专利名称：肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体的制作方法
技术领域：
本发明属生物医学领域，特别涉及肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR。现有技术
RNA干扰(RNA interference, RNAi)技术是指外源或内源性的双链RNA(double-stranded RNA， dsRNA)进入生物体细胞后在Dicer作用下，被裂解成由正义链和反义链组成的21 23nt的小分子干扰性RNA (smallinterfering RNA, siRNA)， siRNA作为向导序列，与RNA诱导的沉默复合物(RNA induced silencing complex, RISC)结合，引起与其同源的mRNA特异性降解，抑制相应基因的表达。其是涉及基因功能、基因治疗等领域的重要研究手段。近年来RNAi技术被广泛地应用到肿瘤的基因治疗研究中。实施RNAi技术的小分子有siRNA， shRNA及miRNA。 miRNA是生物体内一类重要的调控分子，多具有数十个乃至上百个耙基因。其中一些miRNA具有肿瘤抑制作用。因此，利用miRNA表达载体抑制肿瘤增殖作用的miRNA,将成为肿瘤基因治疗的新方法，具有重要的理论及实际意义。目前，商品化的miRNA表达载体多为通用性表达载体，其所选用的启动子以在大多数哺乳动物细胞中均活性很高，且能被RNAPol II识别的启动子为准，如Invitrogen公司产品BLOCK-iT Pol II miR RNAi Expression Vector Kits ， Ambion公司的pSilencerTM4.1-CMV Expression Vectors,武汉晶赛公司基于microRNAmir-30双臂结构的shRNAmir质粒载体pGenesil-Mir30sh，所用启动子均为pol IIhuman CMV promoter 。因miRNA与shRNA结构相j以，故可以用miRNA的表达框架来表达shRNA。这类载体的缺陷在于其虽能保证miRNA或shRNA的正常表达，但如果将其应用于肿瘤基因治疗中时，此类载体除了在肿瘤中表达以外，还可以在正常细胞中表达，这样就可能出现在抑制了肿瘤细胞增殖的同时，还会抑制正常细胞的生长。如果能应用肿瘤特异性启动子，使得miRNA或shRNA只在肿瘤细胞中表达，就可提高肿瘤基因治疗的特异性和耙向性。
发明内容
本发明的目的是构建一种肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体，通过肿瘤特异性启动子survivin promoter和厌氧反应元件(HRE)的双调控，使得该载体在肿瘤组织特异性表达，避免其对正常组织的损伤。同时实现肿瘤的多靶点或多位点治疗，提高肿瘤治疗疗效。本发明的技术方案是这样实现的
本发明以pMD19-T载体为框架载体，分别连接上五个串联的低氧反应元件HRE5， survivin promoter,及包含GFP的miRNA表达框架，载体大小为4592bp，载体序列为
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载体上各元件位置为HRE5: 439-651Survivin promtor: 658-924GFP: 1055-1774MCS: 1862-1889PolA: 2016-2332Ori: 2774-3362Amp: 3533-4393
SpeI:433-438Sphl: 652-657Fbal: 925-930Sad: 2327-2332EcoRI: 1862-1867Pstl: 1867-1872Nhel: 1872-1877
HindIII: 1884-1889
本发明构建的肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在肿瘤细胞中可以正常表达，在原代培养的小鼠正常细胞不表达。而且在厌氧条件下该载体在肿瘤细胞中的表达明显高于在正常培养条件下的表达，说明该载体可以实现肿瘤特异性和厌氧双调控表达。
图1 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR表达载体结构图。
图2 dsoligo电泳鉴定图。
图3 HRE5PCR扩增结果。
图4 SpPCR扩增结果。
图5 MCS位点ds oligo退火后电泳图。
图6 miR侧翼片段PCR电泳图。
图7 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR转染后荧光显微镜图像。
图7 (1)为HepG2细胞转染后荧光照片。
图7 (2)为小鼠原代培养皮肤细胞转然后荧光照片。
其中A，B，C分别为正常培养条件下pEGFP-Cl， pMD-SURV/EmGFP-miR:pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR转染后荧光照片。D， E， F分别为厌氧(1.1%02 ) 培养条件下 pEGFP-Cl ， pMD-SURV/EmGFP-miR,pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR转染后荧光照片。
下面结合附图对本发明的内容作进一步详细说明。
具体实施例方式
参照图1所示，肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR结构图。载体大小为4592bp。其主要元件为5个串联的低氧反应元件(HRE5)， survivin promoter及miRNA表达框架，在miRNA表达框架上有插入串联miRNA或shRNA的多克隆(MCS)位点，其酶切位点为EcoRI， Pstl, Nhel, Kpnl, HindIII.
参照图2所示，连接于pMD19-T载体上，且用于连接HRE5， survivinpromoter及miRNA表达框架的酶切位点寡核苷酸双链ds oligo电泳鉴定图。其大小为43bp。 Marker大小依次为25 bp， 50 bp， 75 bp， 100 bp， 150 bp，200 bp， 250 bp， 300 bp， 350 bp, 500 bp， 766bp。从图中可见该寡核酸双链退火成功，大小正确。
参照图3所示，HRE5 PCR产物长225bp。Marker大小分别为50bp, 100bp,150bp, 200bp， 250bp， 300bp， 350bp, 400bp, 500bp。因HREs为5个相同的串联结构，所以扩增出大小不等的5个片段，胶回收时只切取225bp产物片段，即最大片段。
参照图4所示，最亮条带为300bp。该产物片段长279bp。 Marker大小分别为50bp, 100bp， 150bp,200bp， 250bp， 300bp， 350bp， 400bp， 500bp。可见扩增产物大小正确。
参照图5所示，该序列长为33bp。 Marker大小依次为25 bp， 50 bp，75bp， 100 bp， 150 bp， 200 bp， 250 bp， 300 bp， 350 bp， 500 bp， 766bp。从图中可见该寡核酸双链退火成功，大小正确。
参照图6所示，该产物大小为1408bp。 Marker由下往上两条带大小分别为lkb， 2kb。 Marker由下往上两条带大小分别为lkb， 2kb， 3kb， 4kb， 5kb，6kb， 7kb, 8kb， 10kb。从图中可见miRNA表达框架扩增大小正确。
参照图7(1)、 (2)所示，其中A， B， C分别为正常培养条件下pEGFP-Cl，pMD-SURV/EmGFP-miR, pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR转染后荧光照片。D ， E ， F分别为厌氧(1.1% 02 )培养条件下pEGFP-Cl,pMD-SURV/EmGFP-miR, PMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR转染后荧光照片。从 图 中 可 见 ， pEGFP-Cl, pMD-SURV/EmGFP-miR,pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在HepG2细胞中无论在正常培养还是厌氧培养都有表达，但是pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在厌氧条件下的表达高于正常培养条件下 。pEGFP-Cl， pMD-SURV/EmGFP-miR，PMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR三个载体在小鼠正常培养皮肤细胞中，无论在正常培养还是厌氧培养，只有pEGFP-Cl表达，而pMD-SURV/EmGFP-miR,pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR 两个载体均无表达。说明pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR的表达具有肿瘤特异性及低氧调控性。本发明解决了有关肿瘤基因治疗存在的两个问题
(1)肿瘤特异性表达问题。首先选用在肿瘤中高表达的肿瘤特异性启动子survivin promoter。近年研究发现Survivin在正常分化成熟的组织中几无表达，仅见于胚胎细胞、胸腺、睾丸和分泌期子宫内膜，而在几乎所有人类肿瘤中高表达，且表达具有肿瘤细胞依赖性。由于survivin启动子调控的基因能在部分正常细胞中表达，因此以其为调控序列的基因治疗将会影响胸腺、睾丸和分泌期子宫内膜。为了降低其在正常组织中表达治疗性基因，可以在survivin启动子上游增加低氧调控的增强子即低氧反应元件(hypoxia responseelement, HRE)，对其进行进一步的肿瘤特异性改造。大多数恶性肿瘤都存在组织缺氧现象，血管内皮生长因子(vascular endothelial growthfactor,VEGF)是血管内皮细胞特异性有丝分裂原，不但能够促进血管内皮细胞增生和血管再建，而且可以使肿瘤血管通透性增加，在肿瘤生长和转移过 程中具有重要的作用。其在几乎所有的实体瘤细胞中都有过量的表达，而在
正常组织中不表达或极少表达。VEGF表达水平的高低与VEGF启动子 (VEGFP)的HRE有关。该元件在低氧的诱导下可以增强VEGF表达，并 作为肿瘤靶向基因治疗的重要增强子。因此，应用HRE与survivin启动子联 合构建HRE-survivin启动子调节的miRNA或shRNA表达载体，具有成功的 可能性。该载体将有助于提髙肿瘤基因治疗的特异性，同时避免对正常组织 杀伤作用，增加肿瘤基因治疗的安全性。
(2)多靶点基因治疗问题。肿瘤的发生是多基因共同作用的结果。单纯 针对某一靶基因的治疗效果往往不是十分理想，如果能同时作用与肿瘤相关 的多个靶基因，实现多途径，多靶点的治疗，就可明显提高疗效。本发明在 载体的多克隆位点设计了 5个不同的酶切位点，这样就可实现随意插入不同 miRNA或shRNA，使得串联的miRNA或shRNA同时表达，达到多耙点治 疗的目的。
本发明的肿瘤特异性表达载体是以pMD19-T载体为框架载体，分别连 接上5个串联的HRE (5HRE)， survivin promoter,及miRNA表达框架三个 主体元件，构建成为新的肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表 达载体pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR，其中在miRNA表达框架中有EmGFP 作为报告基因，EmGFP下游为插入miRNA或shRNA的多克隆位点，及PolA 尾。
pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR表达载体结构图及MCS内切酶位点详细 序列如图l所示。1. pMD19-T载体的改造
1)化学合成包含SpeI, Sphl， Fbal, Sacl四个酶切位点的寡核苷酸 链。其序列为
sense oligo - 5，-actagtatcagcgcatgccaagattgatcagaatcggagctca- 3， anti-sense oligo s 5' -gagctccgattctgatcaatcttggcatgcgctgatactagta-3，
2) 双链寡核苷酸的合成将合成好的sence oligo和antisence oligo 在95。C 4min,常温5 10min下退火形成双链。
3) 鉴定退火双链:取lul退火液，加99ulH20，稀释为500nM。用4%的琼 脂糖凝胶电泳鉴定退火双链。退火后双链长43bp.如图2。电泳证实dsoligo 退火成功。
4) 用500nM ds双链与P隨9-T载体相连，转化PMD19-T与ds Oligo 的连接产物pMD-ds。
5) 挑单菌落，过夜摇菌。
6) 提取质粒酶切鉴定后，送测序。测序正确，将此载体作为框架载体， 将HREs， Survivin promoter及miRNA表达框架依次连接到pMD-ds载体上。
2. 低氧反应元件HRE5的获得包含5个HRE串联片段的载体 pEGFP-5HR (石秦东，张蓬勃，康前雁等，以五Gi^为叛普基厉游潜蔬f鉴 ^^/i载谬y^/l6^^^"定。南方医科大学学报，2007， 27 (12))的获得是由 西安交大医学院神经生物研究所石秦东惠赠。设计HRE5引物，以pEGFP-5HR 载体为模板扩增HREs，产物长225bp。引物5'端加Spel酶切位点，3，端加 Sphl酶切位点。引物序列如下HRE5 forward primer: 5'-AGTAGTCCAGAGTGGATACGTGG-3， HRE5 reverse primer : 5，-GGATGGAATTCCGGAAGAGGACCTGTT-3'
1) PCR扩增获得HRE5片段，经电泳证实扩增片段大小正确，如图3。 因有相同的串联片段，故扩出了大小不等的5条片段，胶回收时只切割200bp 以上条带即可。
2) 胶回收HREs片段，与pMD19-T载体连接，转化后，挑菌，提取质 粒酶切鉴定，送测序。该载体记为T-HRE5。
3. survivin promoter的获得
1) 提取培养的肝癌HepG2细胞基因组DNA。
2) 以上述DNA为模板扩增survivinpromoter,引物序列如下 Sp forward primer: 5'-GGATGGGGGTTGTTTGAAAGGAGTG-3，
Sp reverse primer: 5'-TGATCAGCCGCCGCCGCGAGGTCTGGGAACGGG-3' 引物5，端加SphI酶切位点，3'端加Fbal酶切位点。扩增片段长279bp。 PCR产物电泳鉴定图4:
3) 胶回收Survivin promoter片段，与pMD19-T载体连接，转化后，挑 菌，提取质粒酶切鉴定，送测序。该载体记为T-SP。
4. miRNA表达框架的获得
1)改造商品化miR载体pcDNA 6.2-GW/EmGFP-miR。 a.在插入pre-miRNAdsoligo的位置插入包含有EcoRI， Pstl， Nhel ， Kpnl， Hind III五个酶切位点的MCSdsoligo。化学合成oligo DNA序列； Sense: 5' -TGCTGGAATTCTGCAGCTAGCGGTACCAAGCTT-3' Antise脆5' -CCTGAAGCTTGGTACCGCTAGCTGCAGAATTCC画3，鉴定如图5。
c. 将dsoligoDNA与pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR连接，转化，挑菌， 提取质粒酶切鉴定，送测序。该载体记为pcDNA6.2-GW/EmGFP-ds。
2) 以pcDNA 6.2-GW/EmGFP-ds为模板，扩增包含有EmGFP及polA 的miRNA表达框架。引物序列如下
miR forward primer: 5'-TGATCATCTGGCTAACTAGAGAACCCAC- 3' miR reverse primer: 5'-GAGCTCAACAGCTATGACCATGTAATAC-3' 扩出的片段长1408bp。引物5，端加入FbaI酶切位点，3，端加入Sacl酶切 位点。扩增产物电泳鉴定如图6:
3) 胶回收miRNA表达框架，与pMD19-T载体连接，转化，挑菌，提 取质粒酶切鉴定，送测序。该载体记为T-miR。
5. pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR表达载体的连接
1) 用Spel和Sacl双酶切PMD-ds，胶回收大片段。
2) 用Spel和Sphl双酶切T-HRE5,用Sphl和Fbal双酶切T-Sp,用Fbal 和Sacl双酶切T-miR，分别将每个酶切产物的小片段胶回收。
3) 将pMD-ds胶回收的大片段与回收的HRE5, SP, miRNA表达框架一起 连接，转化，挑菌，提质粒酶切鉴定，送测序。此次构建好本发明的肿瘤特 异性启动子调控的串联miRNA或 shRNA表达载体 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR0
pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR表达载体表达功能的验证
实验目的验证PMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在肿瘤细胞中的正常表达。
实验步骤1. 将测序正确的pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR菌液扩增，提取质粒， 同时亦将本发明过程中构建的测序正确且无HRE5的载体 pMD-SURV/EmGFP-miR菌液扩增，提取质粒。同时提取pEGFP-Cl 质粒，作为阳性对照组。
2. 培养不同的肿瘤细胞，包括肝癌细胞SSCM7721， H印G2,Hep3B，胃 癌细胞7901，肺癌细胞A549，宫颈癌细胞HeLa,乳腺癌MCF-7，胰 腺癌BXPC-3，黑色素瘤细胞EH。
3. 原代培养小鼠脑细胞，胃细胞及皮肤细胞。
4. 将培养细胞按5X107孔接种于24孔板中，每种细胞接种3孔，分别 用于转染pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR, pMD-SURV/EmGFP-miR 及pEGFP-Cl三个不同的质粒。重复种两块相同的24孔培养板，待 转染质粒后一块置于正常氧浓度培养箱中培养， 一块置于厌氧培养箱 中培养(1.1%02)。
5. 用lipofectam 2000转染质粒，24 h后在荧光显微镜下通过观察GFP 的表达来判断 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR ， pMD-SURV/EmGFP-miR载体在不同肿瘤细胞中的表达情况。
实验结果pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR在不同的肿瘤细胞中都有表达， 且在低氧培养下pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR的表达高于正常培养组，亦 高于低氧培养下转染的pMD-SURV/EmGFP-miR载体组。在上述肿瘤细胞中 表达最高的为HepG2，表达较高的为Bxpc-3， MCF-7。在小鼠原代培养细胞 中，pMD-SURV/EmGFP-miR和pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR无论在正常 培养下，还是厌氧培养均无表达。以上结果证实PMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR可以在肿瘤细胞中表现出很好的缺氧诱导作 用和高水平的表达，且在正常细胞不表达。说明 pMD-HRE5-SURV/EmGFP-miR可以在肿瘤细胞中能够有效地进行缺氧诱导 和调控工作，为后期在该载体中插入miRNA或shRNA串联序列，进行miRNA 或shRNA功能验证奠定了基础。荧光照片见图7。
权利要求
1、肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体，其特征在于，以pMD19-T载体为框架载体，分别连接上五个串联的低氧反应元件HRE5，survivin promoter，及包含GFP的miRNA表达框架，载体大小为4592bp，载体序列为tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca60cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg120ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc180accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc240attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat300tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt360tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt agaactcggt acgcgcggat420cttccagaga ttactagtcc acagtgcata cgtgggctcc aacaggtcct cttggtcgac480cccacagtgc atacgtgggc tccaacaggt cctcttgcgg ccgcccacag tgcatacgtg540ggctccaaca ggtcctcttc catggccaca gtgcatacgt gggctccaac aggtcctctt600cggatccgcc acagtgcata cgtgggctcc aacaggtcct cttccggaat tgcatgcgcg660ttctttgaaa gcagtcgagg gggcgctagg tgtgggcagg gacgagctgg cgcggcgtcg720ctgggtgcac cgcgaccacg ggcagagcca cgcggcggga ggactacaac 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2.根据权利要求1所述的载体，其特征在于，载体上各元件位置为:HRE5: 439-651Survivin promtor: 658-924GFP: 1055-1774MCS: 1862-1889PolA; 2016-2332Ori:2774-3362Amp:3533-4393SpeI:433-438 Sphl:652画657 Fbal:925-930 Sacl:2327誦2332 EcoRI: 1862-1867 Pstl: 1867-1872 Nhel: 1872-1877HindIII: 1884-1889
全文摘要
本发明公开了肿瘤特异性启动子调控的串联miRNA或shRNA表达载体，该载体以pMD19-T为框架载体，包括5个串联的低氧反应元件HRE<sub>5</sub>，survivin promoter及miRNA表达框架反应元件。在miRNA表达框架中包含有EmGFP元件，及MCS多克隆位点。MCS位点可以插入多个不同的miRNA或shRNA序列，实现多靶点或多位点干预。载体大小为4592bp，载体命名为pMD-HRE<sub>5</sub>-SURV/EmGFP-miR。本发明通过HRE<sub>5</sub>及survivin promoter实现肿瘤靶向治疗，避免对正常组织的损伤。同时结合多串联miRNA或shRNA，达到多靶点治疗，提高肿瘤治疗的特异性和靶向性。
文档编号C12N15/85GK101597622SQ200910022879
公开日2009年12月9日 申请日期2009年6月8日 优先权日2009年6月8日
发明者刘利英, 宋土生, 许德辉, 辰 黄 申请人:西安交通大学