专利名称：金磁微粒用于纯化回收琼脂糖凝胶中dna的方法
技术领域：
本发明涉及生物化学和分子生物学领域，具体涉及一种金磁微粒用于纯 化回收琼脂糖凝胶中DNA的方法。
背景技术：
核酸纯化是分子生物学研究的常规技术，从凝胶中回收不同分子量的 DNA目的片段可用于酶切连接、芯片分析、荧光测序或者PCR扩增、标记乃 至显微注射等一系列的操作实验，因此从琼脂糖凝胶中纯化得到高回收率、 高纯度的DNA具有重要意义。
目前，国内外实验室胶回收DNA时主要使用商品化试剂盒或是用自行设 计的方法。
实验室自行设计的方法有透析带电洗脱法，DEAE纤维素膜纸片法，使 用低熔点琼脂糖凝胶，融化后用传统的酚-氯仿抽提，或乙醇沉淀等方法。这 些方法存在的缺点是步骤复杂，且需要用有机溶剂，不能实现高通量自动 化纯化DNA分子。
商品化的试剂盒主要采用离心柱纯化的方法，它通过高离液序列的盐溶 液将胶块溶解后，利用特殊基质的吸附柱将DNA吸附回收，该方法存在的缺 点是需多次离心，不易实现高通量自动化。
目前，开发有商品化琼脂糖凝胶回收试剂盒的公司主要有在国内
TIANGEN公司的基于专一结合DNA的硅基质材料方法，杭州博日科技的离 心柱法，碧云天公司使用离子交换柱法。在国外有日本东洋纺TOYOBO 公司的磁硅珠法，德国Qiagen公司的离心柱法。德国Qiagen公司的离心柱法 试剂盒回收效果好，但其缺点是价格昂贵，限制了其在国内市场的广泛使 用。
金磁微粒是新型的复合粒子，兼有磁性粒子的超顺磁性及金表面生物分
3子固定化的性能，不需共价偶联试剂可将生物分子固定在其表面。金磁微粒 已经在核酸纯化，蛋白纯化，免疫学检测等领域展示出了其应用价值。在国
内尚未见用磁性微粒纯化琼脂糖凝胶中DNA片段的产品。
发明内容
本发明的目的
为了解决背景技术中存在的上述技术问题，本发明提供了一种不需用有 机溶剂萃取，不需离心，步骤简单，易实现高通量自动化纯化，价格低廉的
金磁微粒用于纯化回收琼脂糖凝胶中DNA的方法。
本发明技术方案
金磁微粒用于纯化回收琼脂糖凝胶中DNA的方法，其特殊之处在于包 括以下步骤
(1) 电泳
DNA样品用质量浓度为0.3~2%的琼脂糖凝胶在TAE或TBE缓冲液下电
泳；
(2) 切胶
电泳完成后，在紫外灯下切胶，将含有DNA条带的胶块称重，放入干净 的EP管中；
(3) 溶胶
按照1毫克=1微升换算，量取体积为3倍胶块重量的摩尔浓度为3 5M 的GuSCN加入EP管中，5(TC水浴10分钟，期间上下颠倒数次；
(4) 杂交
水浴完成后，按照1毫克=1微升换算，在EP管中加入体积为4倍胶块 重量的质量浓度为19%~22%的PEG8000，再加入300~800 y g金磁微粒，混 匀，静置2 5分钟；
(5) 清洗
将EP管放入磁性分离架中磁分离，弃上清，得到磁粒，用200-800iU 体积浓度为70%的乙醇清洗2次，空气中放置2 3分钟；(6)洗脱
向EP管加入20~50 u 1 TE缓冲液，5(TC水浴3分钟或在室温下静置5分 钟洗脱，磁分离，所得清液即为回收到的DNA溶液。
上述步骤(3) GuSCN的摩尔浓度为3M;步骤(4) PEG8000的质量浓 度为22%;步骤(5)所用乙醇的量为500tU。
上述步骤(1) DNA样品为酶切产物或PCR产物。
本发明的优点
1、 不需有机溶剂萃取，不需多次离心，步骤简单。
2、 易实现高通量自动化纯化DNA分子，价格低廉。
3、 建立在琼脂糖分子存在下使DNA与金磁微粒很好结合的结合缓冲液。
4、 建立适于金磁微粒的溶胶缓冲液。
图1是使用本方法从琼脂糖凝胶中回收DNA的电泳检测图。 图2是使用本方法从琼脂糖凝胶中回收得到的DNA在Agilent紫外分光 光度仪下检测得到的光吸收谱图。
具体实施例方式
扩增得到1800bp的DNA片段PCR产物用质量浓度为1%普通琼脂糖凝 胶在TAE缓冲液下电泳，紫外灯下切胶，将含有DNA条带的胶块称重，放 入干净的EP管中，尽可能多得去除琼脂糖。按照1毫克=1微升换算，量取 体积为3倍胶块重量的摩尔浓度为3M的GuSCN加入EP管中，5(TC水浴 10分钟，期间上下颠倒数次。水浴完成后在EP管中加入体积为4倍胶块重 量的质量浓度为22%的PEG8000，再加入400 g金磁微粒，混匀静置3分钟。 将EP管放入磁性分离架中磁分离，弃上清，得到磁粒；用500ul70。/。乙醇清 洗2次，空气中放置2分钟，加入30 y 1 TE缓冲液，50。C水浴3分钟洗脱， 磁分离，所得清液即为回收到的DNA溶液。通过电泳对回收结果进行检测，结果如图l，该图为使用本方法从琼脂糖凝胶中回收DNA的电泳检测图，原 样为PCR产物，纯化样1和纯化样2为回收后得到的DNA两个平行实验样。 通过紫外分光光度仪器检测，结果如图2，该图为使用本方法从琼脂糖凝胶中 回收得到的DNA在Agilent紫外分光光度仪下检测得到的光吸收谱图，其中 Ratio为比值，Abs<260> 260nm为紫外光的吸收值，Abs<280> 280nrn为紫 外光的吸收值，由图可知，DNA在260nm处有最大吸收值。
权利要求
1、金磁微粒用于纯化回收琼脂糖凝胶中DNA的方法，其特征在于包括以下步骤(1)电泳DNA样品用质量浓度为0.3～2％的琼脂糖凝胶在TAE或TBE缓冲液下电泳；(2)切胶电泳完成后，在紫外灯下切胶，将含有DNA条带的胶块称重，放入干净的EP管中；(3)溶胶按照1毫克＝1微升换算，量取体积为3倍胶块重量的摩尔浓度为3～5M的GuSCN加入EP管中，50℃水浴10分钟，期间上下颠倒数次；(4)杂交水浴完成后，按照1毫克＝1微升换算，在EP管中加入体积为4倍胶块重量的质量浓度为19％～22％的PEG8000，再加入300～800μg金磁微粒，混匀，静置2～5分钟；(5)清洗将EP管放入磁性分离架中磁分离，弃上清，得到磁粒，用200～800μl体积浓度为70％的乙醇清洗2次，空气中放置2～3分钟；(6)洗脱向EP管加入20～50μl TE缓冲液，50℃水浴3分钟或在室温下静置5分钟洗脱，磁分离，所得清液即为回收到的DNA溶液。
2、 根据权利要求1所述的金磁微粒用于纯化回收琼脂糖凝胶中DNA的方 法，其特征在于所述步骤(3)所用的GuSCN的摩尔浓度为3M;步骤(4) PEG8000的质量浓度为22%;步骤(5)所用乙醇的量为500 u 1。
3、 根据权利要求1或2所述的金磁微粒用于纯化回收琼脂糖凝胶中DNA 的方法，其特征在于步骤(1) DNA样品为酶切产物或PCR产物。
全文摘要
本发明涉及一种金磁微粒用于纯化回收琼脂糖凝胶中DNA的方法，该方法包括电泳、切胶、溶胶、杂交、清洗、洗脱。解决了现有纯化回收琼脂糖凝胶中DNA方法需要用有机溶剂萃取或需多次离心，步骤复杂，不易实现高通量自动化纯化，且价格昂贵的技术问题。该方法不需用有机溶剂萃取，不需离心，步骤简单，易实现高通量自动化，价格低廉。
文档编号C12N15/10GK101597605SQ200910022810
公开日2009年12月9日 申请日期2009年6月4日 优先权日2009年6月4日
发明者崔亚丽, 伟 敖, 赵庆源 申请人:西北大学