专利名称：重组人淀粉样多肽Aβ42的简易可溶性表达纯化方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及疏水性多肽的可溶性表达和纯化等技术，具体涉及重组人淀粉样多肽A β 42的可溶性表达、纯化及鉴定等技术。
背景技术：
阿兹海默病(Alzheimer' s disease，简称AD)又称老人痴呆症，全世界有2400万 病患，是一种持续性神经功能障碍。最显著的早期症状为健忘，通常表现为逐渐增加的短期 记忆缺失，而长期记忆则相对不受病情的影响。随着病情的加重，病人的语言能力，空间辨 别能力，认知能力会逐步衰退。随着人们生活水平的不断提高，社会趋于老龄化，阿尔茨海 默氏已成为重要的死亡原因。疾病的成因未明，目前没有准确诊断和有效治疗的方法。目 前，该疾病的病因和治疗方法已成为世界范围内研究人员关注的焦点。老年痴呆症的致病机理目前尚不完全清楚，但普遍接受的观点是，它与蛋白质错 误折叠而导致的淀粉样蛋白聚集沉淀密切相关。1984年Glermer首先从AD患者脑脊液中 成功分离出相对分子量约为4. 2kD的淀粉样多肽，并测定了其序列，由于其结构中含大量 β-sheet片层，故称其为β-淀粉样多肽(i3-amyloid，Ai3)。老年痴呆症的主要特征在病 理学上显示出脑组织萎缩、大脑皮质出现老年斑等现象。研究发现老年斑是A β淀粉样蛋 白的沉积所造成。早期的研究认为，根据Αβ淀粉样蛋白的形成机制及影响因素，设计方案 防止淀粉样蛋白沉积，并清除已形成的斑块，就可以达到预防和治疗老年痴呆症，然而，最 近的老年斑清除药物的临床实验数据表明，老年斑的清除并没有明显改善病症、延长寿命 真正对神经细胞起损伤作用的是寡聚的Aβ蛋白。Αβ多肽来源于β-淀粉样蛋白前体蛋白(β-amyloid precursor protein, APP)，APP经β-及Y-分泌酶酶切生成的一种小肽。该小肽包含39-43个氨基酸残基，具 有很强的疏水性，由42个残基组成的A β 42被认为是最容易折叠的，因此A β 42也被认为 是产生老年斑的主要因素。当Αβ 42发生聚集时，寡聚体和聚集体可能会引起蛋白质和脂 质等生物大分子的氧化，最终引发神经元的凋亡。因此，Αβ42多肽成为老年痴呆症致病机 理和相应治疗药物开发等研究的焦点。现在，有许多基于抗氧化性和清除金属离子来抑制A β蛋白聚集的方法来开发新 药物的，但是这些药物是否对改善症状有效还不得而知。有些天然药物，长期以来一直作为 中医治疗老年痴呆症的必需配药，如姜黄素、儿茶酚等。有资料报道，印度人老年痴呆症发 病率较其他地区偏低，可能与他们长期以姜黄为食用佐料有关。这类天然药物有效成分多 为具有共轭烯酮或酚酮结构的分子，有较强对金属离子的络合能力。人们以Αβ蛋白作为 研究对象来探索可能的致病因素、寻找可能的药物，所以有关Αβ的研究首先需要获得高 纯度A β多肽。由于A β 42多肽C末端33-42位氨基酸残基具有很高的疏水性，直接溶解于水溶 液的Αβ42多肽溶解后容易发生聚集，形成不可溶性的沉淀物，这给其合成与纯化造成了 困难。目前，研究及临床中应用的高纯度Aβ通常是采用化学合成的和基因重组生物合成两种，但是化学合成方法产率较低、成本昂贵，基因重组表达的方法则难以可溶性表达目标蛋白、效率较低。
发明内容
本发明的目的在于提供一种重组人淀粉样多肽Αβ42的可溶性表达方法。本发明提供了一种重组人淀粉样多肽Αβ 42的简易可溶性表达纯化方法，包括重 组载体构建、转化与筛选、表达与纯化，步骤如下(1)将6His-SUMO_Ai3 42融合基因的核苷酸编码序列插入表达载体的多克隆位 点，获得重组表达载体质粒；(2)将(1)获得的重组表达载体质粒转入大肠杆菌表达菌株，得到能与分子伴侣 共表达的A β 42原核表达菌株；(3)诱导SUMO-Αβ 42融合蛋白和分子伴侣的表达，过柱纯化。本发明中，6His-SUMO-A β 42融合基因可以通过化学合成方法获得，即跟据其编码 序列，用人工合成方法获得。例如根据SEQ ID NO 3的序列，将核苷酸分子逐个连接，获得 序列如SEQ ID NO 3的DNA分子。6个组氨酸残基(His)可以简化SUMO-A β 42融合蛋白的纯化，有利于目标多肽 A β 42的提纯。SUMO即酵母小分子泛素相关修饰蛋白。由于SUMO蛋白具有帮助目标蛋白可溶性 表达的功能，所以，利用该表达载体可以实现疏水性多肽和蛋白质的可溶性表达，可以用于 难以化学合成的多肽和蛋白质的基因重组合成，也可用于具有生物活性、以天然构象存在 的基因工程多肽和蛋白质药物的生产。此外，SUMO融合蛋白经酶切后可以得到不多含一个 氨基酸的目的多肽，可以避免传统的用GST融合蛋白加Thrombin酶切位点无法得到不多含 一个氨基酸的目的多肽的缺点。本发明中，所述的表达载体是pET21b。也可以采用类似的大肠杆菌表达载体。本发明中，所述的表达菌株是E coli.BL21(DE3)-groES-groEL-tig。本发明中，所述的分子伴侣是groES-groEL-tig。分子伴侣技术是提高目标蛋白可 溶性表达的常用手段。本方法中，我们选用groES-groEL-tig(Tf2)这一分子伴侣系统，大 大的提高了 SUMO-A β 42融合蛋白的可溶性表达量。本发明使用异丙基-β-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导表达。本发明中，所述的过柱纯化分为两步细胞破碎后先过亲和层析柱进行纯化，然后 再用Superdex 200分子筛柱进一步纯化并得到目的多肽A β 42。本发明中，可以将所得的重组人淀粉样多肽Αβ 42通过Tricine-SDS-PAGE电泳或 者MALDI-T0F-T0F(基质辅助激光解吸电离串联飞行时间质谱)方法进行鉴定。本发明还提供了一种重组人淀粉样多肽Αβ42的表达载体，该表达载体是将 6His-SUMO-A β 42融合基因的核苷酸编码序列插入表达载体pET21b的多克隆位点获得的， 称为pET21b-SUM0/A3 42。其结构示意图如图1所示。具体而言，本发明重组人淀粉样多肽Αβ42的可溶性表达及纯化，包括可溶 性表达载体的构建，分子伴侣协助可溶表达，SUMO-Ai342融合蛋白的原核表达及纯化， SUMO-Aβ 42融合蛋白的酶切，Aβ 42多肽的纯化和鉴定。分别说明如下
步骤一可溶性表达载体的构建(1)首先化学合成6His-SUMO_Ai3 42融合基因。
序列如下ATGCACCATCATCATCATCATATGTCGGACTCAGAAGTCAATCAAGAAGCTAAGCCAGAGGTCAAGCCA GAAGTCAAGCCTGAGACTCACATCAATTTAAAGGTGTCCGATGGATCTTCAGAGATCTTCTTCAAGATCAAAAAGAC CACTCCTTTAAGAAGGCTGATGGAAGCGTTCGCTAAAAGACAGGGTAAGGAAATGGACTCCTTAAGATTCTTGTACG ACGGTATTAGAATTCAAGCTGATCAGACCCCTGAAGATTTGGACATGGAGGATAACGATATTATTGAGGCTCACAGA GAACAGATTGGTGGCGATGCGGAATTTCGCCATGATTCTGGCTATGAAGTGCATCATCAGAAACTGGTGTTTTTTGC GGAAGATGTGGGCTCTAACAAAGGCGCGATTATTGGCCTGATGGTGGGCGGCGTGGTGATAGCATGA(SEQID NO 3)(2)引物设计及PCR:根据合成的DNA序列设计引物，把所合成基因克隆到 β ET21b表达载体上，酶切位点选择NdeI和SacI，引物序列如下正向弓I 物 SUMO/Αβ 42-F(NdeI) :TTCCATATGCACCATCATCATCATCAAT (SEQ ID NO 1)；反向引物SUMO/A β 42-R (SacI) TACGAGCTCTCATGCTATCACCACGCCGC (SEQ IDNO 2)。以化学合成的DNA为模板进行PCR扩增，产物片断长度约为440bp。PCR产物经琼 脂糖凝胶电泳后，胶纯化回收PCR产物。回收的目的片段和pET21b载体分别用NdeI和SacI 双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，胶纯化回收酶切产物进行连接反应，连接产物转化ToplO感 受态细胞，冰浴30min，42 °C，lmin,冰浴2min，加入400 μ 1 LB液体培养基，250rpm, 37 °C 培养lh，涂布Amp抗性的LB平板，37°C培养过夜，挑取单菌落到5mL的LB液体培养基中， 250rpm，37°C过夜培养。PCR鉴定阳性克隆后进行测序。测序鉴定正确的pET21b_SUM0阳性 克隆抽提质粒备用。(3) A β 42原核表达菌株的获得将测序鉴定正确的pET21b-SUM0/A β 42阳性克隆 抽提质粒，将此重组质粒转入表达菌株E coli. BL21 (DE3)-groES-groEL-tig中，得到能与 分子伴侣groES-groEL-tig(Tf2)共表达的A β 42原核表达菌株BL21 (DE3) -Tf2/Α β 42
步骤二 SUMO-A β 42融合蛋白的原核表达及纯化(4) SUMO-A β 42融合蛋白的原核表达采用异丙基_ β _硫代半乳糖苷(IPTG)诱 导融合蛋白的表达，同时，与分子伴侣groES-groEL-tig(Tf2)的共表达可以显著增加融合 蛋白的可溶性表达量，低温诱导过夜，将大肠杆菌的培养液离心收菌，得到含SUMO-A β 42 融合蛋白的大肠杆菌菌体；(5) SUMO-Aβ 42融合蛋白的纯化将所得大肠杆菌菌体重悬于缓冲溶液中，冰浴 中超声破菌，收集上清液；将上清液过Ni-NTA(Qiagen)亲和层析柱，用缓冲溶液充分洗涤 柱子后，再用含IOmM咪唑的Buffer A洗2个柱体积，随后加入一种SUMO特异性蛋白酶 YULPl酶，进行柱上酶切过夜，第二天用缓冲溶液进行洗脱，收集洗脱液，即得到初步纯化的 A β 42多肽；(6) A β 42多肽的分子筛柱纯化将经Ni-NTA柱纯化得到的A β 42蛋白经 Superdex200柱进行进一步的纯化，最后得到纯度约为超过90% Aβ 42多肽。步骤三Α β 42多肽的鉴定(7)Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定每步纯化得到的Aβ 42多肽都进行三层胶电泳 以确定纯度及分子量，电泳结果显示A β 42多肽的分子量在5kDa附近；
(8)MALDI-T0F-T0F鉴定从电泳胶上把对应的A β 42多肽条带切割下来进行质谱分析，鉴定结果表明我们所得到的目的产物确实为A β 42多肽；上述使用的试剂未特别注明来源的，均由市售获得。操作步骤未及详述的，均根据 冷泉港实验室手册——如《分子克隆》、《抗体》和《细胞》进行操作。本发明提供了能原核表达人淀粉样多肽Αβ 42的原核表达质粒的构建方法，并将 可溶性表达载体导入大肠杆菌表达系统，经诱导表达、酶切及纯化后得到有生物活性的目 标Αβ 42多肽。本方法的大肠杆菌表达系统，具有表达效率高，表达量大，易于操作，成本较 低等特点，所表达的Αβ 42多肽纯化步骤简单、产率高等优点。该Αβ 42多肽可用于老年痴 呆症致病机理和相应药物开发的研究中。本发明的意义在于实现了疏水性Αβ42多肽的可溶性表达，并且A β 42多肽的纯 化步骤简单、生产效率高、成本低廉，为AD疾病致病机理和相应药物开发的研究提供了很 好的基础，对AD病疫苗治疗和药物筛选的研究起到了促进作用。
图lpET21b_SUM0/A3 42质粒构建框架图。
具体实施例方式实施例1 :pET21b_SUM0/A β 42 质粒构建(1)首先化学合成6His-SUM0-A3 42融合基因。(2)引物设计及PCR 根据合成的DNA序列设计引物，把所合成基因克隆到PET21B 表达载体上，酶切位点选择NdeI和SacI，引物序列如下正向引物SUMO/Αβ 42-F(NdeI) TTCCATATGCACCATCATCATCATCAAT (SEQ ID N01)； 反向引物 SUMO/Αβ 42-R(SacI) TACGAGCTCTCATGCTATCACCACGCCGC(SEQ ID N02)。以化学合成的DNA为模板进行PCR扩增，产物片断长度约为440bp。PCR产物经琼 脂糖凝胶电泳后，胶纯化回收PCR产物。回收的目的片段和pET21b载体分别用NdeI和SacI 双酶切，经琼脂糖凝胶电泳后，胶纯化回收酶切产物进行连接反应，连接产物转化ToplO感 受态细胞，冰浴30min，42°C，lmin，冰浴2min，加入400 μ 1 LB液体培养基，250rpm，37 °C 培养lh，涂布Amp抗性的LB平板，37°C培养过夜，挑取单菌落到5mL的LB液体培养基中， 250rpm，37°C过夜培养。PCR鉴定阳性克隆后进行测序。经测序确认重组表达质粒构建正确 后，将构建好的重组质粒转导入DH5 α菌株扩增保种，然后提取质粒pET21b-SUM0/A β 42备 用。(3) A β 42的原核表达菌株的获得首先将含分子伴侣groES-groEL-tig 的质粒(pG-Tf2)转入E. coli BL21(DE3)菌株，得到表达菌株E coli. BL21 (DE3)-groES-groEL-tig (Tf2)，然后将构建好的重组质粒 pET21b_SUM0/A β 42 转导入 表达菌株E co 1 i. BL21 (DE3) -groES-groEL-t i g (Tf 2)中，即得到A β 42的原核表达菌株 pET2Ib-SUMO(pG-Tf2)/Aβ 42/BL21。实施例2 SUMO-A β 42融合蛋白的原核表达和纯化。(4)目标融合蛋白的表达首先进行预表达来优化表达条件(包括分子伴侣的选 用、表达温度、诱导条件、表达时间)，尽量增加可溶性目标融合蛋白的表达量，然后根据最优表达条件来大量表达目标融合蛋白。大量表达时采用的过程为将已构建好的A β 42和分子伴侣 groES-groEL-tig(Tf2)的原核表达菌株 pET21b_SUM0 (pG_Tf2)/A β 42/BL21 分别 于37°C培养，新鲜菌按1 100接种，振摇培养至0D600为0.8-1.0，将培养箱温度降低至 16°C，然后加入ImM的IPTG诱导，过夜(15h)表达，最后，3500rpm离心lh，收集菌体。(5) SUMO-A β 42融合蛋白的纯化将所得大肠杆菌菌体重悬于缓冲溶液(Buffer A =IOmM pH7. 2, Tris-HCl, 300mM NaCl,5% Glycerol)中，冰浴中超声破菌，收集上清液；将 上清液过Ni-NTA(Qiagen)亲和层析柱，用Buffer A充分洗涤柱子后，再用含IOmM咪唑的 BufferA洗2个柱体积，随后按约1 500的比例加入一种SUMO特异性蛋白酶YULPl酶， 4°C下进行柱上酶切过夜，第二天用含5mM咪唑的Buffer A进行洗脱，收集洗脱液，即得到 纯度约85%的Αβ 42蛋白；(6) A β 42多肽的分子筛柱纯化将经Ni-NTA柱纯化得到的A β 42蛋白经 Superdex200柱进行进一步的纯化，该步纯化中用IOmM pH7. 2Tris-HCl, 300mMNaCl做为纯 化buffer进行纯化，最后得到纯度约为超过90% Αβ42多肽。实施例3 :Α β 42多肽的鉴定(A)Tricine-SDS-PAGE电泳鉴定将酶切后的蛋白溶液和提纯的Αβ 42多肽进行 Tricine-SDS-PAGE电泳，结果显示酶切基本完全，A β 42多肽的分子量在3. 5-6. 5kDa之间。(B)MALDI-TOF-TOF 将纯的A β 42多肽进行氨基酸序列测定，证实其序列与人淀 粉样多肽A β 42 —致。实施例4Α β 42多肽的聚集实验已知荧光物质硫磺素(ThT)能与淀粉样的β -sheet结构特异性结合而显著增强 ThT的荧光强度，取30 μ M纯的A β 42多肽溶于Buffer A缓冲溶液中，取两个样本分别置 于-20、37°C孵育7天，然后各组取20 μ 1孵育液和180 μ 1用BufferA配置的ThT溶液，震 动混合均勻后，在激发波长445nm、发射波长486nm条件下测量荧光强度.结果显示纯化得到的A β 42多肽在37°C下形成聚集体。从另一个角度说明本发 明得到的A β 42多肽与人淀粉样多肽A β 42 —致。序列表<210>1<211>28<212>DNA<213>Artificial<400>1ttccatatgc accatcatca tcatcaat28<210>2<211>29<212>DNA<213>Artificial<400>2tacgagctct catgctatca ccacgccgc29<210>3
<211>444
<212>DNA
<213>Artificial
〈400>3
atgcaccatcatcatcatcatatgtcggactcagaagtca atcaagaagctaagccagag60
gtcaagccagaagtcaagcctgagactcacatcaatttaa aggtgtccgatggatcttca120
gagatcttcttcaagatcaaaaagaccactcctttaagaa ggctgatggaagcgttcgct180
aaaagacagggtaaggaaatggactccttaagattcttgt acgacggtattagaattcaa240
gctgatcagacccctgaagatttggacatggaggataacg atattattgaggctcacaga300
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aaactggtgttttttgcggaagatgtgggctctaacaaag gcgcgattattggcctgatg420
gtgggcggcgtggtgatagcatga44权利要求
一种重组人淀粉样多肽Aβ42的简易可溶性表达纯化方法，包括重组载体构建、转化与筛选、表达与纯化，其特征在于，该方法包括如下步骤(1)将6His SUMO Aβ42融合基因的核苷酸编码序列插入表达载体的多克隆位点，获得重组表达载体质粒；(2)将(1)获得的重组表达载体质粒转入大肠杆菌表达菌株，得到能与分子伴侣共表达的Aβ42原核表达菌株；(3)诱导SUMO Aβ42融合蛋白和分子伴侣的表达，过柱纯化。
2.如权利要求1所述的重组人淀粉样多肽Aβ 42的简易可溶性表达纯化方法，其特征 在于，6His-SUMO-Aβ 42融合基因是通过化学合成方法获得。
3.如权利要求1所述的重组人淀粉样多肽Aβ 42的简易可溶性表达纯化方法，其特征 在于，所述的表达载体是pET21b。
4.如权利要求1所述的重组人淀粉样多肽Aβ 42的简易可溶性表达纯化方法，其特征 在于，所述的大肠杆菌表达菌株是E coli.BL21(DE3)-groES-groEL-tig。
5.如权利要求1所述的重组人淀粉样多肽Aβ 42的简易可溶性表达纯化方法，其特征 在于，所述的分子伴侣是groES-groEL-tig。
6.如权利要求1所述的重组人淀粉样多肽Aβ 42的简易可溶性表达纯化方法，其特征 在于，使用异丙基_ β _硫代半乳糖苷进行诱导表达。
7.如权利要求1所述的重组人淀粉样多肽Αβ42的简易可溶性表达纯化方法，其 特征在于，所述的过柱纯化分为两步细胞破碎后先过亲和层析柱进行纯化，然后再用 Superdex 200分子筛柱进一步纯化并得到目的多肽A β 42。
8.—种重组人淀粉样多肽Αβ 42的表达载体，其特征在于，该表达载体是将 6His-SUMO-A β 42融合基因的核苷酸编码序列插入表达载体pET21b的多克隆位点获得的。
全文摘要
本发明属于生物技术领域，提供了一种重组人淀粉样多肽Aβ42的简易可溶性表达纯化方法，包括重组载体构建、转化与筛选、表达与纯化。具体步骤如下(1)将6His-SUMO-Aβ42融合基因的核苷酸编码序列插入表达载体的多克隆位点，获得重组表达载体质粒；(2)将(1)获得的重组表达载体质粒转入大肠杆菌表达菌株，得到能与分子伴侣共表达的Aβ42原核表达菌株；(3)诱导SUMO-Aβ42融合蛋白和分子伴侣的表达，过柱纯化。本发明实现了疏水性Aβ42多肽的可溶性表达，并且纯化步骤简单、生产效率高、成本低廉，为AD疾病致病机理和相应药物开发的研究提供了很好的基础。
文档编号C12N15/70GK101967492SQ200910055489
公开日2011年2月9日 申请日期2009年7月28日 优先权日2009年7月28日
发明者周平, 江腾, 蔡建华, 邓益斌 申请人:复旦大学