专利名称：一种利用scar标记进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法
技术领域：
本发明属于农业的蔬菜品种鉴定与良种领域，涉及白菜的品种鉴定和种 子纯度检验方法，特别是一种利用SCAR标记进行"金冠2号"大白菜的品 种鉴定和种子纯度检验方法。
背景技术：
对杂种种子遗传学纯度的检验，越来越引起种子生产单位的特别重视。 虽然田间形态学鉴定结果可靠，实施简单，但检测周期长，耗时费工，难以 满足当年收获，当年用种的要求。同功酶和蛋白质电泳技术已经在一些十字 花科蔬菜作物品种及杂种纯度检验中得到了应用，但是由于其存在组织特 异性，在不同器官、不同生长时期带型差异不稳定等因素，及其多态性不丰 富，谱带较少，差异有限等缺陷，难以满足越来越多的品种检测要求。分子标记是近年来研究的热门领域，它以DNA为研究对象，具有以下优 越性(1)直接以DNA的形式表现，在植物体的各个组织、各发育时期均可 检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否的问题；(2)数量极多，遍 及整个基因组，可检测到的基因座位几乎是无限的；(3)多态性高，自然界 存在着许多等位变异，不需专门创造特殊的遗传材料；(4)表现为"中性"， 不影响目标性状的表达，与不良性状无必然的连锁；(5)有许多分子标记表 现为共显性(codominance)，能够鉴别出纯合基因型与杂合基因型，提供完整的遗传信息，因而现已形成许多分子标记系统。PCR技术是近年来发展起来的DNA分子标记之一，与RFLP相比，RAPD 标记具有以下特点(1) RAPD的引物具有通用性，同一套引物可适用于不 同生物基因组的分析。相反RFLP标记具有种族特异性，只在一定的种属范围内可相互使用；(2) RAPD技术简单成熟，可程序化作业，特别适于大批 量检测；(3)由于引物的随机性，RAPD标记几乎可覆盖整个基因组；(4) RAPD标记一般表现为显性遗传，不能区分杂合型和纯合型；(5) RAPD标记一般可以同时检测多个位点，很适于快速构建遗传图谱和不同材料多态性筛 选；(6) RAPD分析不使用同位素，因而比较安全，也不受特殊地区规定限 制；(7) RAPD技术DNA用量少，不受植株生长条件、时期的限制。所以， RAPD分析非常适于大规模样品的植物育种、种群遗传学和生物多样性等众 多研究领域。SCAR标记，即序列特异扩增带，是基于RAPD发展起来的一类标记，在对 多态性RAPD产物测序的基础上，设计一对新的引物，特异地扩增一个在遗传 上定义为一个位点的DNA区段。在对多态性RAPD产物测序的基础上，设计一 对新的引物，特异地扩增一个在特定位点的DNA片段， 一般在原RAPD引物的 3'与5'端延长14个碱基，利用两端各24个碱基的引物进行特异扩增，因此， 该方法与RAPD相比具有如下优点由于使用较长的引物和高退火温度，因此 具有重复性和稳定性好，带型简单等优点，因此，SCAR标记成为分子育种、 品种鉴定和种子纯度检验的首选标记。发明内容本发明的目的是提供一种利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯 度检验方法。为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是， 一种利用SCAR标记进 行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法，该方法以"金冠2号"父母本及 Fi代种子为研究材料，首先进行PCR反应体系优化，筛选特异性引物，进一 步对特异片段克隆测序，转化为SCAR标记，应用于"金冠2号"大白菜品 种鉴定和种子纯度检验，其特征在于，具体包括以下步骤1)材料的准备以橙色大白菜新品种"金冠2号"及其亲本种子催芽育苗后移栽至大田， 在幼苗期单株编号，随机选取100—200株，于苗期取幼嫩叶片提取DNA备用， 成株期根据品种特性鉴定生物学性状；2) DNA提取'采用CTAB法，其过程为，取0.2g幼嫩叶片，液氮下研磨成粉末；加入 750叱CTAB提取液后转入至1.5mL离心管中；然后65。C水浴30niin，其间振荡 混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液和等体积的氯 仿、异戊醇混合溶液各抽提一次，于常温下在12000r/min条件下离心2次， 每次10min;取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，于4T:条件下离 心15min;离心转速为12000r/min，离心后用70%乙醇清洗沉淀2 3次；加入 DNA贮存液，经DNA纯度检测证实纯化度，存于—20'C冰箱中备用；3) SCAR引物设计 母本特异性引物SC134-1200 fS134M: TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTC rS134M: TGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG 杂种特异性弓I物SC266-260fS266F: AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAG fS266F: AGGCCCGATGATGATAAATCATTG4) SCAR—PCR扩增采用25PL的PCR反应体系，其中包括1X缓冲液，2.0腿ol/L MgCl2， 2. 5,1/L d證s, 0. 3Hmol/L引物，1U TaqDNA聚合酶，30 50ng模板DNA; 反应程序SCAR扩增程序为，94。C预变性4min， 94。C变性lmin， 55。C退火lmin， 72。C延伸90s，循环30次，最后72。C延伸10min;扩增产物在含5Pg/mLEB的1.5y。琼脂糖胶，120V下电泳1.0h，电泳后在紫 外灯下观察并照相；5)SCAR标记的特征 A、 SC134 — 1200标记用SC134-1200的SCAR引物对"金冠2号"群体鉴定，在母本和杂交种中可 以扩增出S134-1200的特异条带，而父本及其自交苗中不能扩出S134-1200 的特异条带，因此利用该比较可以正确的鉴定"金冠2号"反交种子；鉴定 群体中有扩增带单株的比率就是反交种子的杂交率； B、 SC266-260标记用SC266-260的SCAR引物对"金冠2号"群体鉴定，母本、父本均没 有扩增带，只有真杂种有扩增带，没有扩增带的可能是假杂种；利用该比较 可以正确的鉴定"金冠2号"正交、反交单收以及混收种子；鉴定群体中有扩增带单株的比率就是反交种子的杂交率。本发明的方法通过134个金冠2号随机群体的鉴定，鉴定结果与田间鉴 定相一致。
图1是引物S47对"金冠2号"及其亲本的扩增结果，其中，M. DL2000 Marker; 1、母本，2、父本，3 15、杂交种；图2是引物8134对"金冠2号"杂交种及其亲本的扩增结果，其中，M. DL2000 Marker; 1、母本，2、父本，3 18.、杂交种；图3是引物S4对"金冠2号"杂交种及其亲本的扩增结果，其中，M. DL2000 Marker; 1、母本，2、父本，3 18、杂交种；图4是引物S73对"金冠2号"杂交种及其亲本的扩增图谱，其中，M. DL2000 Marker ; 1.母本；2.父本；3 18.杂交种；图5是引物3494对"金冠2号"杂交种及其亲本的扩增图谱，其中，M. DL2000 Marker; 1.母本；2.父本；3 19.杂交种图6是引物5266对"金冠2号"杂交种及其亲本的扩增图谱，其中，M.DL2000 Marker; 1.母本；2.父本；3 19.杂交种；
图7SC134—1200引物对"金冠2号"群体扩增的结果，其中，M. DL2000 Marker ; 1.母本；2.父本；3 17.杂交种；
图8 SC266-260引物对"金冠2号"群体扩增的结果，其中，M. DL2000 Marker ; 1 2.母本；3 4.父本；5 20.杂交种；
以下结合附图和发明人进行"金冠2号"大白菜的品种鉴定和种子纯度检 验对本发明作进一步的详细说明。
具体实施例方式
本发明的具体实施按以下步骤进行
1、 材料的准备
以橙色大白菜新品种"金冠2号"及其亲本种子催芽育苗后移栽至大田，
在幼苗期单株编号，随机选取100—200株，于苗期取幼嫩叶片提取DNA备用。
成株期根据品种特性鉴定生物学性状。
2、 DNA提取
采用CTAB法，过程为，取0.2g幼嫩真叶，液氮研磨成粉末；加入750叱 CTAB提取液后转入至1.5mL离心管中；然后65X:水浴30min，其间振荡混匀几 次；分别用等体积的(Tris-饱和酚氯仿异戊醇=25:24:1)和等体积的 (氯仿异戊醇=24:1)各抽提一次于12000r/min离心10min (2次，常温)。 取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，于12000r/min离心15min (4 。C)。用70%乙醇清洗沉淀2 3次；加入DNA贮存液(70%体积分数的乙醇，其 中加入0.3moL/LNaAc溶液)后，经DNA纯度检测，证实纯化较好。存于—20 "C冰箱中备用。
3、 RAPD扩增
PCR采用25叱的反应体系，其中包括1X缓冲液，2.0mmol/L MgCl2 ， 2.5mmol/L dNTPs， 0. 3tool/L引物，1U TaqDNA聚合酶，30 50ng模板DNA。反应条件预变性94。C/4min、 94°C/60s、 36°C/60s、 72°C/90s， 45个循环， 72-C延伸10min。最后RAPD扩增产物在含5^g/mLEB的1. 5%琼脂糖胶，120V下 电泳1.0h，电泳后在紫外灯下观察并照相。
4、 特异性引物的筛选
随机抽取父本、母本及杂交种各10株，分别建立混合池，进行RAPD引物 筛选。在320条引物中有208条引物可扩增出稳定而清晰的条带，不同引物扩 增的RAPD条带数目为0 11不等，RAPD片段大小在O. 4kb 3.0kb之间，其中 在亲本和杂交种中表现扩增多态性的引物有96个，占总引物的30%。经4次 以上重复筛选，有6个引物能稳定扩增出特异条带，分别是S4、 S47、 S73、 S134、 S266、 S494。
5、 特异性引物对金冠2号群体的鉴定
1) S47及S134对"金冠2号"群体的鉴定
用引物S47对134个"金冠2号"杂交种单株DNA进行RAPD扩增，在母本 及132个单株中都扩出S47 —700的特征带，其中2个单株"13"(附图1)和"56" (未显示)及父本没有扩增出S47—700特征带，且其扩增谱带与父本带型相 似，可以认为单株"13"和"56"可能是父本自交苗，检测杂交率为98.5%。
用引物S134进行相同的扩增时，表现一致的结果。母本及132个单株都 扩出S134—1200的特征带，其中2个单株"17"(附图2，与附图l的"13"为 同一单株)和"56"(未显示)未扩出S134 — 1200的特征带，而且单株"17" 和"56"与父本的扩增带型相似，再次验证了这2个单株可能是父本自交苗， 检测杂交率也为98. 5%。
由此看出，利用引物S47及S134扩增出的母本特征谱带，均可以将混杂的
父本种子检出，但无法区分母本与杂交种，因此对于鉴定反交种子是有效的。
2) 引物S4对"金冠2号"群体的鉴定
用引物S4对134个"金冠2号"杂交种单株DNA进行RAPD扩增，结果表明，父本及130个单株都扩出S4—370特征带，其中4个单株"17"(附图3)、"20"、 "66"和"78"(未显示)均未扩出此特征带，扩增出的带型与母本带型相 似，说明这4株可能是母本自交苗，在用S47、 S134时没有被发现。而前面发 现的父本自交株"13"(附图l)没有表现出特异性，表明引物S4是父本特异 性扩增引物，可以将母本与杂交种区分，其检测杂交率为97%。但无法将父 本与杂交种区分，因此对于正交种子的鉴定是有效的，如果与母本特异性扩 增弓I物联合使用，则可以同时鉴定出父本自交株和母本自交株。
3) 引物S73及S494对"金冠2号"群体的鉴定
对134个金冠2号杂交种单株DNA用引物S73进行扩增，有128个单株同时 扩增出与父本和母本条带，即父本的特征带S73 — 730和母本的特征带S73 — 660 (附图4，部分图片)，有4株(附图4的"17"和"20"、 "66"和"78" (未显示))扩增带型与母本带型相似；有2株(即附图l的"13"， "56")扩 增带型与父本带型相似，再次验证了在所选的134个单株中，可能有4株母本 自交苗，2株父本自交苗(未显示)，其检测杂交率为95. 5%。
在附图4中，单株"17"(即附图1中的"13"，附图2中的"17")的 扩增带型都与父本带型相似，没有扩出母本特征带S73—660，与引物S47 及S134检验结果一致，再次提供了该单株可能为父本自交苗的证据；用引 物S73对附图3中的单株"17"进行扩增，结果母本带型相似，再次验证该
单株可能为母本自交苗(图片未显示)。
4) 引物S266对"金冠2号"群体的鉴定
对134个金冠2号杂交种单株DNA用引物S266进行扩增，有128个单株扩增 出不同于父本和母本条带，即特征带S266 — 260 (附图6，部分图片)，有4 株(附图4的"17"和"20"、 "66"和"78"(未显示))扩增带型与母本带 型相似；有2株(即附图l的"13" , "56")扩增带型与父本带型相似，再次 验证了在所选的134个单株中，可能有4株母本自交苗，2株父本自交苗(未显示)，其中附图6中的单株"14、 15"为人为混杂的其它白菜种子，其检测 杂交率为95. 5%。
6、特异条带的测序及SCAR引物设计
将所需条带在紫外灯下挖出，放入1.5mL管中，用琼脂糖回收试剂盒回 收片段，参照《分子克隆实验指南》中的方法进行重组质粒的转化与筛选。 用PCR进行检测。目的片断委托博雅公司测序并提供结果。根据序列结果设 计了8对SCAR引物并合成。结果如下
1) 随机引物Sa: GGACTGGAGT
测序时标记名称S4-414F，实测长度383bp(SEQ ID NO:l) SCAR引物
fS4F: GGACTGGAGTGCTAGTTTGAGAAC rS4F: GGACTGGAGTTTACTCTGCTGTG
2) 随机引物S47: TTGGCACGGG
测序时标记名称S47-700M，实测长度666bp(SEQ ID N0:2) SCAR引物
fs47-700m: TTGGCACGGGATGTTGAGGTTG rs47-700m: TTGGCACGGGCCCGCTTTAAGAAC
3) 随机引物Su4: TGCTGCAGGT
测序时标记名称S134-1200M，实测长度1091bp(SEQ ID N0:3)
SCAR引物TGCTGCAGGT
fS134M: TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTC
rS134M: TGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG
4) 随机引物S73: MGCCTCGTC
测序时标记名称S73-671M，实测长度660bp(SEQ ID N0:4) SCAR引物fs73F: AAGCCTCGTCTGTGGTAAG rs73F: AAGCCTCGTCACCATCTTC
5) 随机引物S73: AAGCCTCGTC
测序时标记名称S73-750F,实测长度728bp(SEQ ID N0:5) SCAR引物
fS73-750F: AAGCCTCGTCTGATGTAAAACAC rS73-750F: AAGCCTCGTCGGACAAGATTTG
6) 随机引物S鹏GGACGCTTCA
测序时标记名称S494-3謂，实测长度376bp(SEQ ID N0:6) SCAR引物
fS494M: GGACGCTTCAATAATATTG rS494M: GGACGCTTCAGGTTCAGAC
7) 随机引物S柳GGACGCTTCA
测序时标记名称S494-1770F，实测长度1771bp(SEQ ID NO:7) SCAR引物
fS494F: GGACGCTTCAGAAATATTTAATA rS494F: GGACGCTTCACGGAAGGGCGAAG
8) 随机引物S加6: AGGCCCGATG
测序时标记名称S266-260F，实测长度294bp(SEQ ID N0:8) SCAR引物
fS266260F: AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAG fS266260F: AGGCCCGATGATGATAAATCATTG 7、 SCAR扩增与SCAR标记的验证 SCAR—PCR扩增
采用25叱的PCR反应体系，其中包括1X缓冲液，2.0mmol/L MgCl
122. 5腿ol/L dNTPs， 0. 3Mmol/L引物，1U TaqDNA聚合酶，30ng 50ng模板DNA。 反应程序SCAR扩增程序为94。C预变性4min， 94。C变性lmin, 55。C退火lmin， 72。C延伸90s，循环30次，最后72。C延伸10min。扩增产物在含5^/mLEB的1.5呢 琼脂糖胶，120V下电泳1.0h，电泳后在紫外灯下观察并照相。
将SCAR引物用于两亲本和F,的扩增，如果与RAPD扩增的目的片段大小位 置相同则说明SCAR标记转化成功。在8对SCAR引物中，SC4-370、 SC47_700、 SC73-730和SC73-660、 SC494-400和SC柳-1770的引物在"金冠2号"杂交种群体 及其亲本扩增时未表现出多态性，只有SC134-1200与SC266-260标记的2对引 物对群体扩增的结果与RAPD的结果完全相符，说明SCAR标记转化成功。其引
物如下
母本特异性引物SC134-1200 fS134M: TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTC rS134M: TGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG 杂种特异性引物SC266-260 fS266F: AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAG fS266F: AGGCCCGATGATGATAAATCATTG SCAR标记的特征
A、 SC134—1200标记
用SC134-1200的SCAR引物对"金冠2号"群体鉴定，从附图7可以看出， 在母本和杂交种中可以扩增出S134-1200的特异条带，而父本及其自交苗中 不能扩出S134-1200的特异条带，因此利用该比较可以正确的鉴定"金冠2
号"反交种子。鉴定群体中有扩增带单株的比率就是反交种子的杂交率。
B、 SC266-260标记
用SC266-260的SCAR引物对"金冠2号"群体鉴定，在附图8中，可 看出母本、父本均没有扩增带，只有真杂种有扩增带，没有扩增带的"10"
13和"15"等可能是假杂种。对134个"金冠2号"群体进行鉴定，发现有6 株假杂种，与田间鉴定相一致。禾U用该比较可以正确的鉴定"金冠2号"正 交、反交单收以及混收种子。鉴定群体中有扩增带单株的比率就是反交种子 的杂交率。
8、 SCAR标记对"金冠2号"群体的验证
用SCAR引物SC134-1200对"金冠2号"群体鉴定，其中父本未扩出 S134-1200的特异条带，同样在杂交种中的"11"和"14"未扩出S134-1200 的特异条带，而这2株也正是用RAPD引物鉴定出的两个父本自交苗，与RAPD 扩增结果吻合。
用SCAR引物SC266-260对"金冠2号"群体鉴定，在母本、父本和杂种 "10"和"15"均未扩出S266-260的特异条带，将此结果与RAPD扩增结果比 较发现，"10"为母本自交苗，"15"为父本自交苗。
用SCAR引物S266-260和S134-1200对整个"金冠2号"群体进行鉴定与 RAPD鉴定结果一致，与田间性状观察结果相吻合，即在对134个"金冠2号" 群体进行鉴定，发现有2株父本自交苗，4株母本自交苗。 特异RAPD片断核酸序列及SCAR引物序列
1) 随机引物S" GGACTGGAGT
测序时标记名称S4-414F，实测长度383bp(SEQ ID N0:9) SCAR引物
fS4F: GGACTGGAGTGCTAGTTTGAGAAC rS4F: GGACTGGAGTTTACTCTGCTGTG
2) 随机引物S47: TTGGCACGGG
测序时标记名称S47-700M，实测长度666bp; (SEQ ID NO: 10) SCAR引物
fs47-700m: TTGGCACGGGATGTTGAGGTTGrs47-700m: TTGGCACGGGCCCGCTTTAAGAAC
3) 随机引物Sm: TGCTGCAGGT
测序时标记名称S134-1200M，实测长度1091bp(SEQ ID NO: 11);
SCAR引物TGCTGCAGGT
fS134M: TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTC
rS134M: TGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG
4) 随机引物S73: AAGCCTCGTC
测序时标记名称S73-671M，实测长度660bp(SEQ ID NO: 12); SCAR引物
fs73F: AAGCCTCGTCTGTGGTAAG rs73F: AAGCCTCGTCACCATCTTC
5) 随机引物S73: AAGCCTCGTC
测序时标记名称:S73-750F，实测长度728bp(SEQ ID NO: 13); SCAR引物
fS73F: AAGCCTCGTCTGATGTAAAACAC rS73F: AAGCCTCGTCGGACAAGATTTG
6) 随机引物S494: GGACGCTTCA
测序时标记名称S494-399M,实测长度376bp(SEQ IDN0:14); SCAR引物
fS494M: GGACGCTTCAATAATATTG rS494M: GGACGCTTCAGGTTCAGAC
7) 随机引物S柳GGACGCTTCA
测序时标记名称:S494-1770F，实测长度1771bp(SEQ IDN0:15); SCAR引物
fS494F: GGACGCTTCAGAAATATTTAATArS494F: GGACGCTTCACGGAAGGGCGAAG 8)随机引物S266: AGGCCCGATG
测序时标记名称S266-260F，实测长度294bp(SEQ ID N0:16); SCAR引物
fS266F: AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAG fS266F: AGGCCCGATGATGATAAATCATTG 。<110〉西北农林科技大学
<120> —种利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法 <160> 16
<210> 1
<211> 383bp
<212> DNA <213>随机引物S4
<400> 1
GGACTGGAGTGCTAGTTTGAGMCAAAAACTTGGTTTAGTGCTATTTTGGTCTTTTTCTC 60
TTATTTAAACTCAAGCTTGTACTCTTCATTCTTCTATGGCAAAGATTATATTTTCAAACT 120
GAATTTTTTATATACATAGCC嵐MMATATGTTTMTAGTCCGTCCGTAGAGATTCAG 180
ATTAATCCATATACCTMTCTGCATTGTTCTAAGCTCATGAGATATCTCMGCACCAACC 240
CTTGCATAATATTTTCAACTACATCAGAGACTACACCTTCAGATTCTCCACCACAATCCA 300
ACCMAGACATGGCTTCATCAGATCAACCTCGACGACCTGATCCMTGTCCTTGGAGAGT 360 CACAGCAGAGTAMCTCCAGTCC 383
<210> 2
<211> 666bp
<212> DNA
<213〉 随机引物S47
<■> 2
TTGGCACGGGATGTTGAGGTTGGTMGCATCTATACCTAGCTCAGCCATTAGAGTTAGAG 60 TCCATTCACGGCTMCTTACCACCAACGMGAATTCCTCGCATAAAATGATTCTTACATT 120 CTATAGATACTGTAAAAGCCAACTCATGTTTCTGCG嵐ATAAATMGAAAGCTCATTTT 180 TTTCTTTTATTATGCTAGCCTTTCTMATATCCTTCTCTTGTTGATGAAGCGCCCCCTTA 240 TGGAGTTGAGCCTGACTTGGGCAGCCGCTTTCATTGTTGTGCCATTATATTCTTTTTTCA 300 TGTCTTTTATGGATGGCTGTTCTCATTCCGTCGGAGGCGATGGAAGCGGTGCCAGCTCTT 360 CGAAGCGACCGCGTCTCGACCTGCCCAGMCMCAGGAATAGTTTMTCT嵐M嵐AA 420 TATGAAGAAGTAAGAAAGATC嵐ATGGAGTTAGCCGAACTGATTGGCTCCCTAATTGAC 480 CMGCGAAAGAGGGGCTGCMTTTTCCGCCCATAAGGGGAGTGCCTTCGCCACCGGTAAT 540 GTGTGGAAGAGCTMT嵐CCGMTTGGGAACMTGAGMGGCCAGACCAGMGGGMM 600 CGACCCCMTGGGGAGATTACCGATTTTATAAATAAMAGMGTTCTTAAAGCGGGCCCG 660 TGCCAA 666
<210> 3
<211> 1091bp
<212> DNA
<213> 随机引物S134
<400> 3TGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTCAATATTTGACAATATATTGATCAGTGATGACCCGGMT 60 ATGCAAGGAGCATGGTGGATGACTATTTTGCTCAGCACAGAGAGGTAGGCTTCTCCATGC 120 CTTTGGGATACCTTCTTTTTGCTTCTTTTTAGACMAGTTMATGAGTTTCTGCATGATT 180 TTATTATAGMAATGTCTTATTAGTAATCTGATGTGCTTATATATACTCTTCTGACCAGT 240 CTGAGAAGGAGTTATTTGCGGMGCTGAGAMGAAAMAAAGCTAGAGAAGATGAGGTTT 300 GTAGTTTTCMAACMGTCCTTACTTGCTTTTAAMTCTTCTCTGTTTATCTTAATCATG 360 ATCTCATACMTTTGACGATTGCAGGMGCTAGGATAGCAAGAGMGAAGGGGAACGTAG 420 ACGMMGAGAGGGGTGACCGGTATGGACACAGGGACAGGAGGCATCGTTACMACGGGT 480 ACATACTCAATGAGACCMCTCAGTTCTACAGTTTTCTTTCTCCTTCTCAACACTGTTAG 540 TTCTGGMTATAAGTGAGTGACTAAGTAT嫩CGTTTTGTTTTGCAGCACCACCGACGTG 600 GTTACATGGACGATTACCATGTAAGTMACTAAGTGGTTTTCTATTCAACCACTTTTAAA 660 TGCTTTATGCGTTTTAGTACTGMTCATCTTMCCGTTTTCGTGTAGGATGAGCTATMG 720 GCGCAGTGGTGGCCTGGTGGGGGATTTGGCAATGACMCCMTAAMGCAAGTATTCATT 780 A线TCATCATACCTAGAGAGCTGG嵐CTATATGGTTGGTTTTTGTAGTTTGTATGATT 840 GTAATATGTATCATATCACTTCTTTTTTTTTTTTGTCATCTGAAGTTTCATATATCACAA 900 AGGTTMCATTGCMACACCTCCTTTACACGGATCCMCACAAAAAGCMTTCTAAACCA 960 AGGACMACTAACACTCC嵐GTCTTTAGTGTACCAAAAAATTTTCGAAGGAGACAACTT 1020 CAAGTCAAAGAGAGGCC嵐CGTTTCTCATTTTCAAAGACGTCCTGCMCCMMAGGAT 1080 MCCTGCAGCA 1091
<210> 4
<211> 660b p
<212> DNA <213>随机引物S73
<400〉 4
AAGCCTCGTCTGTGGTMG嵐TTAACCATCATGTTATCTTTGTCCTTGTGTTTTGGTCT 60 CTGGGTCCTMGATTTACTCAATCATGTCTGACGTTCTCAGGATCTTAGCAAGAAGCAGT 120 TTAAGMGTCTATGACCMG嵐TCACATTCATGGTGGTGGGACAGTCACAATTGTCCCA 180 AGAACTCGAAGTGGCTTGCTCAGAATCTGGAGAGTATGTTGCCTCACTTATCATTGAGAT 240 ACCTATCTCCACTTAAATGTAGATCTTGAACTTGTTCTTATTATGGCTTCTCAGAGATGG 300 ATGACCGTGTGAAACACATGTTMAGTTGATTGAAGMGACGCAGACTCTTTTGCCMGA 360 AAGCTCAGATGTATTACCAGAAGCGTCCCGAGTTMTCCACCTTGTGGAGGAGTTTTACC 420 GCATGTATCGCGCTTTGGCTGAGCGTTATGATCAAGCTAGTGGTGMCTTCAGAAMTTC 480 ATCTCTCTGGGATACAGTCACAGGGCTCTCTTGAG嵐TCATCTCCTACTAATTCCCAAG 540 AGAMTCGAGTCACCCTCATAAGGAAGAGGAAGACTCATCATCTCTGTCTGATTCTGATT 600 CTGACTCTAAATCGGTTCCTGATCATTCCTCTGTTMTGATGMGATGGTGACGAGGCTT 660
<210> 5
<211> 728bp
〈212> DNA
〈213〉 随机引物S73
<400> 5
AAGCCTCGTCTGATGTAAAACACACCGCTTGTGCTGTTTTTTGAMGAAGCAGTGTCCAT 60
18TTTCTTCCTTTCTCGTTGACTAGATCTATCTCACAGGGCTTGTTGTGCTCATTAAACGAC 120 ACAACCGTAMGTCTTTAG AAAGATCCTGGMMAAMCAAAGAAATAATACATCACTCA 180 CAGTATCATACACTTGACTACTTACAAAAGGTMACGAGGAGTGTAGTAATTAGTTACCA 240 MCGATCTTTGATGGGGCTATMGGTGTGACACGTGCTCTGAGGATACAAGAG磁CCTG 300 CTTTTGTGCTCTTGTTCACCAAAATGTTCCCTGAATCACAACAATCTTCATTTACATTTT 360 ACTACCAAACCAAAAACTCAAMCATATACCACTTATGTCGTTTCMGAAACGAAMCAC 420 CTTACCTGCGTCATCCTCTCCTCCATCGTCATCATCATCATATTCGTCTTCTCCATCCTC 480 AGATTCAGAATAGTCATCATCAGTCTCAACATCGTCAGTATCAACCAAGCTAGGAGACGC 540 GTGGTGACTTATGTCACAAGAATCCGACCGAGGGGACACAGATACATGMAGATCTCGTC 600 TCCATCGTGTCTGMMCCAAGAGGTCTCCGTCTCTGAAACTATGAGCTTTGGCGMCTC 660 TTCCCAGCCGCCGCCGGCGAGCCTGCTTCCCTCTAGTTTCACTTTCCAAATCTTGTCCGA 720 CGAGGCTT 728
<210〉 6
<211〉 376bp
<212> 隨
<213>随机引物S494
<400> 6
GGACGCTTCMTAATATTGMATATATTTTTTAAAAAAATATAATMTTGGMTATTGCG 60 TMTTMGTTTACGTTTTTGGGMTTTCACATATTAMTMTTAATTACATATTTTGAGG 120 TMATATTCMGAGACTGTGATTTTCATTAATCAATCATTAGAAGAGAATA雄GCATTA 180 AAAAAATCTTCAGTTTATTTTAAAAGAMCAGTTGTGACAAATGTTTTTATCAGACMGA 240 CAACMCAAATAATTAAAAAGACAGTGTCCACCGCCMAAG嵐CTCMCTCT嵐GCTT 300 AAATATGMGAGAATCAAGTC嵐GCCGGAGTCTCTGC嵐CATATTGGMCACTTTGTC 360 TGAACCTGMGCGTCC 376
〈210〉 7
<211〉 1771bp
<212> DNA
〈213〉 随机引物S494
<400> 7
S494-1775F:(-47)
GGACGCTTCAG嵐TATTTAATAAAATAAAAAAAAGACCACTAAAATCTTAAAGACTAAA 60 TAGTA患AGATAMGATAC嵐CGTGTGAAGCMAACCCAAGCCGACACGTTCAATTCC 120 ATCGTTTTGATCCGGTTCCGGCAGGCACGAGCTTTAGGCCGGTTGGTTAAAACACGCGCT 180 TTGGACCATTTAGGMACACAGTCAGGTTCTCGTGATTTCTTGCTTATAATGGGCCCCTC 240 CCACCCATATGGTCAGCT嵐CGAGTGAAATTCTAGGGCACACCTTTGATTATTTTTTTT 300 AAATAATCAAAAAATTATTATTAGMACCGAAAATTATTATTTATTCCMAGACATGMT 360 TCCTACMGTCCACMCTGTTGTTTATGGTC嵐TCAT嵐GCAAAACTMTGTTTTCCA 420 AATAGTTAATGGAMMAAGAAAAACAAAAGCMATGCATCTTGCGTTGTTGGAATGCAA 480 AAAGAGAGAAAACGATACGTACCTMTGTTAATTCTMTTAGTTAGTTATAGAATGAGGA 540 GGTACATTAAAAAGGAAMTTAGTATTAGTACTCAGTTMGTATGCACGTGTGTGGGAAG 600 TATGGTGGCGAAACTATACAACCAACCCCTAGTAGATGGCTAGTTGTACATGTCTCGTGA 660 CGTATACATCATATATATMTAMTACGAACATAGAMTTMTAGGACTTAGTTGTTGCG 720AATATACGTAAAATCAAATAAAACCMCCATTCMTGTTCTTGGTMGTAACGAMTAAA 780
ACGGAAGCMGAAGGAGMCCACATAMAGGGAGCTMCTCCTGTACACGTTGTGCTTCA 840
TCTGCCCGTCCGTCAAACTACCACACTCCCTTCTCTTTTCCCCTTTGTCATCTTGTATM 900 TAATATCTCACTCTCCCATGCTTTCTAACAT 931 S494-1775F:(-48)
GGACGCTTCACGGAAGGGCGAAGGCCAAGGAGCTTGGTGAGCTGGTAGTCAGCACCAGGC 991
ATGTCMCTCCAGAGGTGGTGCAGAAGACMCGTGTGTGACCTTGGACTTAGGCTGACCC 1051
CACTCCTTGATGGCCTTCACTGCTGCATCTTTGCCTAGCTTAGGGACTTCMCCACCACG 1111
AGGTCTTGTCTAGCGTCGAGAGMGGAGCCATGTAGGCGCACATGTTAGGGTTCTCTTTC 1171
AAGAACTCCTCGGTCMGTGCATGTGGCGTTTTCTTATGGTCGACTTATCGCCTATTAGA 1231
GTC ATMTCMGTTAACTATGTGMCATACTAATAAGTACAGTTTMGGTAGMGACTAT 1291
T嵐TTTTCGGTTTTATCTATTTAATACATTTTTTTTTGTTAGTTMTGMCTA雄GAT 1351
ACGGAT雄ACTGGTGMTTATTT嵐TGTATTTTGAAAATGTACAAC嵐TTTT嵐AA 1411
CTMAAATGATMACGGATGMTTATATGCCA嵐TTCT嵐TGGMAAATACAAAGTAG 1471
GGTTTGTTAAGACATACACATGCGCTTGAACTTCTCCTTMGGTCGGTCTTGTGTTCACT 1531
GTTGGTGATGCGGAAGTAGTAGTCTGGATACTCAGCTTGGAGCACATGGTTCGCAGGGTT 1591
GGCCGTACCTATCGCTAAGATGCCTGCAGGACCGTCTGCTCTCTGTGCCTTTCTGATCTC 1651
ATCCAACGAAGAACGCCCC ATCACC ATATTAAACCMCTACGTTTTMCTAAGTGTGATC 1711
GATGTGTTACTTTGCGTAATAAGCAAGTTATGTATGTATGTTTAGAAAGCATGCAGAGTA 1771
<210> 8
<211〉 294bp
<212〉 薩
<213> 随机引物S266
〈400〉 8
AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAGAAAATGGGTTTCGGCCGTTTTTAAAATAAAACATTGA 60 CGACAMAAAAMMAATMTTTGGCATCTCCCTCCATCTMATCATGCATGAC雄TGA 120 ATAAAAAGCTTTTATTATCATATGACGTCTATACMTGCGTATMTATGTTTCCTTTACT 180 TTATTTACTTGTCGTCTTTATCTTATTATATTATATGCTACATTATAGTCATTGTTAAAG 240 TCAGAGACTACAGGTATCATAAGGTTGCMCMTGATTTATCATCATCGGGCCT 294
〈210> 9
<211> 383bp
〈212〉 ■ 〈213〉随机引物S4
<400> 9
GGACTGGAGTGCTAGTTTGAGAACAAAAACTTGGTTTAGTGCTATTTTGGTCTTTTTCTC 60 TTATTTAAACTCMGCTTGTACTCTTCATTCTTCTATGGCAAAGATTATATTTTCAAACT 120 GAATTTTTTATATACATAGCCAAAAAAAATATGTTTMTAGTCCGTCCGTAGAGATTCAG 180 ATTAATCCATATACCTMTCTGCATTGTTCTAAGCTCATGAGATATCTCMGCACCAACC 240 CTTGCATAATATTTTCMCTACATCAGAGACTACACCTTCAGATTCTCCACCACAATCCA 300 ACCAAAGACATGGCTTCATCAGATCMCCTCGACGACCTGATCCMTGTCCTTGGAGAGT 360 CACAGCAGAGT嵐CTCCAGTCC 383<210> 10
〈211〉 666bp
<212〉 DNA
<213> 随机引物S47
<400> 10
TTGGCACGGGATGTTGAGGTTGGTMGCATCTATACCTAGCTCAGCCATTAGAGTTAGAG 60 TCCATTCACGGCTMCTTACCACCAACGMGAATTCCTCGCATAAAATGATTCTTACATT 120 CTATAGATACTGT嵐AGCCAACTCATGTTTCTGCGAAAATAAATMGAAAGCTCATTTT 180 TTTCTTTTATTATGCTAGCCTTTCTAAATATCCTTCTCTTGTTGATGAAGCGCCCCCTTA 240 TGGAGTTGAGCCTGACTTGGGCAGCCGCTTTCATTGTTGTGCCATTATATTCTTTTTTCA 300 TGTCTTTTATGGATGGCTGTTCTCATTCCGTCGGAGGCGATGGAAGCGGTGCCAGCTCTT 360 CGAAGCGACCGCGTCTCGACCTGCCCAGMCAACAGGAATAGTTTMTCTA雄AAAAAA 420 TATGAAGAAGTMGMAGATCMAATGGAGTTAGCCGAACTGATTGGCTCCCTMTTGAC 480 CAAGCGAAAGAGGGGCTGCMTTTTCCGCCCATMGGGGAGTGCCTTCGCCACCGGTAAT 540 GTGTGGMGAGCTAATAAACCGMTTGGGAACAATGAGMGGCCAGACCAGMGGGMAA 600 CGACCCCAATGGGGAGATTACCGATTTTATAAATA嵐AGMGTTCTTAAAGCGGGCCCG 660 TGCCAA 666
<210〉 11
<211〉 1091bp
<212> 薩
<213> 随机引物S134
<400> 11
TGCTGCAGGTGMGGCTGGTTCMTATTTGACMTATATTGATCAGTGATGACCCGGMT 60 ATGCMGGAGCATGGTGGATGACTATTTTGCTCAGCACAGAGAGGTAGGCTTCTCCATGC 120 CTTTGGGATACCTTCTTTTTGCTTCTTTTTAGACAAAGTTMATGAGTTTCTGCATGATT 180 TTATTATAGAAAATGTCTTATTAGTAATCTGATGTGCTTATATATACTCTTCTGACCAGT 240 CTGAGAAGGAGTTATTTGCGGMGCTGAGAMGAAAAAAAAGCTAGAGAAGATGAGGTTT 300 GTAGTTTTCMAACMGTCCTTACTTGCTTTTAAAATCTTCTCTGTTTATCTTAATCATG 360 ATCTCATACMTTTGACGATTGCAGGAAGCTAGGATAGCMGAGMGAAGGGGMCGTAG 420 ACGAAAAGAGAGGGGTGACCGGTATGGACACAGGGACAGGAGGCATCGTTACAMCGGGT 480 ACATACTCAATGAGACCMCTCAGTTCTACAGTTTTCTTTCTCCTTCTCMCACTGTTAG 540 TTCTGGAATATAAGTGAGTGACTAAGTATAAACGTTTTGTTTTGCAGCACCACCGACGTG 600 GTTACATGGACGATTACCATGTAAGTAAACTAAGTGGTTTTCTATTCAACCACTTTT嵐660 TGCTTTATGCGTTTTAGTACTGMTCATCTTAACCGTTTTCGTGTAGGATGAGCTATAAG 720 GCGCAGTGGTGGCCTGGTGGGGGATTTGGCMTGACMCCMTAAAAGCMGTATTCATT 780 AAAGTCATCATACCTAGAGAGCTGGAAACTATATGGTTGGTTTTTGTAGTTTGTATGATT 840 GTAATATGTATCATATCACTTCTTTTTTTTTTTTGTCATCTGMGTTTCATATATCACAA 900 AGGTTMCATTGCAMCACCTCCTTTACACGGATCCMCACMAMGCAATTCTAAACCA 960 AGGACMACTAACACTCCAAAGTCTTTAGTGTACC嵐AAATTTTCGAAGGAGACMCTT 1020 CAAGTCAMGAGAGGCCMACGTTTCTCATTTTCAAAGACGTCCTGCMCCAAAAAGGAT 1080 AACCTGCAGCA 1091
〈210〉 12
21<211> 660bp
〈212〉 DNA
〈213〉 随机引物S73
<400〉 12
AAGCCTCGTCTGTGGTMGAAATTAACCATCATGTTATCTTTGTCCTTGTGTTTTGGTCT 60 CTGGGTCCTAAGATTTACTCMTCATGTCTGACGTTCTCAGGATCTTAGCMGMGCAGT 120 TTMGMGTCTATGACCMGAMTCACATTCATGGTGGTGGGACAGTCACAATTGTCCCA 180 AGAACTCGAAGTGGCTTGCTCAGMTCTGGAGAGTATGTTGCCTCACTTATCATTGAGAT 240 ACCTATCTCCACTTAAATGTAGATCTTGMCTTGTTCTTATTATGGCTTCTCAGAGATGG 300 ATGACCGTGTGMACACATGTTMAGTTGATTGMGAAGACGCAGACTCTTTTGCCAAGA 360 MGCTCAGATGTATTACCAGAAGCGTCCCGAGTTMTCCACCTTGTGGAGGAGTTTTACC 420 GCATGTATCGCGCTTTGGCTGAGCGTTATGATCMGCTAGTGGTGMCTTCAGAAAATTC 480 ATCTCTCTGGGATACAGTCACAGGGCTCTCTTGAGAAATCATCTCCTACTMTTCCCAAG 540 AG磁TCGAGTCACCCTCATAAGGAAGAGGAAGACTCATCATCTCTGTCTGATTCTGATT 600 CTGACTCTAAATCGGTTCCTGATCATTCCTCTGTTMTGATGMGATGGTGACGAGGCTT 660
<210〉 13
<211〉 728bp
<212〉 DNA
<213〉 随机引物S73
<400> 13
MGCCTCGTCTGATGTAAAACACACCGCTTGTGCTGTTTTTTGAAAGAAGCAGTGTCCAT 60 TTTCTTCCTTTCTCGTTGACTAGATCTATCTCACAGGGCTTGTTGTGCTCATTAMCGAC 120 ACMCCGT嵐GTCTTTAGMAGATCCTGGAAAAAAAACAMGAMTMTACATCACTCA 180 CAGTATCATACACTTGACTACTTACAAMGGT嵐CGAGGAGTGTAGTAATTAGTTACCA 240 AACGATCTTTGATGGGGCTATMGGTGTGACACGTGCTCTGAGGATACAAGAGAAACCTG 300 CTTTTGTGCTCTTGTTCACCAAAATGTTCCCTGAATCACAACMTCTTCATTTACATTTT 360 ACTACCAAACCMMACTCAAMCATATACCACTTATGTCGTTTCMG嵐CGA嵐CAC 420 CTTACCTGCGTCATCCTCTCCTCCATCGTCATCATCATCATATTCGTCTTCTCCATCCTC 480 AGATTCAGAATAGTCATCATCAGTCTCAACATCGTCAGTATCMCCMGCTAGGAGACGC 540 GTGGTGACTTATGTCACAAGAATCCGACCGAGGGGACACAGATACATGAAAGATCTCGTC 600 TCCATCGTGTCTGAAAACCMGAGGTCTCCGTCTCTG嵐CTATGAGCTTTGGCGMCTC 660 TTCCCAGCCGCCGCCGGCGAGCCTGCTTCCCTCTAGTTTCACTTTCCAAATCTTGTCCGA 720 CGAGGCTT 728
<210> 14
〈211〉 376bp
<212> DNA
<213> 随机引物S494
<400> 14
GGACGCTTCMTAATATTGAAATATATTTTTTAAAAAAATATAATMTTGGMTATTGCG 60 TMTTMGTTTACGTTTTTGGGMTTTCACATATTAAATMTTMTTACATATTTTGAGG 120 TAAATATTCMGAGACTGTGATTTTCATTAATCAATCATTAGAAGAGAATAAAAGCATTA 180AAAAAATCTTCAGTTTATTTT嵐AGAAACAGTTGTGACAMTGTTTTTATCAGACMGA 240 CAACAACAAATAATTAAAAAGACAGTGTCCACCGCC嵐AGAAACTCAACTCTAAAGCTT 300 AMTATGAAGAGAATCMGTCAAAGCCGGAGTCTCTGCAMCATATTGGAACACTTTGTC 360 TGAACCTGAAGCGTCC 376
<210> 15
<211> 1771bp
<212> DNA
<213> 随机引物S494
〈400> 15
S494-1775F:(-47)
GGACGCTTCAG嵐TATTTAATAAAATAAAAAAAAGACCACTMMTCTTAAAGACTAAA 60 TAGTA嵐AGATAMGATACAMCGTGTGAAGCAMACCCMGCCGACACGTTCAATTCC 120 ATCGTTTTGATCCGGTTCCGGCAGGCACGAGCTTTAGGCCGGTTGGTTAAAACACGCGCT 180 TTGGACCATTTAGGMACACAGTCAGGTTCTCGTGATTTCTTGCTTATAATGGGCCCCTC 240 CCACCCATATGGTCAGCT嵐CGAGTGAMTTCTAGGGCACACCTTTGATTATTTTTTTT 300 MATAATC嵐嵐TTATTATTAGMACCGAAAATTATTATTTATTCCAAAGACATGAAT 360 TCCTACAAGTCCACMCTGTTGTTTATGGTCAAATCATAMGCAMACTMTGTTTTCCA 420 MTAGTTMTGGAMMAAGAAAAACAAAAGC嵐TGCATCTTGCGTTGTTGGMTGCM 480 MAGAGAGA嵐CGATACGTACCTAATGTTMTTCTMTTAGTTAGTTATAGAATGAGGA 540 GGTACATTA嵐AGGAAAATTAGTATTAGTACTCAGTTAAGTATGCACGTGTGTGGGMG 600 TATGGTGGCG雄CTATACAACCMCCCCTAGTAGATGGCTAGTTGTACATGTCTCGTGA 660 CGTATACATCATATATATAATAAATACGMCATAGAAATTAATAGGACTTAGTTGTTGCG 720 AATATACGTMAATCAAATAAAACCAACCATTCMTGTTCTTGGTMGTAACGAMTAAA 780 ACGGAAGCAAGAAGGAGMCCACATAAAAGGGAGCTMCTCCTGTACACGTTGTGCTTCA 840 TCTGCCCGTCCGTCMACTACCACACTCCCTTCTCTTTTCCCCTTTGTCATCTTGTATAA 900 TAATATCTCACTCTCCCATGCTTTCTAACAT 931 S494-1775F:(-48)
GGACGCTTCACGGMGGGCGMGGCCAAGGAGCTTGGTGAGCTGGTAGTCAGCACCAGGC 991 ATGTCMCTCCAGAGGTGGTGCAGAAGACMCGTGTGTGACCTTGGACTTAGGCTGACCC 1051 CACTCCTTGATGGCCTTCACTGCTGCATCTTTGCCTAGCTTAGGGACTTCMCCACCACG 1111 AGGTCTTGTCTAGCGTCGAGAGMGGAGCCATGTAGGCGCACATGTTAGGGTTCTCTTTC 1171 AAGAACTCCTCGGTCAAGTGCATGTGGCGTTTTCTTATGGTCGACTTATCGCCTATTAGA 1231 GTCATMTCMGTTAACTATGTGMCATACTAATAAGTACAGTTTMGGTAGMGACTAT 1291 TAAATTTTCGGTTTTATCTATTTMTACATTTTTTTTTGTTAGTTMTGAACTAAAAGAT 1351 ACGGATA嵐CTGGTGMTTATTTMATGTATTTTGAAAATGTACMC嵐TTTTAAAAA 1411 CTAAAAATGATAAACGGATGMTTATATGCCAMATTCTAMTGGMMATACMAGTAG 1471 GGTTTGTTAAGACATACACATGCGCTTGAACTTCTCCTTAAGGTCGGTCTTGTGTTCACT 1531 GTTGGTGATGCGGAAGTAGTAGTCTGGATACTCAGCTTGGAGCACATGGTTCGCAGGGTT 1591 GGCCGTACCTATCGCTAAGATGCCTGCAGGACCGTCTGCTCTCTGTGCCTTTCTGATCTC 1651 ATCCAACGMGMCGCCCCATCACCATATTMACCAACTACGTTTTMCTAAGTGTGATC 1711 GATGTGTTACTTTGCGTMTAAGCAAGTTATGTATGTATGTTTAGMAGCATGCAGAGTA 1771
<210〉 16 <211〉 294bp
23〈212〉 DNA
〈213>随机引物S266
〈400> 16
AGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAGAMATGGGTTTCGGCCGTTTTTMAATA嵐CATTGA 60 CGACAMAAAAAAAAAATAATTTGGCATCTCCCTCCATCTAAATCATGCATGAC嵐TGA 120 ATAAAAAGCTTTTATTATCATATGACGTCTATACAATGCGTATAATATGTTTCCTTTACT 180 TTATTTACTTGTCGTCTTTATCTTATTATATTATATGCTACATTATAGTCATTGTTMAG 240 TCAGAGACTACAGGTATCATMGGTTGCMCAATGATTTATCATCATCGGGCCT 29权利要求
1.一种利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法，其特征在于，该方法以“金冠2号”父母本及F1代种子为研究材料进行PCR反应体系优化，筛选特异性引物，进一步对特异片段克隆测序，转化为SCAR标记，并将该SCAR标记用于“金冠2号”大白菜品种鉴定和种子纯度检验，具体包括以下步骤1)材料的准备以橙色大白菜新品种“金冠2号”及其亲本种子催芽育苗后移栽至大田，在幼苗期单株编号，随机选取100-200株，于苗期取幼嫩叶片提取DNA备用，成株期根据品种特性鉴定生物学性状；2)DNA提取采用CTAB法，其过程为，取0.2g幼嫩叶片，液氮下研磨成粉末；加入750μL CTAB提取液后转入至1.5mL离心管中；然后65℃水浴30min，其间振荡混匀；分别用等体积的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液和等体积的氯仿、异戊醇混合溶液各抽提一次，于常温下在12000r/min条件下离心2次，每次10min；取上清液加入2倍体积预冷的无水乙醇沉淀DNA，于4℃条件下离心15min；离心转速为12000r/min，离心后用70％乙醇清洗沉淀2～3次；加入DNA贮存液，经DNA纯度检测证实纯化度，存于-20℃冰箱中备用；3)SCAR引物设计母本特异性引物SC134-1200fS134MTGCTGCAGGTGAAGGCTGGTTCrS134MTGCTGCAGGTTATCCTTTTTGGTTG杂种特异性引物SC266-260fS266-260FAGGCCCGATGGAGTTTGTGTAAGfS266-260FAGGCCCGATGATGATAAATCATTG4)SCAR-PCR扩增采用25μL的PCR反应体系，其中包括1×缓冲液，2.0mmol/L MgCl2，2.5mmol/L dNTPs，0.3μmol/L引物，1U TaqDNA聚合酶，30～50ng模板DNA；反应程序SCAR扩增程序为，94℃预变性4min，94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸90s，循环30次，最后72℃延伸10min；扩增产物在含5μg/mLEB的1.5％琼脂糖胶，120V下电泳1.0h，电泳后在紫外灯下观察并照相；5)SCAR标记的特征A、SC134-1200标记用SC134-1200的SCAR引物对“金冠2号”群体鉴定，在母本和杂交种中可以扩增出S134-1200的特异条带，而父本及其自交苗中不能扩出S134-1200的特异条带，因此利用该比较可以正确的鉴定“金冠2号”反交种子；鉴定群体中有扩增带单株的比率就是反交种子的杂交率；B、SC266-260标记用SC266-260的SCAR引物对“金冠2号”群体鉴定，母本、父本均没有扩增带，只有真杂种有扩增带，没有扩增带的可能是假杂种；利用该比较可以正确的鉴定“金冠2号”正交、反交单收以及混收种子；鉴定群体中有扩增带单株的比率就是反交种子的杂交率。
2. 根据权利要求1所述的利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯 度检验方法，其特征在于，所述的Tris-饱和酚、氯仿、异戊醇混合溶液的 体积比为Tris-饱和酚氯仿异戊醇=25:24:1;所述的氯仿、异戊醇混 合溶液的体积比为氯仿异戊醇=24:1。
3. 根据权利要求1所述的利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯 度检验方法，其特征在于，所述的DNA贮存液的组成为70%体积分数的乙醇， 其中加入O. 3moL/L NaAc溶液。
全文摘要
本发明公开了一种利用SCAR标记进行大白菜品种鉴定和种子纯度检验方法，该方法以橙色大白菜新品种“金冠2号”及其亲本的基因组DNA为模板，通过RAPD分析，建立了杂交种“金冠2号”杂交种及其亲本的RAPD特异指纹图谱，成功地获得了一个母本特异性SCAR标记和一个杂种特异性SCAR标记，应用这2个SCAR标记，根据品种指纹图谱和特异标记可以进行“金冠2号”杂交种的品种鉴定和种子纯度检验。通过134个金冠2号随机群体的鉴定，鉴定结果与田间鉴定相一致。
文档编号C12Q1/68GK101565745SQ20091002284
公开日2009年10月28日 申请日期2009年6月5日 优先权日2009年6月5日
发明者张战风, 张明科, 张鲁刚, 惠麦侠, 绮 王 申请人:西北农林科技大学