聚脱氧核糖胸苷(S4-0lig0(dT)2CI)或其未缀合的对应物 (0lig0(dT)2(1)从总RNA合成cDNA。随后进行用于扩增细胞周期蛋白Bl转录物的RT-qPCR 反应来比较逆转录效率。
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·引物序列SEQ ID N° 13 的 oligo (dT) 20 :5 ‘ -TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3，。SEQ ID Ν° 14 的 S4_oligo (dT) 20 :5 ‘ -S4-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT_3 ‘。S4 = 4个精胺部分。SEQ ID N ° 15 的细胞周期蛋白 Bl 正向引物5' -TCTGGATAATGGTGAATGGACA-3 ‘SEQ ID N ° 16的细胞周期蛋白Bl反向此物 5 ‘ -CGATGTGGCATACTTGTTCTTG-3‘。使用SV Total RNA Isolation 试剂盒(Promega)从细胞 HCT 116(来自 ATCC CCL-247)提取总 RNA。如提供商所述，使用 Superscripts First-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen)逆转录1 μ g总RNA。使用50 μ M的本发明的分子 (S4-oligo(dT)20)或其未缀合的对应物(0lig0(dT)2Q)引发反应(RT+)。不使用逆转录酶 (RT-)的反应作为对照。图6显示使用相应于5ng的总RNA的cDNA合成反应物(RT+和RT-)进行的细胞周 期蛋白Bl转录物的RT-qPCR扩增。在Rotor-gene 6000仪(Corbett)上于10 μ 1的终体 积中进行PCR反应。终反应混合物包含2. 5 μ 1 Sensimix NoRef PCR试剂盒(Quantace)、 SYBR Green 0. 5x、IOOnM的各细胞周期蛋白Bl特异性引物和3mM MgCl20将反应物在95°C下温育10分钟，然后进行45个循环在95°C下进行10秒，在 60°C下进行1分钟。通过在4%的琼脂糖凝胶上进行凝胶电泳来分析PCR产物(图6b)。图6a显示来自用本发明的分子或其标准对应物引发的CDNA样品的相同的细胞周 期蛋白Bl的扩增曲线。已合成预期大小(157bp)的相同PCR产物(图6b)。在所有样品中 在逆转录酶不存在的情况下，产生晚期脱靶产物。本发明的缀合的OligO(dT)-0H分子，当用作用于逆转录的引物时，使得能够进行 有效的cDNA合成。实施例4 寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物在实时PCR中用作双重标记的PCR探针 的用途。双重标记的探针是最广泛使用的探针，其用于在实时PCR中监控扩增。也称为 TaqMan 探针，它们由在内部与扩增子杂交的在5'末端具有荧光团并且在3'末端具有猝 灭剂的寡核苷酸序列组成(Livak等人，-1995)。如果两个标记在溶液中足够靠近，则由激 发荧光团发射的能量通过FRET(荧光能量转移)被猝灭剂吸收，从而导致低荧光信号。在 基于5'核酸酶法的PCR反应(Holland等人，1991)中，探针在各退火步骤中结合扩增子。 当引物之一由Taq DNA聚合酶延伸时，探针从模板链置换出来，且被聚合酶的5' -3'外切 核酸酶活性水解。切割导致荧光报告分子的释放，从而引起与产生的PCR产物的量成正比 的荧光强度的增加。就它们在设计用于扩增人因子V基因的5'核酸酶测定中用作实时PCR检测探针 的用途评估本发明的寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物。人因子V基因中的Leiden G1691A突 变用作模型以评估所述探针用于SNP(单核苷酸多态性)基因分型的能力。探针和引物序列改编自Luderer等人，2004。含有17和22个核苷酸残基的两个寡核苷酸在它们的3'末端上缀合有4个
12精胺部分。用6-羧基荧光素(6-FAM，Sigma) 5'标记所述缀合物且将Black Hole Quencher (BHQ-1 ,Glen Research)连接至寡聚阳离子。将本发明的此类双重标记的荧光 探针与它们的非寡聚阳离子缀合的对应物相比较。所有探针经设计用于检测野生型等位基因。分别从细胞系A549(ATCC CCL-185) 和 GM14899 (Coriell Institute)提取因子 V 的野生型 DNA 和 Leiden DNA。本发明的双重标记的探针是结构IV的实例。·引物序列SEQ ID N。15 的正向引物5' -GCC TCT GGG CTA ATA GGA CTACTT-3‘SEQ ID N° 16 的反向引物5' -TT CTG AAA GGT TAC TTC AAG GACAA-3‘ 探针的序列-根据本发明的探针的序列SEQ ID N。15(F_N17S4) 5' 6-FAM-ACC TGT ATT CCT CGC CT-S4BHQ-1S4 = 4个精胺部分-标准探针的序列SEQ ID N° 17(F_N17) 5' 6-FAM-ACC TGT ATT CCT CGC CT-BHQ-ISEQ ID N° 18 (F-N22) 5' 6-FAM-ACC TGT ATT CCT CGC CTG TCCA-BHQ-1SNP位点以下划线标示。在Rotor-gene 6000仪(Corbett)上于10 μ 1的终体积中进行PCR反应。IOng野 生型基因组DNA (b)、掺杂在IOng对照DNA中的野生型基因组DNA的10倍系列稀释物(c)和 IOng野生型或突变型基因组DNA (d)用作模板。终反应混合物包含2. 5μ 1 Sensimix NoRef PCR试剂盒(Quantace)、200ηΜ各引物和200ηΜ探针。终MgCl2浓度是3mM。鲑精DNA用作 阴性对照(非靶DNA)。在PCR反应开始时利用仪器测量的原始背景荧光表示双重标记的探针的自猝灭 效率。如图7a中所示，本发明的缀合探针(F-N22S4)展示比其标准对应物(F-N22)更好的 荧光猝灭(背景荧光值4. 8个单位对24个单位)。猝灭取决于两个染料的物理接近度。通 过寡核苷酸上的折叠(由于静电相互作用)，多聚阳离子使末端连接的荧光团/猝灭剂对接 近。本发明的分子是有价值的双重标记探针，其具有改善的猝灭特征。图7b显示根据本发明的探针与其标准对应物在5'核酸酶测定中的性能的比较。 缀合的探针展示更高的信噪比，从而导致更早的检测(2. 5个循环)和更大的终末荧光。因此，根据本发明的探针对于检测它们的靶展示更高的灵敏性。然后将短缀合探 针(17聚体，F-N17)与长标准探针(22聚体，F-N22)相比较。如图7c中所示，本发明的的短 探针(F-N17S4)以与长标准探针(F-N22)相同的效率和灵敏性检测野生型扩增子。事实上， 循环阈值和终荧光值是相当的。在相同的条件下，短标准探针(F-N17)表现较差(图7d)。图7d解决了等位基因区分的问题。在含有因子V Leiden DNA作为模板的样品中， 使用长野生型标准探针仍然检测到突变的扩增子，然而使用缀合和标准短探针观察不到信 号。因此，根据本发明的短探针展示与更长的常规标准探针相同的性能。此外，它们具 有更大的区分能力。实施例5 寡核苷酸_寡聚阳离子缀合物在实时PCR中作为荧光杂交探针的用途。
13
就它们在实时PCR中作为相邻荧光探针的用途评估本发明的分子(Bernard等人， 1998)。检测的模式依赖于彼此相邻的两个探针在扩增子上的杂交。一个探针具有3'供体 标记，而另一个探针具有5'受体标记。当两个探针都结合至特定的扩增子时，激发的3' 供体标记通过FRET机制将其能量转移至受体标记，从而该受体标记发射荧光。供体发射的 荧光的增加与PCR产物的增加成正比。设计两个相邻探针以在qPCR的退火步骤中结合之前描述的人乳头瘤病毒16型 (HPV16)E7扩增子。用6-FAM在3'末端标记供体探针，用ROX染料(羧基-χ-罗丹明)在 5'末端标记受体探针。将标准供体探针与本发明的分子相比较。供体探针是结构ΥΠ的实例。在Rotor-gene 6000仪(Corbett)中于10 μ 1的终体积中扩增掺杂在IOng对照 基因组DNA(来自Α549细胞)中的靶基因组DNA(来自SiHa细胞)的300个拷贝(a)或 系列稀释物(3000至30个拷贝)(b)。终反应混合物包含2. 5μ 1 Sensimix NoRef PCR 试剂盒(Quantace)，3mM MgCl2，200nM正向引物，300nM反向引物，200nM探针E7-R0X探针 (Eurogentec)。探针 E7-N25F、E7-S4N25F 和 E7-S4N20F 为 200nM(a)和 50nM(b)。在95°C下温育反应物10分钟，然后进行45个循环在95°C下进行5秒，在55°C 下进行10秒，在72°C下进行10秒。如图8a中所示，缀合的探针使得能够有效地检测扩增子。由于两个标记的光谱重叠，因此在扩增子不存在的情况下观察到高背景信号。由 于它们的高亲和力，寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物预期通过在低浓度下驱动有效检测来减 少荧光背景水平。此外，预期寡核苷酸_寡聚阳离子缀合物允许设计有效的短探针，从而导 致错配区分能力的提高。如图8b中所描述的，本发明的较短的探针(E7-S4N2CIF)的确在低 浓度上显示比标准探针(E7-N25F)更好的性能。本发明的分子是有价值的用于实时PCR的杂交探针。·Ε7引物的序列SEQ ID N。1 的正向引物(E7F) 5' -GAG GAG GAG GAT GAA ATA GATGGT-3‘SEQ ID Ν° 2 的反向引物(E7R) 5' -GCC CAT TAA CAG GTC TTCCAA-3‘ 探针的序列SEQ ID N。 19(E7_R0X) 5' -ROX-TGCGTACAAAGCACACACGTAGACAT 3'SEQ ID N。 20(E7N25F) 5' -GCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTT-6-FAM 3'SEQ ID N。 21(E7N25F) 5' -S4-GCAAGTGTGACTCTACGCTTCGGTT-6-FAM 3'SEQ ID N。 22(E7S4N20F) 5' -S4-TGTGACTCTACGCTTCGGTT-6-FAM 3'S4 = 4个精胺残基实施例6 寡核苷酸_寡聚阳离子缀合物作为用于检测固定在固体支持物上的靶 核酸的荧光探针的用途。就它们用作用于检测和/或基因分型固定的靶核酸的杂交探针的用途评估本发 明的分子。图9显示斑点-印迹DNA杂交实验的结果。靶核酸是pGL2和pGL3Luciferase R印orter载体(Promega)。设计短探针(14聚体)以完全匹配pGL3载体。通过与pGL2杂交，所述序列形成错配。将本发明的探针与其标准对应物相比较。两个探针都用荧光素进 行5 ‘标记。通过在80°C下衬背(backing)60分钟将pGL2和pGL3载体固定在带正电 荷的尼龙膜(Roche)上，并通过在NaOH 0. 4M中温育膜5分钟来使所述载体变性。然后将膜 在2X SSC (柠檬酸钠盐缓冲液)中短暂清洗，之后风干。在5X SSC, 5X Denhardt' s溶液中 于55°C下进行预杂交步骤60分钟。将膜在55°C下于IX SSC中与IOnM探针一起温育120 分钟。在IX SSC中于55°C下清洗(进行5分钟)3次后，在Typhoon成像系统(Amersham Bioscience)上扫描膜。如图9中所示，本发明的探针使得能够在严格条件(55°C和低盐)下检测靶核酸， 然而标准探针却不能。在错配的靶上未检测到信号，这显示本发明的探针的高特异性。·探针的序列SEQ ID N° 23(N14) 5' _ 荧光素-AAG ATG GAA CCG CT-3'SEQ ID N° 25(S4N14) 5' _ 荧光素-S4-AAG ATG GAA CCG CT-3'S4 = 4个精胺残基错配位点以下划线标示。参考文献Bernard PS, Ajioka RS, Kushner JP, Wittwer CT. Homogeneous multiplex genotyPing ofhemochromatosis mutations with fluorescent hybridization probes. Am J Pathol. 19980ct ； 153(4) : 1055-61.Demidov W, Frank-Kamenetskii MD. Two sides of the coin :affinity and specifjcity ofnucleic acid interactions. Trends Biochem Sci. 2004Feb ；29 (2) 62-71. Reviewde Roda Husman AM, Walboomers JM, van den Brule AJ, Meijer CJ, Snijders PJ. The use ofgeneral prjmers GP5 and GP6 elongated at thejr 3 ' ends with adjacent highly conservedsequences improves human papillomavirus detection by PCR. J Gen Virol. 1995Apr ；76(Pt4) :1057_62.Hesselink AT, van den Brule AJ, Groothuismink ZM, Molano M, Berkhof J, Meijer CJ, Snijders PJ. Comparison of three different PCR methods for quantifying humanpapillomavirus type 16 DNA in cervical scrape specimens. J Clin Microbiol. 2005S印；43(9) :4868_71.Holland PM, Abramson RD, Watson R, Gelfand DH. Detection of specific
polymerase chainreaction product by utilizing the 5 ' ----3 ' exonuclease
actjvity of Thermus aquaticus DNApolymerase. Proc Natl Acad Sci USA. 1991 Aug 15 ；88 (16) :7276-80.Livak KJ, Flood SJ, Marmaro J, Giusti W, Deetz K. Oligonucleotides with fluorescent dyes atopposite ends provide a quenched probe system useful for detecting PCR product and nucleicacid hybridization. PCR Methods App1. 1995 Jun ； 4(6) :357-62.Luderer R, Verheul A, Kortlandt W. Rapid detection of the factor V
15Leiden mutation by real-time PCR with TaqMan minor groove binder probes. Clin Chem. 2004Apr ；50 (4) 787-8.Pegg AE. Recent advances in the biochemistry of polyamines in eukaryotes.Biochem J. 1986Mar 1 ；234 (2) 249-62. Review.Pons B, Kotera M, Zuber G, Behr JP. Online synthesis of diblock cationic oligonucleotides forenhanced hybridization to their complementary sequence. Chembiochem. 2006Aug ；7 (8) : 1173-6.Tabor Cff, Tabor H. Polyamines. Annu Rev Biochem. 1984 ；53 749-90. Review.
权利要求
通过与寡核苷酸 寡聚阳离子缀合物杂交来操作、分离、检测或扩增样品中的靶核酸的方法，其包括让所述核酸与寡核苷酸 寡聚阳离子缀合物反应，所述寡核苷酸 寡聚阳离子缀合物包含至少直接地或通过连接体基团连接在一起的Ai和Bj部分其中.Ai是i聚体寡核苷酸，i＝3至50，其中Ai是具有天然或非天然发生的核碱基和/或戊呋喃糖基和/或天然磷酸二酯键的寡聚体，其任选地包含标记物基团.Bj是j聚体有机寡聚阳离子部分，j＝1至50，其中B是 HPO3 R1 (NH R2)n NH R3 O ，其中R1、R2和R3是相同的或不同的低级亚烃基，当n大于1时，NH R2部分是相同的或不同的； HPO3 R1 CH(X) R3 O ，其中R1和R3是相同或不同的低级亚烃基，并且X是腐胺、亚精胺或精胺残基。
2.权利要求1的方法，其中Ai选自脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和非天然发生的核碱 基例如锁(LNA)核苷酸、PNA以及它们的化学修饰物或取代物例如硫代磷酸酯、2'-氟或 2' -0- 焼基。
3.权利要求1或2的方法，其中Ai包含选自生色团/荧光团和/或猝灭基团的标记 物基团，或选自氨基或巯基修饰剂、间隔子基团、生物素、疏水链、胆固醇衍生物、抗原、蛋白 质、肽、磷酸基团或糖的化学部分。
4.权利要求1至3的任一项的方法，其中游离-OH基团存在于Ai的位点3'上。
5.权利要求4的方法，其中所述寡核苷酸_寡聚阳离子缀合物具有 结构IHO-3，Ai5' -Bj-R4 或结构IIHO-3，Ai5' -R5-BrR4 或结构IIIHO-3，Ail5，-BrAi2-R4 其中-、和‘是相同的或不同的，且如上文中对于&所定义；Ai2以3'至5'或5'至3' 方向排列；-R4是H或连接体、猝灭剂、标记物例如生色团或荧光团、或化学部分例如生物素、疏水 链、胆固醇衍生物、抗原、蛋白质、肽、糖或磷酸基团；-R5,与H、Ai和Bj不同，是Ai与Bj之间的化学上稳定的或可切割的连接体。
6.权利要求4或5的方法，其中所述分子结合靶核酸并且是DNA或RNA聚合酶的底物。
7.权利要求5或6的方法，其还包括步骤-将结构I、II或III的分子例如上文权利要求5中定义的分子与靶核酸分子在允许所 述分子与所述靶核酸分子杂交的条件下一起温育，和 -以所述靶核酸分子作为模板延伸所述分子。
8.权利要求5至7的任一项的方法，其通过使用至少一个结构I、11或III的分子允许进 行核酸扩增。
9.权利要求4至8的任一项的方法，其中所述分子用于逆转录。
10.权利要求1至3的任一项的方法，其中Ai的位点3'上的-OH基团被封闭。
11.权利要求10的方法，其中所述寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物具有 结构IVR4-Br3，Ai5' -R6 或结构VR4-Bj-R5-3' Ai5' -R6 或结构VI R7-3，Ai5-BrR4 或结构VDR7」，Ai5' -R5-Bj-R4 或结构VDIR7」，A115，-Bj-3' Ai25' -R4 或结构IXR7」，Ail5' -Bj-5' Ai23' -R8 或结构XR4-Bjl-3' Ai5' -Bj2-R6 其中-Ail和Ai2相同或不同，且如上文中对于Ai所定义；-Bjl和Bp相同或不同，且如上文中对于B」所定义；-R4和R6是相同的或不同的，R4如上文中所定义，且R6例如上文中对于R4所定义，和-R7和R8是相同的或不同的，它们与H不同，并且选自连接体、猝灭剂、标记物例如生色 团或荧光团、或化学部分例如生物素、疏水链、胆固醇衍生物、抗原、蛋白质、肽、磷酸基团或 糖。
12.权利要求10或11的方法，其中所述分子用于在包含DNA或RNA聚合酶的测定中检 测靶核酸。
13.权利要求10至12的任一项的方法，其用于检测靶核酸，包括步骤-将所述靶核酸与结构IV至X的探针例如上文中定义的探针在RNA或DNA聚合酶存在 的情况下，在允许所述探针与所述靶核酸分子杂交的条件下一起温育；和 -检测所述杂交。
14.权利要求10至13的任一项的方法，其中所述分子在扩增测定例如实时PCR中用作 探针。
15.权利要求10或11的方法，其中所述分子用作夹钳以抑制靶核酸的检测或扩增。
16.权利要求1至5、10或11的任一项的方法，其通过使用至少一个结构I至X的分子 允许进行靶核酸操作，例如纯化、捕获和修饰所述靶核酸。
17.权利要求1至5、10或11的任一项的方法，其中至少一个结构I至X的分子用于检 测靶核酸。
18.权利要求1至5、10或11的任一项的方法，其中至少一个结构I至X的分子用于区 分野生型和突变型靶核酸。
全文摘要
本发明涉及通过与寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物杂交来操作、分离、检测或扩增样品中的靶核酸的方法，其包括使所述核酸与寡核苷酸-寡聚阳离子缀合物反应，所述缀合物包含至少直接地或通过连接体连接在一起的Ai和Bj，其中，Ai是i聚体寡核苷酸，i＝3至50，其中Ai是具有天然或非天然发生的核碱基和/或戊呋喃糖基和/或天然磷酸二酯键的寡聚体，其任选地包含标记物基团。Bj是j聚体有机寡聚阳离子部分，j＝1至50，其中B是-HPO3-R1-(NH-R2)n-NH-R3-O-，其中R1、R2和R3是相同或不同的低级亚烃基，当n大于1时，NH-R2部分是相同的或不同的；HPO3-R1-CH(X)-R3-O-，其中R1和R3是相同或不同的低级亚烃基，X是腐胺、亚精胺或精胺残基。
文档编号C12Q1/68GK101978071SQ200880122761
公开日2011年2月16日 申请日期2008年9月12日 优先权日2007年12月27日
发明者N·勒纳, P·埃尔巴彻 申请人:聚加转染公司;国家科研中心;斯特拉斯堡大学