小干扰rna快速筛选的载体及其构建方法和应用的制作方法

专利名称：：小干扰rna快速筛选的载体及其构建方法和应用的制作方法
技术领域：
：本发明属于生物
技术领域：
，具,及一种小干扰RNA快速筛选的载体及其构建方法和应用。
背景技术：
：RNA干扰技术是指小的双链RNA可以引起耙肝mRNA的特异,。倉滩弓胞mRNA的特异,的长度约1921,的双链RNA称之为小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)。siRNA己MT泛应用于基因表达调控、基因功會扱疾病的治,究，并成为M生物学最热点的研究领域之一。在美国小干扰RNAaitA疾病治疗的临床试验一、二期阶段(如群性黄斑病，age-relatedmaculardegeneration,AMD)。预计小干扰RNA也将很快进入其它疾病(如肿瘤，病毒性疾病及神经退行性疾病等)的临床试验治疗阶段。财卜，在后基因组时代，小干扰RNA在基因的功能研究中也将会起到非常重要的作用。在真核细胞中通常是小干扰RNA(19-21双链RNA)，作用。筛选有效的小干扰RNA耙片颇于RNA的干扰效果具有重要意义。目前筛选有效干扰RNA片段的方法有多沐(1)Westernblot(2)RT-PCR(3)Northernblot(4)real-timePCR等，所有这些方法都比较费时，鋭，稳定性较差。
发明内容本发明所要解决的一个技术问题在于提供一种用于小干扰RNA快速筛选的载体。本发明所要解决的另一个技术问题在于,一种快速、简便的用于小干扰RNA快速筛选的载体的构建方、法。本发明所要解决的还有一个技术问题在于皿一种用于小干扰RNA快速筛选的载体的用途。解决J^术问鹏采用的技术方案是小干扰RNA快速筛选载体具有一个3.0kb的骨架载体并含有一个多克隆位点，在载体5'端的多克隆位点处存在报告基因及用于插入一个筛选IES因駄元件的多克隆位点，其下游存在两个相反方向的任意两个不同的pIII启动子，两个启动子之间有两个酶^K立点，并在两个酶切位点之间插入一个用于蓝白斑筛选的皿元件，在载体的3'端多克隆位点处插入一个内参报告基因。本发明的载体5，端多克隆位点处存在的报告基因及插入所筛选耙基因的表达元件为1、所采用的报告基因是EGFP-Flag融合蛋白或是荧光素ll"Flag。2、插入所筛选耙基因是克隆在报告基因终止码之后，两者不能形成一个融合蛋白，所筛选的基因作为3'端非翻译区的一部分。3、报告基因及插入所筛选耙基因拥有同样一个启动子及polyA。本发明的任意两个不同的pIII启动子为HI和U6。本发明的在两个启动子之间插入的一个用于蓝白斑筛选的皿元件为细菌laczalpha表达元件。本发明的载体的3'端多克隆位点处插入的内参报告基因为RFP或EGFP基因。上述小干扰RNA快速筛选的载体的构建方法包括下述步骤1、构建小干扰RNA载体的基本骨架该基本骨架为3.0kb，并含有一个多克隆位点。2、构建报告基因-Flag表达元件的载体经过PCR扩增报告基因-Flag融合蛋白基因，PCR扩增2535个循环，经转化感受态细胞DH5a、挑菌、碱性^lf^il，粒DNA，经酶切鉴定，将阳性克^M3！Nhel+BaraHI双酶切与同样的酶切处鹏pEAAL"CMV载体连接，获得的载娜之为pEAAL"CMV-报告基因-Flag,PCR扩增SV40pA，经Xbal+Kpnl酶切与pEAAL~CMV-报告基因-Flag连接，获ff^告基因-Flag^ii^件的载体pEML"CMV-报告基因-Flag-SV40pA，在FLAG的3'端含有一个终止码，在终止码与pA之间有—多克隆位点，获得eGFP-Flag表达元件的载体。3、构建小干扰RNA表达载体报告基因-Flag，元件的下游，MiiPCR的方法将人Hl启动子经Kpnl+Xhol目切后克隆到pEAAL"CMV-报告基因-Flag-SV40pA载体中；在以上载体中将人mU6启动子经Spel+Sful鹏切后克隆到载体中，将用于蓝白斑筛选的毅元件经Xhol十Spel双酶切后克隆至i认Hl及人mU6启动子之间，获得小千扰RNA表达载体。4、构建小千扰RNA快速筛选的载体舰PCR扩增内鄉告基因，25-35个循环后收获DNA，纟链接、挑菌，减I4I^提M粒DNA，经酶切鉴定，将阳性克H^^II切克隆至忡间载体，将教内参基因的表达元件经5&1+Notl酶切后克隆在mU6启动子的下游，获得构建小干扰RNA快速筛选的载体。本发明的步骤2中PCR扩增报告基因不含有终止密码子，并在3'端插入FlagTAA序列。本发明的步骤2中在同一CMV启动子3'端，依次克隆报告基因和所筛选耙基因的敏元件。小干扰RNA快速筛选的载,筛选小干扰RNA中的用途。小干扰RNA快速筛选的载体的使用方法如下1、克隆所筛选耙基因并插入快速筛选载体。2、设计针对耙基因siRNA片段，并将其克隆插入决速筛选载体。3、转染293细胞筛选最有效的siRNA千扰片段。本发明siRNA快速筛选的载体(RapidscreeningofsiRNAtarget,pRSST)是在载体中含有一个双启动子(人U6及人Hlpo1IH启动子)，两个启动子之间有两个单一的酶切位点，用于体外合成表小干扰RNA片段的克隆。同时在载体中含有一个报告基因，如绿色荧光蛋白的表达元件，在此下游有一多克隆位点，可以克隆将要筛选小千扰RNA靶基因，在报告基因与靶基因片段之间有一个终止码。此外在载体中还有一个表达红色荧光蛋白的表达元件。将合成的小干扰RNA片段及相应的耙片段基因克隆到载体后，转染293细胞，根据绿色荧光蛋白与红色荧光蛋白表达量的比例来判断小干扰RNA干扰效果。此种方法快速、简便筛选有效的小干扰RNA片段。本发明的优点为1、小干扰RNA^il筛选的载体TO告基因与所瓶选的耙基因，成同一转录子，而不是形成融合蛋白，报告基的,不，插入耙基因序列的影响。根据报告基因表达的高低，在荧光显微镜下根据GFP荧光^m^直接判断小干扰RNA干扰效率，不需做Westernblot、RT-PCR、Northernblot或real-timePCR等，因此快速、简便。2、小干扰RNA舰筛选的载体含有内鄉告基因，可以避免由于转染效率所带来的穀ij，本发明方法比较客观、正确。3、使用本载体即可以判断小干扰RNA的干扰效率，不需与其它载体做共转染，转染效率高，便于结果的爿见察。4、小干扰RNA',筛选的载体，两个pin启动子表达小干扰RNA，直銜Iffl两个DNA引物退火后将小干扰RNA克隆到两个启动子之间的酶切位点中。在两个启动子之间克隆细菌laczalpha的元件，fflil蓝白斑来筛选小干扰片段的阳性克隆，因此本发明方法不仅可以非常容易克隆小干扰RNA而且阳性克隆筛选也非常容易，采用该方法筛选小干扰RNA费用低、省时。图1是pRSST/Hecl快速筛选载体骨架图。图2是Heel基因克隆到pRSST快速筛选载体图。图3是siHecl片段克隆到pRSST/Hecl载体图。图4是siHecl的PCR扩增片段图。图5是siHecl克隆到pMirdownhU6载体图。图6是pMirdownHu6-siHecl斷氐GFP的駄图。图7是pMirdownhU6-siHecl明显降低GFP的蛋白7K平表达图。图8是pRSST/Survivin双酶切鉴定电泳图。图9是pRSST/Survivin-siRNA酶切鉴定电泳图。图10是pMirdown-siSurvivin酶切鉴定电泳图。图11是pMirdown-siSurvivin明显抑制Survivin的表达图。图12是pMirdown-siSurvivin明显抑制eGFP蛋白水平的泰&图。图13是XIAP基因的克隆图。图14是XIAPsiRNA片段的克隆图。图15是siXIAP的PCR扩增片段图。图16是siXIAP的PCR扩增片段的克隆图。图17是pMirdownhU6-siXIAP酶切鉴定电泳图。图18是pMirdown-siXIAP日月显抑制XIAP的表达图。图19是pMirdown-siXIAP明显抑制eGFP蛋白水平的表达图。图20是小干扰RNA快速筛选载体的结构示意图。具体实施例方式.下面结合附图和实施例对本发明进一步详细说明，但本发明不限于这些实施例。实施例1以报告基因为eGFP-Flag，pIII启动子为Hl和U6启动子，位于pIII启动子为Hl和U6启动子之间用于蓝白斑筛选的基因为细菌laczalpha基因，内参报告基因为RFP的快速筛选为例其构建方法步骤如下1、构建小干扰RNA载体基本骨架peGFPNl载体购自Clontech公司，经过AflII及Asel双酶切后与Asel-Nhel-BamHI-Pmel-Clal-Xbal-Kpnl-Xhol-Spel-Sful-Notl-AflIIlinker相连接，其linker的序列为ATTMTATGCTAGCAGGATCCAGTTTAMCATCGATAATCTAGMGGTACCCTCGAGATACTAGTTTCGMCGCGGCCGCCTTMGo经T4连接酶R5X:连^1夜，连接产物转化感受态细胞DH5a后，并涂布于含有100Pg/ml的氨转霉素的LB平板中。挑取鶴，接种到满Mg/ml的氨节青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性^P法提5at粒DNA，经过Clal37r酶切及测序鉴定后，将阳性克隆载体称为pEAAL载体，即小干扰RNA载体基本骨架载体。将阳性克隆载体菌种-80'C保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-20。C。2、构,告基因eGFP-Flag表达元件的载体经过PCR扩增CMV启动子，经PacI及NheI酶切后克隆到pEML载体中，所获得的载^T、为pEAAL-CMV。将上游引物及下游引物经以下程序扩增eGFP-Flag融合蛋白基因，PCR扩增条件94°C、5餅，94。C、l^Ht,55。C、1辦中，72。C、1分钟。使用BioradPCR扩增仪，30个循环后收获DNA，用质量浓度为1%琼脂糖电泳纯化回收后与pGEMT-easy载体相连接，经转化感受态细胞DH5ci后，并涂布于含有i00Mg/ml的氨节青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100Mg/ml的氨节青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，酶切鉴定，将阳性克隆经过Nhel+BamHI双酶切后与同样的酶切处理后pEAAL-CMV载体连接，获得的载体称为pEAAL-CMV-eGFP-Flag。PCR扩增SV40pA，经Xbal+Kpnl酶切后与pEAAL~CMV-eGFP-Flag连接，获得eGFP-Flag表达元件的载体pEAAL-CMV-eGFP-Flag-SV40pA。在FLAG的3'端含有一个终止码。在终止码与pA之间有一多克隆位点，用于所筛选耙基因的克隆。以上所有的连接反应均是在T4连接酶的作用下，15r度连接过夜，连接条件是2W酶切纯化片段，11410XT4连接酶缓冲液，酶切载体，T4连接酶，5.三蒸水，16。C连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH5a，并涂布于含有100Mg/ml的氨节青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100Mg/ml的氨苄青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提顿粒DNA，经相应酶切及测序鉴定，将菌种-80。C保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-20。C。3、构建小干扰腿魏载体eGFP-Flag,元件的下游，i!3iPCR的方法将人Hl启动子经Kpnl+Xhol双酶切后克隆到pEAAL"CMV-eGFP-Flag-SV40pA载体中；在以上载体中将人mU6启动子经Spel十Sful双酶切后克隆.妾U载体中，将1&023基因经处01+Spel双酶切后克隆到人Hl及人mU6启动子之间，构建小干扰RNA^i^体。以上H1和U6启动子的位置可以互相替换。以上所有的连接反应均是在T4连接酶的作用下，15'。C连接过夜，连接剝牛是2W酶切纯化片段，M10XT4连接酶缓冲液，M酶切载体，0.5WT4连接酶，5.5M1三蒸水，16。C连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH5a，并涂布于含有100Mg/ml的氨节青霉素的LB平板中，挑取菌落，接种到100Mg/ml的氨节青霉素的LB培鎌中，225rpm振荡培养过夜，经碱性,赚取质粒DNA，紐相应酶切及测序鉴定，将菌种-80。C保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-2(TC。4、构建小干扰RNA快速筛选载体通过PCR扩增RFP内参基因，PCR扩增条件94°C、5分钟，94°C、1梦沐55°C、1分钟，仪，30个循环后收获DNA，经浓度为1%琼脂糖电泳纯化回收后与pGE肌-easy载体相连接，并涂布于含有100Mg/ml的氨节青霉素的LB平板中。挑取皿，接种到100Mg/ml的氨节青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性I^&提^M粒DNA，经酶切鉴定后，将阳性克H^31^酶切克隆到中间载体，将魏RFP内参基因的毅元件经Sful+Notl酶切后克隆在mU6启动子的下游。以上所有的连接反应均是T4连接酶的作用下，15'C连接过夜，连^K牛是2W酶切纯化片段，M10XT4连接酶缓冲液，M酶切载体，0.5WT4连接酶，5.514三蒸水，16。C连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH5a，并涂布于含有100Pg/ml的氨转霉素的LB平板中。挑取離，接种到100Mg/ml的氨节青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性,赚^M粒DNA，经过相应酶切及测序鉴定，获得小干扰RNA快速筛选载体，命名为pRSST。其结构的示意图可见图20。实施2以报告基因为荧光素酶，内参基因为EGFP的小干扰RNA快速筛选为例其构建方法步骤如下1、构建小干扰RNA载体基本骨架的方法与实施例1完全相同。2、构對艮告基因荧光素酶-Flag,元件的载体经过PCR扩增CMV启动子，经PacI及NheI酶切后克隆到pEML载体中，所获得的载体称为pEAAL-CMV。将上游弓嫩及下游弓嫩经以下禾MiW增荧光素酶-Flag融合蛋白基因，PCR扩增^f牛94°C、30秒，98°C、10秒，55°C、15秋72'C、l射中45秒。使用BioradPCR扩增仪，25个循环后收获DNA，用质量浓度为1%琼脂糖电泳纯化回收后与pGEMT-easy载体相连接，经转化感受态细胞DH5a，涂布于含有100Mg/ml的氨节青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100Mg/ml的氨节青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解法提取质粒DNA，酶切鉴定，将阳性克隆经过Nhel+BamHI双酶切后与同样的酶切处理后pEAAL-CMV载体连接，获得的载体称为pEML-CMV-荧光素酶-Flag。PCR扩增SV40pA,经Xbal+Kpnl酶切后与pEML-CMV-荧光素酶-Flag连接，获得荧光素^Flag表达元件的载体pEML-CMV-荧光素酶-Flag-SV40pA。在FLAG的3'端含有一个终止码。在终止码与pA之间有一多克隆位点，用于所筛选耙基因的克隆。以上所有的连接反应均是在T4连接酶的作用下，15t:度连接过夜，连接^f牛是2W酶切纯化片段，M10XT4连接酶缓冲液，114酶切载体，T4连接酶，5.三蒸水，16。C连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH5a，并涂布于含有100Mg/ml的氨节青霉素的LB平板中。挑取菌落，接种到100Mg/ml的氨节青霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性裂解,取质粒DNA，经相应酶切及测序鉴定，将菌种-8(TC保存，并将相应的载体中量提取DNA保存在-20。C。3、构建小干扰RNA,载体的方法与实施例1完全相同。4、构建小干扰RNA快速筛选载体M3lPCR扩增EGFP内参基因，PCR扩增条件94°C、5辦中，94°C、1分钟，55°C、1分沐72°C、1糊。4顿BioradPCR仪，25个循环后收获DNA，经浓度为1%琼月識电泳纯化回收后与pGEMT-easy载淋目连接，并涂布矜有100Mg/ml的氨节青霉素的LB平板中。挑取鶴，接种到謂Mg/ml的氨节青霉素的LB培养液中，2^5rpm振荡培养过夜，经碱性^取质粒DNA,经酶切鉴定后，将阳性克H^il^酶切克隆到中间载体，将敏EGFP内参基因的毅元件经NheI+NotI酶切后克隆在mU6启动子的下游。以上所有的连接反应均是T4连接酶的作用下，15"连接过夜，连接^f牛是酶切纯化片段，MioxT4连接酶缓冲液，M酶切载体，0.T4连接酶，5.514三蒸水，16。C连接过夜。连接产物转化感受态细胞DH5a，并涂布矜有100Mg/ml的氨节青霉素的LB平板中。挑取，，接种到100^g/ml的氨，霉素的LB培养液中，225rpm振荡培养过夜，经碱性,、^IM粒DNA，经过相应酶切及测序鉴定，获得小干扰RNA快速筛选载体o实施例3在以上的实施例1、2的构建小干扰RNA快速筛选载体步骤4中，通过PCR扩增EGFP内参基因，PCR扩增餅94。C、5规94。C、l规55。C、l规72。C、1射中。顿BioradPCR仪，35个循环后收获DNA，经浓度为P戚月離电泳纯化回收后与pGENTT-easy载体相连接，并涂布矜有100Mg/ml的氨节青霉素的LB平板中。该步骤中的其它步骤与相应的实施例相同，其它步骤与相应的实施例相同。实施例4将实施例l构建的小干扰RNA快速筛选载体用于针对人HeclsiRNA(siHecl)的快速筛选中的用途如下1、所筛选耙基因Hecl克隆插入快速筛选载体将Hecl基因从pGE虹-easy载体上切下来回收，通过Clal和Spel两个酶切位点连接到siRNA舰筛选载体，其连接割牛是5f4酶切纯化片段，M10XT4连接酶缓冲液，M酶切载体，T4连接酶，三蒸水，16。C连接过夜。接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，涂布于IOOMgM的氨节青霉素的LB平板上培养过夜，挑取单克隆菌落，接种到100Mg/ml的氮节青霉素的LB培养液中，1416小时后，经碱性裂I^提取质粒DNA。用EcoRI酶切鉴定，切出一条1.2kb的带为阳性克隆，命名为pRSST/Hecl，克隆1-8为阳性，结果可见图2。2、设计正对Hecl的siRNA片段，并将其克隆至pRSST/Hecl(1)禾U用软件设计耙向Heel基因的siRNA序列在GenBank中取得Heel基因全长mRNA序列，共2150个碱基。在siRNA设计网站(http:〃www.wi.mit.edu/index.h加l)选择6个不同的干扰耙点，在GenBank数据库中用BLAST检索，确认所设计的6个siRNA序列与耙细胞其它基因无同源性。根据上述结果分别合成6对针对Hecl编码序列的正义和反义的寡聚核苷酸片段。所设计的寡核苷酸序列及其靶向位点见表l。表l6对针对Heel基因的siRNA寡核苷,列及其耙向位点名称序歹ij耙向位点LI:5，TCGAAAAAAGGACCCGAGACCACTTMTTTTTTT3，241-263L2:5,CTAGAAAAAATTMGTGGTCTCGGGTCCTTTTT3,L3:5，TCGAAAAAAGCCATTCTTGACCAGAAATTTTTT3'962-984L4:5，CTAGAAAAAATTTCTGGTCMGMTGGCTTTTT3，L5:5，TCGAAAAAAGGACCTGGMGCTGMCMTTTTTT3'1153-1175L6:5，CTAGAAAMATTGTTCAGCTTCCAGGTCCTTTTT3，L7:5，TCGAAAAAAGGTGCTGAGMTTCCAAAGTTTTTT3，1280-1302L8:5，CTAGAAAAAACTTTGGMTTCTCAGCACCTTTTT3，L9:5，TCGMMAAAGCGATTGAAACACMTTATTTTTT3'1216-1238L10:5，CTAGAAAAAATMTTGTGTTTCMTCGCTTTTTT3'Lll:5，TCGAAAAAAGAAGAGGTTCCMGMTCTTTTTTT3，443-465L12:5，CTAGAAAAAAAGATTCTTGGMCCTCTTCTTTTT3，注序列中间为戶欣计19bpsiRNA的政反鄉列，fc^晶以6个T作为RNA聚^iHII的ll^止子，合成的序列两端有设计的Xhol和Spel酶切位点。(2)将干扰片段克隆到siRNA,筛选载体iKl软件设计得到的6对针对人Heel基因不同靶点的siRNA序列(LI-L12)由上海生工公司合成，合^=物浓度配制成20mM，将相对应的引物各取15ul，混合，在室温退火4小时，合成双链siRNA干扰片段。合成的6个siRNA片段通过Xhol和Spel两个酶切位点分别克隆到针对人Heel基因的siRNA鹏筛选^ii载体pRSST/Hecl中，将连接产物转化DH5a规杆菌感受态细胞，涂布于100iVml的氨^W霉素的LB平fch培养过夜，挑取单克隆接种到lOOMg/ml的氨节青霉素的LB培养液中，1416小时后，经1^性裂解法提取质粒DNA。质粒经Xhol酶切鉴定，切不动鉴定为阳性克隆，结果如图3所示，图中10至26为阳性克隆。阳性克隆命名为pRSST/Hecl-siRNA。11载体结构可见图1。3、转染293细胞筛选最有效的siRNA干扰片段在转染前1天，将2X105个293细胞接种于每L含^f只浓度为10%的NCS的500y1DMEM培养基的24孔板中。采用脂质体Lipofectaraine2000TM进行转染293细胞，即在一个1.5ml的离心管中加入50u10PTI-MEM，再加入3u1的pRSST/Hec1-siRNA混匀；在另一个1.5ml的离心管中加入1.1的脂质体，混合后作用5分钟，将DNA管中的溶液加入脂质体管中，混匀后室温静置20分钟，将混合物加入到含有10%NCSDMEM的24孔板中，4小时后换液，加入10%NCSDMEM培养基，24小时后，利用倒置荧光显微镜观察绿色荧光蛋白(GFP)的表达量，根据GFP表达量的强弱，最终筛选出最有效干扰片段L3、L4。即针对Hecl基因第962-984的siRNA片段。'4、检测筛选出的siRNA有效片段的干扰效果(1)采用以下3个引物(PI-P3)进行PCR，其中以P3(靶向962-984的siRNA片段)为丰鎌，Pl及P2为上下游引物PCR扩增获得片段，如图4所示，回收纯化PCR产物克隆到pGE虹载体，行扩增，测序正确后经Xhol及EcoRI酶切纯化，与经相同酶切的siRNA高效^ii载体pMirdownhU6连接。连接^#是酶切纯化片段，1W10XT4连接酶缓冲液，1.514酶切载体，0.5WT4连接酶，三蒸水，6'C连接过夜。所获得的针对Hecl的siRNA片段表达载体命名为pMirdownhU6-siHecl，如图5所示，HindII聰切鉴定为阳性克隆。其中合成的引物如下(划线部分为引入的限制性酶切位点)Pl:5'mir3QPCRXhoI:CAGMGGCTCGAGMGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG;P2:3'mir30PCRSpeI:CTAMGTAGCCCCTTACTAGTCGAGGCAGAGGCA;P3:5'TGCTGTTGACAGTGAGCGAGCCATTCTTGACCAGMATTAGGMGCCACAGATGTMTTTCTGGTCMGMTGGCGTGCCTACTGCTCGGA3'。(2)舰基因转染检测GFP鼓^t染的前1天将1X106个293细B^于1^R浓度为10%的NCSD腦:^^基的60ram培养皿中。采用CaCl2法共转染293细胞，即在一个1.5mL的离心管中加入250uL的pH7.14的2XHBS;在另一个1.5mL的离心管中加入25uL的摩尔浓度为215mol/L的CaCl2，2Pg表达GFP的pSilencer-Heel质粒DNA,8ygpMirdownhU6-siHecl，最后加入去离子水使之总体积为250uL;将DNA管中的液体缓缓加入含2XHBS的管中，然后在室温放置1分钟。最后将体积为500uL的混合物加入到含有2mL的20mL/LNCSDMEM培养基的60mm培养皿中，4小时后换液，加入4mL的体积浓度为10。/。的NCSDMEM培养基，72小时后检测GFP表达。16ugpMirdownhU6-siHecl和16ugpMirdownHu6-siContro1CaC12法共转染293细胞方法与上述方法相同。经10倍荧光显微镜照相，如图6所示，图6中A为2^gpSilencer-Hecl和16Mg的pMirdownHu6-siContro1共转染组，作为对照组；B为2MgpSilencer-Hecl和8MgpMirdownhU6-siHecl共转染组，作为处理组；C为2PgpSilencer-Hecl禾n16MgpMirdownhU6-siHecl共转染组，作为处理组；结果表明，相比对照组A，处理组B、C荧光强度明显降低。(3)用免疫印迹法测试蛋白7jC平的siRNA干扰效果在细胞转染72小时后，收获细胞，并将细胞沉淀溶于含蛋白,制剂细臓m中，置于冰上裂解40辦后，离心获得细胞裂解上清，经考马斯亮蓝定量，上样10ug样品，经SDS-PAGE，将蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜上，用针对Flag或ci"GAPDH的单抗，与聚偏二氟乙烯膜反应，经二抗，ECL显影，获得免疫印迹实验结果。如图7所示，图7中37为2pgpSilencer-Hecl和16MgpMirdownHu6-siControl共转染组，作为对照组；38为2MgpSilencer-Hecl和8MgpMirdownhU6-siHecl共转染组，作为对照组；39为2MgpSilencer-Hecl和16PgpMirdownhU6-siHecl共转染组，作为对照组；结果显示，相比对照组37，处理组38，39明显降低了GFP的蛋白表达水平。实施例5将实施例1构建的小干扰RNA快速筛选载体用于针对Survivin的有效siRNA片段的快速筛选中的用途如下1、所筛选耙基因Survivin克隆插入快速筛选载体两端克隆有Clal和Xbal的Survivin基因连接到pGEMT-easy载体上鄉一步扩增后，舰Clal和Xbal双酶切该连接产物，37。C孵育2个小时，进行质M^浓度为1%的琼脂糖电泳纯化回收目的片段。将该目的基因片段与siRNA快速筛选载体连接，命名为pRSST/Survivin。连接条件是514酶切纯化片段，mi10XT4连接SP夷沖液，2rt酶切载体，T4连接酶，1.5)4三蒸水，16。C连接过夜。连接产物pRSST/Survivin转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，涂布于100Mg/ml的氨节青霉素的LB平社培养过夜，挑取单克隆接种到100Mg/ml的氨节青霉素的LB培养液中，1416小时后，经碱性i^4Ji鹏粒DNA。质粒经Clal与Xbal双酶切鉴定。切出一条约430bp带的为阳性克隆。电泳结果如图8所示，在图8中，M为DNA^f量标准，40-43为pRSST/Survivin，40-43都为阳性克隆。2、设计针对Survivin的siRNA片段，并将其克隆至pRSST/Survivin(1)利用软件设计针对耙向Survivin基因的siRNA片段根据GenBank数据库提供的人Survivin(NM—001168)的cDNA序列，在siRNA设计网站(http:〃ww.wi.mit.edu/index.h加l)选择6个不同的干扰位点，在GenBank数据库中用BLAST检索，确认所设计的6个siRNA序列与耙细胞其它基因无同源性。根据，结果分别合成6对针对Survivin编码序列的正义和反义的，核苷酸片段。序列两端分别为Xhol和Spel酶切位点，:1以6个T作为RNA聚合酶II鹏皿终止子。应用网络所设计的,苷酸序列及其耙向位点见表2。_表26对针对Survivin基因的siRNA寡核苷,列及其耙向位点_名称序列靶向位点Fl5'TCGAAAMATGGCCGAGGCTGGCTTCArmTT3'111-1335'CTAGAAAAAATGMGCCAGCCTCGGCCATTTTT3'F25'TCGAAMAAGCAGCTGGCTGCCATGGATTTTTT3'406-4285'CTAGAMAMTCCATGGCAGCCAGCTGCTTTTT3'F35'TCGAMMAGGACCACCGCATCTCTACATTTTTT3'43-655'CTAGAAMAATGTAGAGATGCGGTGGTCCTTTTT3'F45'TCGAMAAACCACCGCATCTCTACATTCmTTT3'46-685'CTAGAMMAGMTGTAGAGATGCGGTGGTTTTT3'F55'TCGAAAMACCGCATCTCTACATTCMGTTTTTT3'49-715,CTAGMMAACTTGMTGTAGAGATGCGGTTTTT3,F65'TCGAAAAAAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTTTTT3'15H735'CTAGAAAAAACACTGGGCCAAGTCTGGCTTTTT3'(2)将干扰片段克隆到si腿快速筛选载体将利用网络工具设计的针对人Survivin基因不同位点的6个siRNA片段(Fl-F6)由上海生工合成。将所合成的6对弓物分别稀释到2關o1，分另陬每对弓l物的两条互补寡辨,15"至离心管中在室温退火4小时，将结合舰链的6个siRNA片段ffiilXhol和Spel两个酶切位点分别连接到快速筛选载体pSilencer-Survivin中，3^接产物命名为pSilencer-Survivin-siRNA。连^f牛是2f4酶切纯化片段，M10XT4连接酶缓冲液，lrt酶切载体，0.5riT4连接酶，三蒸水，16。C连敏夜。连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，涂布于腦Mg/ml的氨转霉素的LB平板上培养过夜，挑取单克隆接种到lOO^g/ml的氨节青霉素的LB培养液中，1416小时后，经碱性裂餘鹏M粒DNA。质粒经XhoI酶切鉴定。结果如图9所示，在图9中，M为DNA^HP量标准，44-53为pRSST/Survivin—siRNA，C为pSilencer—Survivin,作为Xt照质粒，是没有^iia切的DNA。相比阳性对照C，44-53为酶切不动，鉴定为阳性克隆。阳性克隆命名为pRSST/Survivin-s麵3、转染293细胞筛选最有效的siRNA干扰片段在转染的前1天，将2X105个293细胞接种于每孔含^f只浓度为1TONCS的500y1D廳培养基的24孑L板中。用月旨质体Lipofectamine2000TM进行转染293细胞，即在一个1.5ml的离心管中加入50^1的0PTI-MEM培养基,再加入4nl的pRSST/Survivin-siRNA混匀；在另一个1.5ml的离心管中加入2nl的脂质体，混合后作用5溯，将DNA管中的溶液加入脂质体管中，混匀后室温静置20分钟，将混^t)加入到含有^f只浓度为10%的NCSDMEM培养基的24孔板中，各转染组均做复孔，转染后48小时Mi^见察检测ftfe荧光蛋白(eGFP),的强弱来筛选沉默效率最高的siRNA片段。确定F6为最有效的干扰片段，即针对Survivin基因第151-173位点的siRNA片断。4、检测筛选出的siRNA有效片段的干扰效果(1)pMirdown-siSurvivin载体的构建根据最终选择的siRNA片段，采用以下3个引物(P1-P3)，其中以P3为模板，P1及P2为上下游弓l物进行PCR扩增。弓l物中的下划线部分为引入的限制性酶切位点。Pl:5'mir30PCRXhol:CAGAAGGCTCGAGMGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG,P2:3'miR30PCREcoRI:CT嵐GTAGCCCCTTGAATTCCGAGGCAGTAGGCA,P3:TGCTGTTGACAGTGAGCGAGCCAGACTTGGCCCAGTGTTAGTGAAGCCACAGATGTMCACTGGGCCMGTCTGGCGTGCCTACTGCCTCGGAo获得的片段与pGEMT-easy载体连接，测序正确后，经Xhol及EcoRI酶切纯化后与根据mir30骨架皿计合成的小千扰RNA^Ji^体pMirdown连接。经过HindII鹏切鉴定结果，其中切不动为阳性克隆。结果如图10所示，在图10中，M为DNAM量标准；54-62为pMirdown-siSurvivin;C为pMirdown-siSurvivinclonel作为对照质粒，是没有经过酶切的DNA。相比对照质粒，54-62表现为酶切不动，鉴定为阳性克隆，所获得的针对Survivin的小干扰RNA片段表达载体称为pMirdown-siSurvivin。(2)舰基因转染检测GFP鋭在转染的前1天，将1X106个293细胞接种于^f只浓度为10%的NCSDMEM培养基的60mra培养皿中。翻CaCl2方法转染293细胞，即在一个1.5mL的离心管中加入250uL的pH7.4为2XHBS;在另一个1.5mL的离心管中加入25yL的摩尔浓度为2.5raol/LCaCl2，16ug的pSilencer-Survivin及2pg的pMirdown-siSurvivin,最后加入去离子7jC使之总体积为250yL;将含DNA管中的液体缓慢加入含2XHBS的管中，在室温放置1辦中，将術只为500uL的混溯加入到含有2mL的体积浓度为2%的ICSDMEM培养基的60mm培养皿中,4小时后换液，加入4mL的体积浓度为10%的NCSDMEM培养基，48小时后通过GFP表达情况检测干扰效果。非相关DNApControl的CaCl2方法与上述方法相同，作为对照组。如图11所示，在图11中，D为pMirdown-siSurvivin组，E为pMirdownhU6-control,作为阴性X寸照。D组与E组相比，D组可显著抑制Survivin的^ii，GFP,S^明显低于E组。(3)免疫印3lE检测蛋白水平siRNA干扰效果在细胞转染48小时后，收获细胞，并将细胞沉淀溶于含蛋白,制剂细臓解液中，置于冰中裂解40糊后，离心获得细|上清，经考马斯亮蓝定量，上样30ug样品，经SDS-PAGE后，将蛋白转移妾鹏酸纤维素^b用针对Flag或a-tubulin的单克隆抗体与硝酸纤维素膜反应，经二抗，ECL显影，获得结果。如图12所示，在图12中，63为pMirdownhU6-siContro1，作为对照组；64为pMirdown-siSurvivin，免疫印迹实验结果显示，相比对照组，pMirdown-siSurvivin明显抑制eGFP蛋白水平的,。实施例6将实施例1构建的小干扰RNA快速筛选载体用于针对人XIAP的有效siRNA片段的快速筛选中的用途如下1、所筛选耙基因Survivin克隆插入快速筛选载体利用Xbal与Clal酶将目的基因XIAP从pGEM-Teasy载体上切下回收并与siRNA筛选载体连接，连S^牛是酶切纯化片段，M10XT4连接酶缓冲液，M酶切载体，T4连接酶，5.三蒸水，16。C连接过夜。连接产物转化DH5a大肠杆菌感受态细胞，涂布于100Mg/ml的氨转霉素的LB平社培养过夜，挑取单克隆接种到lOOlJg/ml的氨节青霉素的LB培鎌中，1416小时后，经碱性I^^I^M粒DNA。质丰趟HindII鹏切鉴定，切成线性的为阳性克隆命名为pRSST/XIAP，结果如13所示，在图13中，M为DNA肝量标准,其中除72，均切成线性，为阳性克隆。2、设计针对人XIAP的siRNA片段，并将其克隆至pRSST/XIAP(1)针对AXIAP设计不同序列的siRNA序列根据GenBank数据库提供的人XIAP基因全长序列(2540bp),选取XIAP编码区(34-1527bp)提交siRNA设计网站(http:〃www.wi.mit.edu/index.h加l)选择千扰位点，在GenBank数据库中用BLAST检氣确认所设计siRNA序列与靶细胞其他基因无同源性。根据上述结果分别合成六对针对XIAP编码序列的正义和反义的寡聚核苷酸片段。最末端以6个T作为RNA聚合酶III的转录终止子。合成的序列两端有设计的XhoI和Spel酶切位点见表3。表36对人XIAP基因的siRNA寡核苷,列及其耙向位点<table>tableseeoriginaldocumentpage17</column></row><table>(2)将干扰片段克隆到si腿快速筛选载体将合成的六对弓嫩的正义和反义驟核苷酸片段分别各取15nl等比例混合，命名为F1-F6。利用Xhol和Spel酶切位点駄到pRSST/XIAP中。连接^f牛是酶切纯化片段，lrt10XT4连接酶缓冲液，1M1酶切载体，0.5MlT4连接酶，5.三蒸水，16。C连接过夜。连接产物转化DH5a规杆菌感受态细胞，涂布于100Mg/ml的氨节青霉素的LB平板上培养过夜，挑取单克隆接种到100Mg/ml的氨节青霉素的LB培养液中，1416小时后，经碱性粒0亂质粒经XhoI酶切鉴定，切不动为阳性克隆。阳性克隆命名为pRSST/XIAP-siRNA，如图14所示，在图14中，M为DNAM量标准；C为对照pSilencer-XIAP，作为对照质粒，是没有经过酶切的DNA。相H^T照质粒,7479为pRSST/Survivin-siRNA，酶切不动为阳性克隆。3、转染293细胞筛^ft有效的siRNA干扰片段在转染前1天，将2X105个293细胞接种于含有体积浓度为10%的NCSDMEM培养基的24孔板中。采用脂质條转染293细胞，即在一个1.5ml的离心管中加入50ul0PTI-MEM，加入3^1的DNA，混匀后作用5射中；在另一个1.5ml的离心管中加入1.5ul糊旨质体，混合后作用5分沐L5ml的离心管中的溶液加入脂质体管中，混匀后作用20糊，将混，加入到^f只浓度为1战的NCSDMEM培养基的24孔板中，4小时后换液，加入体积浓度为10%的NCSDMEM培养基，分别在24、48小时后，检测乡絶荧光蛋白的敬量，能有效斷私艳荧光蛋白的表达弓破柳卩为最有效的沉默人XIAP的siRNA片段。最终筛选出最有效千扰片段Fl。即针对XIAP基因660-682bp的片段。4、检测筛选出的siRNA有效片段的干扰效果(1)pMirdownhU6-siXIAP载体的构建采用以下3个引物(Pl-P3),其中以P3为m^，Pl、P2为上下游引物PCR扩增获得片段，如图15所示，在图15中，黑色箭头表PCR产物。连入pGEM-Teasy载体，EcoRI酶切鉴定正确，如图16所示，在图16中，M为DNA^量标准，81-97为阳性克隆。领ij序正确后经Xhol及EcoRI酶切纯化后与siRNA高效^ii载体pMirdownhU6连接，所获得的针对XIAP的siRNA片段^ii载体用HindIII酶切，酶切不动为阳性克隆，命名为pMirdownhU6-siXIAP。如图17所示，在图17中，M为DNA肝量标准，88-99为阳性克隆。合成的引物如下(划线部分为引入的限制性酶切位点)Pl:5'mir30PCRXhoI:CAGAAGGCTCGAGMGGTATATTGCTGTTGACAGTGAGCG;P2:3'mir30PCRSpeI:CTAAAGTAGCCCCTTACTAGTCGAGGCAGTAGGCA;P3:5'TGCTGTTGACAGTGAGCGAGGCGACACTTrCCTAATTGTAGTGAAGCCACAGATGTACAATTAGGAAAGTGTCGCCGTGCCTACTGCCTCGGA3'。(2)舰基因转染检测GFP敏在转染的前l天，将1X106个293细胞接种于^f只浓度为l(m的NCSDMEM培养基的60mmi咅养皿中。用CaCl2方法转染293细胞，即在一个1.5mL的离心管中加A250uL的pH7.14的2XHBS;在另—个1.5mL的离心管中加A25uL的摩尔浓度为2.5mol/L的CaCU0.5ugXIAP表达载体，2wgMirdownMJ6-siXIAP，最后加入去离子水至250nL;将含DNA的离心管中的液体缓纟勤!1入含2XHBS的管中，室温放置l分钟，将500yL的混合液加入到含有2mL的体积浓度为战的NCSD腦培养基的60咖培养皿中，4小时后换液,加入4mL的体积浓度为l(B的NCSD腦，2448小时后，检测GFP敏。4ugpMirdownhU6—siXIAP以及2ugpMirdownhU6—siControl的CaCl恭染方法与J^方法相同。如图18所示，在图18中，F为pMirdownhU6-siControl，作为对照组；G代表XIAP表达载体与MirdownhU6-siXIAP的质量比例为l:4的处理组；H代表XIAP表达载体和MirdownhU6-siXIAP的质量比例为1:8的处理组，相比F组，显郝和H组可显著抑制目的基因XIAP的鋭，eGFP親3艘明显低于对照。(3)免疫印迹检测蛋白zK平siRNA千扰效果细胞转染60小时后，收获细胞，将细胞沉淀溶于含蛋白,审跻啣JMW中，置于冰中40分钟，离心得细i^M上清，经考马斯M定量，上样30ug样品，经SDS-PAGE,将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用针对GFP-Flag和Alpha-tubulin的单克隆抗体与硝酸纤维素膜反应，经二抗，ECL显數如图19所示，在图19中，100为pMirdownhU6-siControl，作为对照组；101是XIAP表达载体与MirdownhU6-siXIAP的质量比例为1:4的处理组；102是XIAP表达载体和MirdownhU6-siXIAP的质量比例为1:8的处理组，相t浏照组，pMirdownhU6-siXIAP组可显著抑制目的基因XIAP的表达，GFP蛋白7K平明显斷氏。核苷酸序列核苷,列表〈110〉陕西师范大学〈120〉小干扰RNA快速筛选的载体及其构建方法和应用<160〉1〈210〉1<211>86〈212〉DNA〈213〉AX序列〈220〉〈221〉misc_feature〈223〉不能用任何其它的特征关键词表述的具有生物学意义的区域;新的或少见的特征attaatatgctagcaggatccagtttaaacatcgataatc40tagaaggtaccctcgagatactagtttcgaacgcggccgc80cttaag8权利要求1、一种小干扰RNA快速筛选的载体，其特征在于小干扰RNA快速筛选载体具有一个3.0kb的骨架载体并含有一个多克隆位点，在载体5’端的多克隆位点处存在报告基因及用于插入一个筛选靶基因表达元件的多克隆位点，其下游存在两个相反方向的任意两个不同的pIII启动子，两个启动子之间有两个酶切位点，并在两个酶切位点之间插入一个用于蓝白斑筛选的表达元件，在载体的3’端多克隆位点处插入一个内参报告基因。2、按照权利要求1,的小千扰RNA快速筛选的载体，，征在于所说的载体5'端多克隆位点处存在的报告基因及插入所筛选耙基因的表达元件为(1)所采用的报告基因是EGFP-Flag融合蛋白或是荧光素ll"Flag;(2)插入所筛选耙基因是克隆在报告基因终止码之后，两者不能形成一个融合蛋白，所筛选的基因作为3'端非翻译区的一部分；(3)报告基因及插入所筛选耙基因拥有同样一个启动子及polyA。3、按照权利要求1，的小干扰RNA,筛选的载体，，征在于ffi兑的^壬意两个不同的pIII启动子为Hl和U6。4、按照权利要求1所述的小干扰RNA快速筛选的载体，其特征在于所说的在两个启动子之间插入的一个用于蓝白斑筛选的表达元件为细菌laczalpha表达元件。5、按照权利要求1皿的小干扰RNA旨筛选的载体，，征在于所说的载体的3'端多克隆位点处插入的内参报告基因为RFP或EGFP基因。6、一种小干扰RNA快速筛选的载体的构建方法，其特征在于它包括下述步骤(1)构建小千扰RNA载体的基本骨架该基本骨架为3.0kb，并含有一个多克隆位点；(2)构建报告基因-Flag表达元件的载体皿PCR扩增报告基因-Flag融合蛋白基因，PCR扩增2535个循环，经转化感受态细胞DH5a、挑菌、碱性,漲^M粒DNA，经酶切鉴定，将阳性克驗过Nhel+BamHI双酶切与同样的酶切处理后pEAAL"CMV载体连接，获得的载，之为pEAAL"CMV-报告基因-Flag,PCR扩增SV40pA，经Xbal+Kpnl酶切与pEAAL-CMV-报告基因-Flag连接，获得报告基因-Flag^ii元件的载体pEAAL"CMV-报告基因-Flag"SV40pA，在FLAG的3'端含有一个终止码，在终止码与pA之间有一多克隆位点，获得eGFP-Flag就元件的载体；(3)构建小干扰RNA表达载体报告基因-Flag^ii元件的下游，MilPCR的方法将人HI启动子经Kpnl+Xhol目切后克隆到pEAAL"CMV-报告基因-Flag-SV40pA载体中；在以上载体中将人mU6启动子经Spel+Sful■切后克隆到载体中，将用于蓝白斑筛选的^ii元件经XhoI+Spel双酶切后克隆到人Hl及人mU6启动子之间，获得小干扰RNA表达载体；(4)构建小干扰RNA快速筛选的载体MPCR扩增内魏告基因，2535个循环后收获DNA，链接、挑菌，碱性,驟M粒DNA，经酶切鉴定，将阳性克驗舰酶切克隆到中间载体，将敏内参基因的魏元件经SfuI+Notl酶切后克隆在mU6启动子的下游，获得构建小干扰RNA快速筛选的载体。7、按照权利要求6所述的小干扰RNA快速筛选的载体的构建方法，，征在于所说的步骤(2)中PCR扩增报告基因不含有终止密码子，并在3'端插入FlagTAA序列。8、按照权利要求6所述的小干扰RNA快速筛选的载体的构建方法，其特征在于所说的步骤(2)中在同一CMV启动子3'端，依次克隆报告基因和所筛选耙基因的表达元件。9、权利要求1的小干扰RNA快速筛选的载,筛选小干扰RNA中的用途。全文摘要一种小干扰RNA快速筛选的载体，小干扰RNA快速筛选载体具有一个3.0kb的骨架载体并含有一个多克隆位点，在载体5’端的多克隆位点处存在报告基因及用于插入一个筛选靶基因表达元件的多克隆位点，其下游存在两个相反方向的任意两个不同的pIII启动子，两个启动子之间有两个酶切位点，并在两个酶切位点之间插入一个用于蓝白斑筛选的表达元件，在载体的3’端多克隆位点处插入一个内参报告基因。构建方法包括构建小干扰RNA载体的基本骨架、构建报告基因-Flag表达元件的载体、构建小干扰RNA表达载体、构建小干扰RNA快速筛选的载体步骤。小干扰RNA快速筛选的载体在筛选小干扰RNA中的用途。文档编号C12N15/65GK101633930SQ200910022909公开日2010年1月27日申请日期2009年6月11日优先权日2009年6月11日发明者冯真真,夏海滨,孙晓聪,婧李,王东阳,晔边,郑晓晶申请人:陕西师范大学