专利名称：海水蛭弧菌微生态制剂的制备与应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及
中水质净化和细菌性疾病的防治。
种海水微生态制剂的制备，用于海水养殖过程
背景技术：
20世纪80年代以来，我国海水养殖业发展迅速，不仅养殖品种丰富，而且均具较 高的经济价值。但是一些不利于养殖业持续健康发展的现象也接踵而至，如单一品种的无 序发展，盲目提高养殖密度等均导致水质恶化及养殖病害的暴发。1993年以来对虾、大黄鱼 等养殖品种细菌性疾病的频繁发生，给我国海水养殖业造成了巨大的经济损失，同时养殖 品种的集约化生产方式，在一定程度上更加剧了疾病的流行速度。目前清除养殖过程中出 现的致病菌采用药物疗法，但抗生素的盲目使用、滥用，引发了细菌抗药性、药物残留等一 系列问题。 蛭弧菌(Bdellovibrio)是1962年发现的一类以攻击和裂解其它细菌来完成自 身生长、繁殖的寄生菌。它广泛存在于自然水体、土壤，以及人类与动物的粪便中，能裂解 大多数科、属的革兰氏阴性菌，尤其对水产动物常见致病菌都有良好的裂解活性。蛭弧菌 对污水中的沙门氏菌属的细菌有重要的清除作用。在灭菌的自来水、湖水及模拟自然条件 下的河水中，蛭弧菌对大肠杆菌、沙门氏菌、痢疾杆菌、霍乱弧菌等清除效率达90%以上，甚 至100%。所以蛭弧菌在水质净化和细菌性疾病的生物防治方面被认为有着良好的应用前 景。目前虽然国内外已有一些关于蛭弧菌制剂产品，但它们基本来源于淡水，并不适合海水 养殖过程，而且效价方面也有待进一步提高。 海水蛭弧菌制剂可改良海水养殖池的微生态环境，抑制弧菌等致病菌的繁殖，减 少或避免化学消毒剂引起的水环境生态平衡的破坏，以及滥用抗生素引起的细菌抗药性、 药物残留问题，提高育苗的存活率，使用更加安全。它作为一种"活性抗生素"有着广阔的 发展空间。
发明内容
本发明的目的在于提供一种适合于海水养殖用的蛭弧菌制剂的制备及应用方法。
本发明的技术方案由以下步骤组成制备宿主菌悬液；蛭弧菌的分离、纯化；蛭弧 菌增殖培养，其特征是将非致病性施氏假单胞菌接斜面活化后，在试管中加入2ml左右的 生理盐水制得菌悬液，然后用营养肉汤增殖培养18-24h，在所得菌液中加入絮凝剂，摇匀后 静置2-5h，收集沉淀，加入生理盐水即得到1012cfu/mL的宿主菌悬液；采用双层琼脂平板法 对采集的海水和底泥样品进行蛭弧菌的分离和纯化，将含有宿主菌悬液和采集样品的培养 基混匀后倒入预先制备的下层海水琼脂上培养6 7天，在含宿主菌的双层平板出现噬菌 斑，根据噬菌斑的大小形态、清晰度和色素对分离得到的噬菌斑进行分类，采用单斑传代， 挑取不断扩大的单斑重复三次以上，至形成形状、大小、透明度均一致的噬菌斑为止，即得 蛭弧菌纯菌株；将宿主菌和分离得到的蛭弧菌加入到灭菌天然海水中，用灭菌纱布封口 ，摇
3床培养一周，至蛭弧菌浓度为108 1(fpfu/mL，备用。将蛭弧菌浓縮液与牛奶蔗糖稳定剂 混合，混合比例为1 : 5，置于_40"条件下预冻3小时，然后在2 7mTorr真空度条件下 进行冷冻干燥18 24h，即获得蛭弧菌冻干制剂。在海水养殖水体中加入蛭弧菌制剂应用 浓度范围为10 104pfu/mL。 本发明具有在不同生境下再殖能力较强特点，保证了蛭弧菌的裂解活性，能较好 地裂解绝大多数水产致病菌，提高了水产病害防治效果。所采用的宿主菌——施氏假单胞 菌为非致病菌，避免了环境污染，使用起来更加安全。在海水养殖水体中加入蛭弧菌制剂 应用浓度范围为10 104pfu/mL不仅可以净化水质，在养殖过程中还可起到病害防治的作 用。养殖水体添加蛭弧菌后细菌增长受到抑制，细菌总数和弧菌数均降低了 1 2个数量 级。在锯缘青蟹育苗过程中添加蛭弧菌，不仅水质得到净化，各期幼体的变态率和成活率也 明显提高。
具体实施方式
实施例一 海水蛭弧菌的分离、纯化及其浓縮液的制备
1、宿主菌悬液的制备 将施氏假单胞菌(中国科学院微生物所提供)接斜面活化、培养18 24h，在试 管中加入2ml左右的生理盐水制得菌悬液，再接到营养肉汤培养基中，3(TC下用摇床液体 培养18 24h。在所得菌液中加入1%的低聚壳聚糖作为絮凝剂，以150r/min速度搅拌均 匀，然后采用多层聚酯高效过滤袋过滤，收集沉淀。最后加入生理盐水即得到10 fu/mL的 宿主菌悬液，可在fC下可保存10d。
2、蛭弧菌的分离、纯化 采用双层琼脂平板法对采集的海水、底泥样品进行蛭弧菌的分离和纯化，方法是 取5mL上层培养基灭菌后45t:保温，加入200 y L的宿主菌悬液和500 y L的样品液，混匀 后倾注于预先制备的下层海水琼脂上，凝固后2『C倒置培养，连续观察6 7d。根据噬菌 斑的大小形态、清晰度和色素对分离得到的噬菌斑进行分类，采用单斑传代，将噬菌斑从平 板上挖出置入装有1/10YP浸出液的试管中温浴8h，然后用浸出液再倒双层平板培养，至少 重复三次，直到平板上出现大小、形态、透明度一致的噬菌斑为止，将得到的蛭弧菌纯菌株 Bdh5221样品置于4。C保藏。
3、蛭弧菌增殖培养 分离所得蛭弧菌的液体增殖是在装有95mL的灭菌天然海水的锥形瓶中加入 0. 2mL施氏假单胞菌菌悬液和5mL蛭弧菌浸出液混匀，用八层灭菌纱布封口，于28°C、 pH 7. 4 7. 6、110r/min转速下摇床培养，连续观察一周，至浓度为108 109pfu/mL的蛭弧菌 浓縮液待用。蛭弧菌计数采用双层琼脂平板上噬菌斑计数法。
实施过程中所涉及的培养基配方如下 宿主培养基宿主培养用培养基为营养肉汤培养基，即牛肉膏3g，蛋白胨10g，氯 化钠15g，蒸馏水或天然海水1000ml (盐度为30%。左右)，121。C灭菌30min。
营养琼脂培养基牛肉膏粉3g，蛋白胨10g，氯化钠5g，琼脂粉14g，蒸馏水或天然 海水1000ml (盐度为30左右)，121。C灭菌30min。
4
双层培养基蛭弧菌筛选、分离和纯化用培养基均为双层琼脂，下层为1. 0%琼脂 的海水琼脂，上层用0. 5%琼脂的天然海水琼脂，12rC灭菌30min。 浸出液S卩1/10YP浸出液，为酵母膏0. 03g，蛋白胨0. 006g，天然陈海水1000ml，
12rC灭菌30min，用于将蛭弧菌从双层平板中浸出。 实施例二 海水蛭弧菌的保存 将蛭弧菌浓縮液与牛奶蔗糖稳定剂按1 : 5的比例混合均匀，得到待冻干的混合 液。牛奶蔗糖稳定剂组成5%蔗糖+10%脱脂奶粉+85%去离子水。稳定剂需经过高压灭 菌处理，无菌检查合格后备用。 将上述混合液分装，在_401:条件下先预冻3小时，然后用冻干机于_80°C、2 7mTorr真空度条件下对其进行冷冻干燥18 24h，即获得蛭弧菌冻干制剂。
实施例三 蛭弧菌在净化海水养殖池水中的应用 为研究蛭弧菌在净化海水养殖池水中的应用，本发明用蛭弧菌Bdh5221对南美 白对虾养殖池水进行了处理。试验容器为125mL的水族箱，水温25t:，试验用水为未处 理过的对虾养殖池水，每个水族箱内投放南美白对虾IO尾，蛭弧菌的添加浓度分别为 1. 5 X 10丄pfu/mL (试验组一 )、1. 5 X 102pfu/mL (试验组二 ) 、 1. 5 X 103pfu/mL (试验组三)， 并设置不添加蛭弧菌Bdh5221的对照组，采用24h曝气，连续培养一周。实验期间记录细菌 总菌、弧菌数和蛭弧菌数，并不时观察对虾成活情况，结果见表1。
表1.蛭弧菌处理后对虾养殖池水中微生物数量的检测结果
细菌总数对照组3,6xl06l,4x:106l.lx:1069.9 :IO51.1>:IO5
(cfu /mL)试验组一3.6x:1067,65:<1051.5>2.5>(1048.75:xlO3
试验组二3.6x1067.05:<1051,7>2.9>-1049.0 :103
试验组三3.6x1067,25:<1051.1>-1052,45:xlO48.6x:IO3
弧菌数对照组2,39:<1051.25:<1059.5>7,5>:1046.75:xlO4
(cfu /mL )试验组一2.39:<1056,35-<1043.1>-1045》:IO35.4》:102
试验组二2.39:<1057.6x1042.85xlO46.5>:IO3:102
试验组三2,39:<1057,3xIO41.2xl045》:1035》:102
蛭弧菌数对照组2.3〉<107.6:XlO9.9: 108.7:<10
(pfu/mL)试验组一1.5x1.38:xlO21.3>3》2.6>:IO3
试验组二1.5x:1026.0:1021.6xl032.0>3.0>
试验组三l》:IO33,4》:1021.2><1033.0〉<1042,2>⑨3 从表1可看出，各试验组的细菌总数和弧菌数与对照组相比均显著下降，而且相 差近1 2个数量级，蛭弧菌的数量上升也较为明显，即使是最低的蛭弧菌接种浓度也能达 到较好的增殖生长效果，说明该蛭弧菌具有较强的再殖能力。从有效性和池塘应用的经济 成本考虑，选择添加1. 5X 1(^pfu/mL海水蛭弧菌株即可。就对4下成活率而言，与对照组没 有差别。上述结果不仅说明了本海水菌株Bdh5221的安全性，也证实了将蛭弧菌应用于净 化海水养殖池水是可行的。
实施例四 蛭弧菌在锯缘青蟹种苗培育中的应用 首先进行了蛭弧菌Bdh5221对锯缘青蟹潘状幼体的安全性试验，在添加蛭弧菌浓 度为2. OX 101、2. OX 102、2. OX 103、2. OX 104pfu/mL后，观察锯缘青蟹各个时期的成活率 和变态率与对照组相差不大，未出现明显下降，甚至部分试验组的更高，表明海水蛭弧菌 Bdh5221可以进一步应用于锯缘青蟹种苗培育。 培育实验容器为0. 5m3黑色玻璃钢水槽，每个水槽放置两个充气石；水槽内青蟹潘 状I期幼体的放养量均为3. 5万个；育苗用水经5X10—e次氯酸钠消毒处理12h后，用硫代硫酸钠除去余氯的沙滤海水，盐度30%。，培育水温27. 5 30. 5t:，光照度1000 100001ux。 设试验组和对照组，试验组在幼体放入后及每次蟹苗变态前添加蛭弧菌Bdh5221，使培育水 中的蛭弧菌数量达到2. 5X 1(^pfu/mL，对照组俺常规育苗方法在幼体放入后及每次蟹苗变 态前添加抗生素(恩诺沙星、氟苯尼考等，添加浓度为1.5X10—6)。试验期间检测指标包括 细菌总数、弧菌数量、蛭弧菌数量、pH、 N02-N、 N03-N、 NH4-N、 COD等。并在蟹苗变态当天夜间 用容量法取样技术，测算蟹苗变态、成活率。其结果如下 表2.蛭弧菌应用于锯缘青蟹育苗期间微生物数量及水质指标检测结果
蟹苗发育天数(d) 1 5 9 11 13 15
细菌总数对照组3.0X1041.9X1067.3 X1071.2 X1089.6 XIO72.6 X 108
(cfu/L)试验组3.0 X1044.1 X1056.3 X1076.0 X1065.6 XIO68.5 XIO6
弧菌数对照组2.2 X1024.0 X1039.1 X1051.1 xio75.39 X 10s1.6X107
(cfu/L)试验组2.2 X1023.5X1034.9 X1055.0X1055.3 XIO56.5 XIO5
蛭弧菌数对照组—9.2 X101i.oxio28.2X10'1.3 XIO20.8 XIO2
(pfo/L)试验组2.5 X1012.2X1037.0 X1039,6 XIO33.0X1041.2X104
对照组8.298.008.058.107.287.84
pH
试验组8.297.978,068.107.287.84
NOrN对照组0.0000390.00220.01100.01980.01780.0185
(mg/L)试验组0.0000390.00220.00970.01590.01470,0181
NOrN对照组0,002110.00210,04790.03320.04430,0345
(mg/L)试验组0.002110.02080.03200.03360.03320.0208
NH4-N对照组0.00840.30921.86672.4292.7713.024
(mg/L)试验组0細40.30791.74022.1852.6632.681
COD对照组5.2115.1044.71742.8433.6152.873
(mg-CVL)试验组5,2115.1414,72162,8703.6892.822 从表2结果可以看出，添加蛭弧菌Bdh5221试验组的弧菌数在青蟹潘状幼体进入 V阶段后基本维持在一个水平不再上升，比对照组降低了 1 2个数量级，细菌总数的消长 表现出了与弧菌数量同样的变化趋势。另外水质检测结果显示，试验组和对照组的N02-N、 NOfN、NH厂N含量在育苗初期相差不大，都处于较低水平，但是随着时间推移，试验组三者的 含量明显要比对照组上升慢，尤其是NH4-N检测值比对照组低0. 11 0. 34mg/L。可见海水 蛭弧菌Bdh5221不仅对养殖水体中弧菌数有抑制作用，而且还能使整个水体的水质有所改
8善。 表3.锯缘青蟹幼体各期成活、变态率的比较
成活率0/。 变态率％
对照组 试验组 对照组 试验组
潘状I期訓100一一
潘状II期61,464,360.563.8
潘状III期42.947.239.645.8
潘状rv期38.147.636.245.5
潘状v期18.325.110.413.6
大眼幼体3.29,82.99.2 表3结果可看出，试验组在幼体各期的存活、变态率与对照组存在明显的差异，均 高于对照组。海水蛭弧菌Bdh5221的加入，使水体微生态环境得到调节、保持平衡，到大眼 幼体的存活率和变态率分别比对照组提高了 6. 6%、6. 3%。
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权利要求
海水蛭弧菌微生态制剂的制备与应用，由以下步骤组成制备宿主菌悬液；蛭弧菌的分离、纯化；蛭弧菌增殖培养，其特征是将非致病性施氏假单胞菌接斜面活化后，在试管中加入2ml左右的生理盐水制得菌悬液，然后用营养肉汤增殖培养18-24h，在所得菌液中加入絮凝剂，摇匀后静置2-5h，收集沉淀，加入生理盐水即得到1012cfu/mL的宿主菌悬液；采用双层琼脂平板法对采集的海水和底泥样品进行蛭弧菌的分离和纯化，将含有宿主菌悬液和采集样品的培养基混匀后倒入预先制备的下层海水琼脂上培养6～7天，在含宿主菌的双层平板出现噬菌斑，根据噬菌斑的大小形态、清晰度和色素对分离得到的噬菌斑进行分类，采用单斑传代，挑取不断扩大的单斑重复三次以上，至形成形状、大小、透明度均一致的噬菌斑为止，所得即蛭弧菌纯菌株；将宿主菌和分离得到的蛭弧菌加入到灭菌天然海水中，用灭菌纱布封口，摇床培养一周，至蛭弧菌浓度为108～109pfu/mL。
2. 根据权利要求1所述的海水蛭弧菌微生态制剂的制备与应用，其特征是絮凝剂为低 聚壳聚糖，用量为1%。
3. 根据权利要求1所述的海水蛭弧菌微生态制剂的制备与应用，其特征是分离和纯 化采用的双层琼脂下层为1. 0%琼脂的海水琼脂，上层用0. 5%琼脂的天然海水琼脂，盐度 30%。左右，121。C灭菌30min。
4. 根据权利要求1所述的海水蛭弧菌微生态制剂的制备与应用，其特征是将蛭弧菌浓 縮液与牛奶蔗糖稳定剂按l : 5的比例混合均匀，得到待冻干的混合液；牛奶蔗糖稳定剂组 成5%蔗糖+10%脱脂奶粉+85%去离子水。
5. 根据权利要求4所述的海水蛭弧菌微生态制剂的制备与应用，其特征是将蛭弧菌浓 縮液与牛奶蔗糖稳定剂混合后待冻干的混合液置于_401:条件下预冻3小时，然后在冻干 机于-80°C、2 7mTorr真空度条件下进行冷冻干燥18 24h，即获得蛭弧菌冻干制剂。
6. 根据权利要求1或2或3或4或5所述的海水蛭弧菌微生态制剂的制备与应用，其 特征是在海水养殖水体中加入蛭弧菌的应用浓度范围为10 104pfu/mL。
全文摘要
海水蛭弧菌微生态制剂的制备与应用，涉及一种海水微生态制剂，需要提供适合于海水养殖用的蛭弧菌制剂的制备方法。本发明由以下步骤组成制备宿主菌悬液；蛭弧菌的分离、纯化；蛭弧菌增殖培养，其特征是将施氏假单胞菌接斜面活化后，在试管中加入生理盐水制得菌悬液，然后用营养肉汤增殖培养，在所得菌液中加入絮凝剂，摇匀后静置沉淀，加入生理盐水得到1012cfu/mL的宿主菌悬液；用双层琼脂平板法对采集的海水和底泥样品进行蛭弧菌的分离和纯化，将含有宿主菌悬液和采集样品的培养基混匀后倒入下层海水琼脂上培养，将宿主菌和分离得到的蛭弧菌加入到灭菌天然海水中培养至蛭弧菌浓度为108～109pfu/mL，备用。
文档编号C12N1/20GK101781627SQ20091004551
公开日2010年7月21日 申请日期2009年1月19日 优先权日2009年1月19日
发明者周帅, 房文红, 胡琳琳, 谢群英 申请人:中国水产科学研究院东海水产研究所