专利名称：：一种野生型egfr高表达的重组hek293细胞的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，涉及野生型EGFR高表达的非癌细胞的构建，特别涉及一种基于外源重组质粒的野生型EGFR高表达的重组HEK293细胞，以及其应用。
背景技术：
：表皮生长因子受体(EGFR)是原癌基因cerbBl(HERl)的表达产物，在许多恶性肿瘤中高表达。EGFR是由1186个氨基酸构成，相对分子量为170kD的跨膜糖蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区三部分组成。糖基化的胞外区折叠成4个亚区，由配体结合位点和2个富含半胱氨酸区域所构成，能结合具有激动功能的多种配体，主要有表皮生长因子，转化生长因子a，B细胞生长因子，肝素结合表皮生长因子样生长因子和表皮调节素等(CancerLetters,2007,254(2):165-177);跨膜区由一短列疏水氨基酸和一跨越脂质双层的ot-螺旋桥组成，对激酶激活和信号传导起推动作用；胞内区包括酪氨酸激酶结构域和羧基末端结构域，具有酪氨酸激酶活性，因此EGFR属于受体酪氨酸激酶家族。EGFR介导的信号转导通路主要有①MAPK通路EGFR配体和EGFR结合后，磷酸化酪氨酸残基与下游的生长因子受体结合蛋白2特异性结合，通过Ras活化，激活MAPK上其它因子，再激活一些转录因子、蛋白激酶等，引发多种生物学效应。②PI3K通路EGFR配体和EGFR结合后，激活PI3K，PI3K对磷脂酰肌醇环上的3位羟基进行磷酸化，产生磷酸化的磷脂酰肌醇，PI3K激活产生的磷脂酰肌醇与Akt结合，进一步激活其下游的因子，对细胞生存、增殖、细胞周期、凋亡和血管新生等产生调节作用(BiochimBiophysActa,2006，1766(1):120-39)。EGFR的高表达对一些恶性肿瘤细胞的增殖、细胞周期、侵袭及新生血管形成等方面起关键作用(MendelsohnJ,JClinOncol,2003,21(14):2787-2799)，EGFR成为抗肿瘤药物或者疫苗的重要靶点。目前，研发抑制恶性肿瘤中EGFR高表达的药物已成为治疗恶性肿瘤生长和转移的重要手段之一。然而，在EGFR抑制剂研发中，虽有吉非替尼、西妥昔单抗等已被应用于临床，但疗效并非理想，其它一些生物抑制剂仍处于基础研究和临床研究阶段。同时，以EGFR作为靶点，寻找抑制恶性肿瘤中EGFR高表达的药物是研发抗肿瘤新药或类似化合物的重要途径之一。目前己有突变型EGFR基因、干扰RNA等相关载体的构建、转染，以及EGFR家族其它成员相关载体的构建与研究的报道(NatBiotechnol，2002,20(5):505-508;GenesDev,2002,16(8):948-958.NatRevGenet,2002，3(10):737-747.)。然而，野生型全长EGFR基因细胞的相关生物学特性及其应用的研究未见报道。
发明内容本发明解决的问题在于提供一种野生型EGFR高表达的非癌细胞，在构建野生型EGFR全长基因的真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达EGFR分子的HEK293细胞株。本发明是通过以下技术方案来实现一种EGFR真核表达载体，通过多克隆位点将EGFR全长基因构建于真核质粒pcDNA3.1(+)，所述的多克隆位点为kpnl和xbal酶切位点。所述的EGFR全长基因其核苷酸序列如SEQ.ID.NO.l所示。一种野生型EGFR高表达的转化体，该转化体为HEK293-EGFR重组细胞，其宿主细胞为HEK293细胞，转染宿主细胞的外源性表达载体是包含EGFR全长基因的pcDNA3.1(+)-EGFR表达载体。所述的野生型EGFR高表达的HEK293-EGFR重组细胞应用于以EGFR为耙点的药物筛选。比较野生型EGFR高表达细胞HEK293-EGFR与癌化高表达EGFR的细胞株，应用于EGFR为靶点的药物筛选中，增加筛药灵敏度与特异性，应用于EGFR的生物学特性的研究及EGFR通路蛋白的差异性比较，提高发现功能蛋白的有效性。与现有技术相比，本发明具有以下有益的技术效果1、本发明构建了人表皮生长因子受体(EGFR)的真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR，测序结果与基因库人EGFR(Transcriptvariant1)除2个碱基外，其余碱基完全一致，它们所编码的氨基酸完全一致；pcDNA3.1(+)-EGFR载体脂质体法转染HEK293细胞，经过筛选获得了获得稳定、高表达EGFR分子的重组HEK293-EGFR细胞株。2、HEK293细胞为原代人胚肾细胞转染5型腺病毒(Ad5)DNA的永生化细胞，是载体构建理想的工具细胞；所得重组HEK293-EGFR细胞经过流式细胞术检测EGFR表达量比转染前高45倍，免疫荧光检测也显示EGFR的表达有明显的增高。3、pcDNA3.1(+)-EGFR载体转染前后对HEK293细胞的生长无显著影响，用EGF对HEK293-EGFR细胞作用，细胞内p-EGFR及p-ERK表达量增加，表明转染后的EGFR具有生物活性功能，激活了通路蛋白ERK。4、以吉非替尼和吉非替尼加EGF作为诱导因子，分别对转染后HEK293-EGFR细胞诱导15分钟后，检测细胞内磷酸化EGFR及ERK表达量，结果表明吉非替尼对转染后细胞的通路蛋白具有抑制作用，表明EGFR重组后依然介导了HEK293-EGFR细胞内的信号转导。5、细胞膜色谱检测HEK293-EGFR细胞对吉非替尼具有一定的保留，提高了以EGFR为耙点的药物筛选的特异性及灵敏性，为进一步研究其生物学特性及EGFR通路蛋白的差异性比较研究，提高发现功能蛋白的有效性提供细胞模型。图1是pcDNA3.1(+)载体的质粒图谱；图2是纯化的EGFR电泳检测图谱；图3是pcDNA3.1(+)-EGFR载体BamHI酶切鉴定图谱；图4是HEK293-EGFR细胞的EGFR表达水平的RT-PCR检测图5是流式细胞术检测EGFR在各种细胞膜上的表达量，横坐标代表所测EGFR分子的荧光强度(S卩"荧光道数")，纵坐标代表细胞的相对数；图6是免疫荧光染色定性鉴定EGFR在EGFR-293细胞中的表达图；图7是EGFR表达载体转染HEK293细胞前后生长曲线图；图8是EGF及吉非替尼作用于转染的HEK293细胞，westernblot检测p-EGFR的表达量；图9是EGF及吉非替尼作用于转染的HEK293细胞，westernblot检测通路蛋白p-ERK的表达量；图10是采用细胞膜色谱HEK293-EGFR细胞对吉非替尼的保留，其中，第二个峰为吉非替尼的保留峰。具体实施例方式本发明在构建野生型EGFR全长基因的真核表达载pcDNA3.1(+)-EGFR的基础上，转染HEK293细胞，获得稳定、高表达EGFR分子的重组HEK293-EGFR细胞株。与未转染表达载体的阴性对照细胞相比，该重组HEK293-EGFR细胞株的EGFR表达量增加了45倍，应用于EGFR为靶点的药物筛选中，增加筛药灵敏度与特异性；并且比较野生型EGFR高表达细胞HEK293-EGFR与癌化高表达EGFR的细胞株A431,应用于EGFR的生物学特性的研究及EGFR通路蛋白的差异性比较，提高发现功能蛋白的有效性。下面对本方面做详细的说明本发明是以pcDNA3.1(+)为基础载体，(来源于西安交通大学第一附属医院所赠)，其质粒图谱，如图1所示，本发明选择KpnI和Xbal酶切位点作为连接外源基因的多克隆位点，以BamHI酶切位点作为检测位点。1)构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFRa、设计包含酶切位点的引物对，以pBabe-PuroEGFRWT质粒(其包含EGFR全长基因，来源于美国肿瘤防治中心，上海药物所赠)为模板，PCR扩增EGFR基因全长，所述的引物对为上游弓l物..cggggtaccattatgcgaccctccgggac29bp;下游弓I物gctctagatcatgctccaataaattc26bp;其中，上游引物中gg^为Kpnl酶切位点，下游引物中ctaga为XbaI酶切位点；PCR反应体系为HSPCR多聚酶0.5pL;10xBuffer5dNTP4^L;上游引物(sense，10(imol/L)1(xL;下游引物(antisense，1Opmol/L)1^iL;模板(cDNA)2fiL;ddH2036.5pL;Total:50|iL。PCR的反应条件为:95。C预变性5min;98。C变性10s，55。C退火15s，72-C延伸4min，循环数35;72。C延伸5min;回收PCR产物，将目的基因EGFR纯化，对纯化的EGFR做凝胶电泳检测，结果如图2所示，其中，泳道l、2为Marker,泳道3、4、5均为纯化的EGFR。b、将纯化的EGFR、pcDNA3.1(+)载体在M缓冲液(MBuffer，Takara生物公司试剂)作用下，分别kpnI、xbaI双酶切过夜；酶切体系如下kpnIlpL;XballjiL，10XMBuffer2pL;目的基因EGFR片段或载体pcDNA3.18jxL;ddH208pL;Total20fiL。分别纯化回收带黏性末端的EGFR片段和pcDNA3.1(+)载体片段，然后通过T4DNA连接酶连接，16'C条件下反应20小时，构建真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR。将所得载体常规转化大肠菌DH5a，在含氨苄青霉素的LB琼脂平板中37"C培养，挑取阳性克隆提取质粒，并进行电泳检测和测序。质粒酶切鉴定用BamH137。C酶切3h，然后琼脂糖凝胶电泳检测。由于EGFR基因含有三个BamHl酶切位点，pcDNA3.1(+)载体上含一个该酶切位点，因而，pcDNA3.1(+)-EGFR环形载体可被BamHl酶切为四段，其中一段因分子量小，电泳可能跑出凝胶，其余三段及其大小如图3所示的7427bp、1031bp和539bp，泳道1、2、3、6分别为4个连接成功的质粒，泳道4为marker,泳道5为未连接成功的。将电泳检测正确的质粒进行测序，构建的载体中EGFR的测序结果如SEQ.ID.NO.1所示，其中，1267國1272bp、2298-2303bp、2837誦2842bp为所包含的3个BamHl酶切位点，与基因库中EGFR比较(Transcriptvariant1)，第2242bp、2467bp两2处核苷酸发生点突变，上述2处突变均为同义突变，其编码的氨基酸与Transcriptvariant1完全一致，说明真核表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR构建成功。2)pcDNA3.1(+)-EGFR表达载体转染HEK293细胞c、采用脂质体2000将质粒转入HEK293细胞(脂质体2000购自美国GIBCO，Invitrogen公司，按照脂质体2000试剂盒说明书操作)，DMEM培养基(Dulbecco'sModifiedEagleMedia)加G418浓度600ng/ml筛选14天，挑取G418抗性单克隆传代培养，将调整G418浓度调整为300ng/ml，DMEM培养基筛选培养，得到pcDNA3.1(+)-EGFR阳性转染的克隆。d、对转染细胞株的RT-PCR检测采用TRIZOL试剂盒分别提取未转染和转染的细胞总RNA，并以总RNA为模板采用Fermentas公司的cDNA合成试剂盒进行反转录，得到cDNA;分别以所得cDNA为模板，PCR扩增EGFR基因全长，PCR扩增条件与上述EGFR基因的PCR扩增方法相同，RT-PCR检测EGFR在HEK293-EGFR细胞中基因水平的表达，结果如图4所示，其中，泳道1为重组HEK293-EGFR细胞的EGFR表达检测，泳道2为未转染的HEK293细胞检测，泳道3为Marker,泳道4为空质粒作阴性对照，泳道5为pBabe-PuroEGFRWT质粒，作为阳性对照，与泳道2、4、5相比，泳道l和泳道5均分别得到了3800bp左右的条带，泳道2和4均没有得到相应的条带，RT-PCR检测结果表明重组HEK293-EGFR细胞的EGFR得到表达。e、流式细胞术检测HEK293-EGFR细胞株中EGFR的表达加入0.5-0.8ml胰酶，约5分钟后显微镜下可见贴壁的细胞变圆，吸管吸出胰酶，加入鲜培养基轻轻吹打培养瓶上的细胞，然后收集吹打下的贴壁HEK293-EGFR细胞，1XPBS洗涤三次。用含3%胎牛血清的PBS稀释HEK293-EGFR细胞至1X1()7个细胞/ml;在HEK293-EGFR细胞悬浮液中加入鼠单克隆EGFR1作为一抗，(abcom公司，1:2000稀释)，室温孵育45min，然后用PBS洗涤三次；用含3。/。BSA的PBS以1:50稀释，有荧光标记的抗鼠源性的IgG作为二抗(美国KPL公司)。加入细胞中室温孵育45min,用流式细胞仪检测，结果如图5所示，其中，图A为HEK293细胞的阴性对照，图B为癌细胞A431的EGFR表达量的检测图，图C为未转染的HEK293的EGFR表达量的检测图，图D为HEK293-EGFR的EGFR表达量的检测图，图中横坐标标注的Ml是以阴性细胞为准标出的，落在M1右侧的细胞越多，说明细胞表达的EGFR含量越高，对比图A、图C可见未转染的HEK293的EGFR表达量与阴性对照相比，EGFR的表达量基本一致，对比图A、图C与图D，可见重组的HEK293-EGFR的EGFR表达量明显增加，流式细胞术检测图具体数据为，转染前细胞的平均荧光强度为11.25±1.68，转染重组后的HEK293-EGF其平均荧光强度为43.94±1.98，表达量比转染前高45倍；对比图A、图B可见，HEK293-EGFR细胞与A431细胞的EGFR表达量相比也明显增加。f、免疫荧光染色定性鉴定EGFR在EGFR-293细胞中的表达，其中使用的一抗、二抗同流式细胞检测的试剂，染色方法也同流式细胞检测的染色方法，检测使用的是共聚焦显微镜(LeicaTCS-SP2，德国)。结果如图6所示，其中，荧光分布于细胞膜，一抗为鼠单克隆EGFR1，二抗为有绿色荧光标记的，抗鼠源性的IgG。EGFR与一抗、二抗结合形成免疫复合物并发出荧光，EGFR表达越高，与之结合的一抗、二抗就越多，所发出的荧光就越显著。3)HEK293-EGFR细胞生长及活性分析取生长良好接近汇合的细胞，用胰酶消化，加入新鲜的DMEM培养基制成细胞悬液后细胞计数。根据细胞计数结果稀释细胞悬液至浓度为lxl04/mL，每25ml小瓶接种1mL细胞悬液，共接种30瓶细胞。24h后开始计数细胞，以后每隔24h计数一次，每次取3瓶细胞，分别进行计数，计算平均值。连续计数10d，结果如表l所示。根据细胞计数结果，以细胞数为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线，如图7所示，同时结合表1所示的HEK293-EGFR细胞生长计数，可以得出HEK293在转染外源表达载体pcDNA3.1(+)-EGFR前后其生长曲线并没有明显的区别。表1.HEK293-EGFR细胞生长计数<table>tableseeoriginaldocumentpage10</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4)HEK293-EGFR细胞部分信号通路蛋白的westernblot检测采用westernblot方法，检测转染细胞中p-EGFR的变化。用表皮生长因子(EGF)及吉非替尼分别处理转染的HEK293细胞，用RIPA裂解细胞提取细胞总蛋白，IO(TC变性5min，测蛋白定量。取30pg变性后蛋白上样于12%SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，经过SDS-PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体硝酸纤维素薄膜上，以兔抗人磷酸化EGFR抗体为一抗，4'C孵育过夜，辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG为二抗孵育2h,经过显影，对细胞内磷酸化EGFR的表达检测，如图8所示的westernblot检测结果图，无任何刺激的HEK293-EGFR为空白；给EGF试剂刺激15min后，p-EGFR表达会增加，如图第二泳道；对HEK293-EGFR给予吉非替尼抑制剂的刺激后，p-EGFR表达会降低，如图第三泳道和第二泳道的对比；给予吉非替尼抑制剂后再给予EGF诱导剂刺激15min，p-EGFR表达又会出现，其表达量比第二泳道低，比第三泳道高，表明转染后细胞的p-EGFR受外界作用后，同样会改变。利用同样方法检测HEK293-EGFR细胞内磷酸化ERK的表达，如图9所示，得到相同的结论。以上实验说明了以EGF作为EGFR的刺激剂，对HEK293-EGFR细胞诱导后，细胞内p-EGFR及p-ERK表达量增加，表明转染后的EGFR具有生物活性功能，激活了通路蛋白ERK;以吉非替尼作为EGFR的抑制剂，对EGF诱导后的HEK293-EGFR细胞作用，细胞内p-EGFR及p-ERK表达量降低；然后再用EGF刺激15min，细胞内磷酸化EGFR及ERK表达量又得到回升，表明吉非替尼对转染后细胞的通路蛋白有影响作用。5)细胞膜色谱检测HEK293-EGFR细胞对吉非替尼的保留用水平衡EGFR高表达的HEK293-EGFR细胞膜色谱柱后，用包含吉非替尼(1.16mg/ml)的甲醇对HEK293-EGFR细胞膜色谱柱上样，上样完成之后用水洗脱，同时紫外检测波长249nm测定HEK293-EGFR细胞膜对吉非替尼的保留时间，同时以未转染的HEK293细胞作为阴性对照。HEK293-EGFR细胞膜对吉非替尼的保留如图10所示，横坐标为时间(分钟)，纵坐标为保留量(洗脱量)；HEK293-EGFR细胞膜对吉非替尼具有一定的保留，水洗脱在1.8分钟的时候达到峰值，HEK293-EGFR细胞株在细胞膜色谱分析筛选针对EGFR靶点或者能与EGFR结合的药物，具有一定的亲和力、高灵敏度，说明HEK293-EGFR细胞可用于以EGFR为耙点的药物筛选。核苷酸序列表<110>西安交通大学<120>—种野生型EGFR高表达的重组HEK293细胞<160>1<210>1<211>3813<212>DNA<213>人EGFR全长基因<400>1tggactttggctcagagaccactgcttactggcttatcgaaattaatacgactcactata60gggagacccaagctggctagcgtttaaacttaagcttggtaccattatgcgaccctccgg120gacggccggggcagcgctcctggcgctgctggctgcgctctgcccggcgagtcgggctct180ggaggaaaagaaagtttgccaaggcacgagtaacaagctcacgcagttgggcacttttga240agatcattttctcagcctccagaggatgttcaataactgtgaggtggtccttgggaattt300ggaaattacctatgtgcagaggaattatgatctttccttcttaaagaccatccaggaggt360ggctggttatgtcctcattgccctcaacacagtggagcgaattcctttggaaaacctgca420gatcatcagaggaaatatgtactacgaaaattcctatgccttagcagtcttatctaacta480tgatgcaaataaaaccggactgaaggagctgcccatgagaaatttacagg犯atcctgca540tggcgccgtgcggttcagcaacaaccctgccctgtgcaacgtggagagcatccagtggcg600ggacatagtcagcagtgactttctcagcaacatgtcgatggacttccagaaccacctggg660cagctgccaaaagtgtgatccaagctgtcccaatgggagctgctggggtgcaggagagga720gaactgccagaaactgaccaaaatcatctgtgcccagcagtgctccgggcgctgccgtgg780caagtcccccagtgactgctgccacaaccagtgtgctgcaggctgcacaggcccccggga840gagcgactgcctggtctgccgcaaattccgagacgaagccacgtgcaaggacacctgccc900cccactcatgctctacaaccccaccacgtaccagatggatgtgaaccccgagggcaaata%0cagctttggtgccacctgcgtgaagaagtgtccccgtaattatgtggtgacagatcacgg1020ctcgtgcgtccgagcctgtggggccgacagctatgagatggaggaagacggcgtccgcaa1080gtgtaagaagtgcgaagggccttgccgcaaagtgtgtaacggaataggtattggtgaatt1140taaagactcactctccataaatgctacgaatattaaacacttcaaaaactgcacctccat1200cagtggcgatctccacatcctgccggtggcatttaggggtgactccttcacacatactcc1260tcctctggatccacaggaactggatattctgaaaaccgtaaaggaaatcacagggttttt1320gctgattcaggcttggcctgaaaacaggacggacctccatgcctttgagaacctagaaat1380catacgcggcaggaccaagcaacatggtcagttttctcttgcagtcgtcagcctgaacat1440aacatccttgggattacgctccctcaaggagataagtgatggagatgtgataatttcagg1500aaacaaaaatttgtgctatgcaaatacaataaactggaaaaaactgtttgggacctccgg1560tcagsaaaccasasttataagc朋cagaggtg朋aacagctgcasggccscaggccsggt1620ctgccatgccttgtgctcccccgagggctgctggggcccggagcccagggactgcgtctc1680ttgccggaatgtcagccgaggcagggaatgcgtggacaagtgcaaccttctggagggtga1740gccaagggagtttgtggagaactctgagtgcatacagtgccacccagagtgcctgcctca1800ggccatgaacatcacctgcacaggacggggaccagacaactgtatccagtgtgcccacta1860cattgacggcccccactgcgtcaagacctgcccggcaggagtcatgggagaaaacaacac1920cctggtctggaagtacgcagacgccggccatgtgtgccacctgtgccatccaaactgcac1980ctacggatgcactgggccaggtcttgaaggctgtccaacgaatgggcctaagatcccgtc2040catcgccactgggatggtgggggccctcctcttgctgctggtggtggccctggggatcgg2100cctcttcatgcgaaggcgccacatcgttcggaagcgcacgctgcggaggctgctgcagga2160gagggagcttgtggagcctcttacacccagtggagaagctcccaaccaagctctcttgag2220gatcttgaaggaaactgaatttaaaaagatcaaagtgctgggctccggtgcgttcggcac2280ggtgtatEieigggactctgg3tccc3g朋ggtgagaaagtt朋aattcccgtcgctatc犯2340ggaattaagagaagcascatctccgaaagccaacaaggaa3tcctcgatgaagcctacgt2400gatggccagcgtggacaacccccacgtgtgccgcctgctgggcatctgcctcacctccac2460cgtgcaactcatcacgcagctcatgcccttcggctgcctcctggactatgtccgggaaca2520caaagacaatattggctcccagtacctgctcaactggtgtgtgcagatcgcaaagggcat2580gaactacttggaggaccgtcgcttggtgcaccgcgacctggcagccaggaacgtactggt2640gaaaacaccgcagcatgtcaagatcacagattttgggctggccaaactgctgggtgcgga2700agagaaagaataccatgcagaaggaggcaaagtgcctatcaagtggatggcattggaatc2760aattttacacagaatctatacccaccagagtgatgtctggagctacggggtgaccgtttg2820ggagttgatgacctttggatccaagccatatgacggaatccctgccagcgagatctcctc2880catcctggagaaaggagaacgcctccctcagccacccatatgtaccatcgatgtctacat2940gatcatggtcaagtgctggatgatagacgcagatagtcgcccaaagttccgtgagttgat3000catcgaattctccaaaatggcccgagacccccagcgctaccttgtcattcagggggatga3060aagaatgcatttgccaagtcctacagactccaacttctaccgtgccctgatggatgaaga3120agacatggacgacgtggtggatgccgacgagtacctcatcccacagcagggcttcttcag3180cagcccctccacgtcacggactcccctcctgagctctctgagtgcaaccagcaacaattc3240caccgtggcttgcattgatagaaatgggctgcaaagctgtcccatcaaggaagacagctt3300cttgcagcgatacagctcagaccccacaggcgccttgactgaggacagcatagacgacac3360cttcctcccagtgcctgaatacataaaccagtccgttcccaaaaggcccgctggctctgt3420gcagaatcctgtct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