专利名称：一种ε-聚赖氨酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种应用物理、化学诱变手段，诱变分离一株高产e—聚赖氨酸链霉菌，尤 其涉及一种e —聚赖氨酸的制备方法。
(二)
背景技术：
s-聚赖氨酸是80年代由R本首先发现的继Nisin之后的一种新型食品抑菌剂，具有 广谱抑菌性，对于酵母属的尖锐假丝酵母菌、法红酵母菌、产膜毕氏酵母、玫瑰掷孢酵母； 革兰氏阳性菌中的耐热脂肪芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌；革兰氏阴性菌中的产 气节杆菌、大肠杆菌等引起食物中毒与腐败的菌有强烈的抑制作用，同时还具有一定的抗噬 菌体的能力。其化学组成是由人体必需氨基酸L-赖氨酸构成的多肽，它经消化后又可变成单 的赖氨酸而成为人体营养的强化剂，故聚赖氨酸作为食品防腐剂，具有无毒副作用，安全性 高的特点。聚赖氨酸的热稳定性非常好，其最适pH5-8，也就是说其在中性和微酸性环境中 有较强的抑菌性。e-聚赖氨酸是由人体必需氨基酸L-赖氨酸构成的多肽，它经消化后又可 变成单一的赖氨酸而成为人体营养的强化剂，故聚赖氨酸作为食品防腐剂，具有无毒副作用， 安全性高的特点。2004年2月24円R本Chisso公司生产的聚赖氨酸这种天然食品添加 剂作为GRAS物质通过了美国FDA认证，CAS登记号为28211_04_3，标志着e-聚赖氨酸已 被国际标准所认可。e-聚赖氨酸抑菌谱广，对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌 均有一定的抑菌作用，而且其对一些耐热性芽孢杆菌和一些病毒也有抑制作用。
国内很多科研机构对e—聚赖氨酸也进行深入的研究，多数是从土壤中分离白色链霉 菌，发酵生产e—聚赖氨酸，但自然界中的白色链霉菌产e—聚赖氨酸的能力较低， 一般产 量不超过lg/L，但产物中含有一定量的a—聚赖氨酸，有毒性，必须分离出去方可在食品中 使用，给工业生产带來很大难度，同时产品生产成本很高，故至今国内对e—聚赖氨酸尚未 规模化生产，仅限于科学研究阶段。本专利以中国工业微生物菌种保藏中心保藏的弗吉尼亚 链霉菌为出发菌株，经物理、化学诱变，筛选一株e—聚赖氨酸高产突变菌株，产能可达 8.36g/L，产物中没有a—聚赖氨酸，大大降低了生产成本，经5吨发酵罐中试，吨培养基生 产e—聚赖氨酸可达8公斤以上，完全可以规模化生产。
(三)
发明内容
本发明目的在于提供一种e —聚赖氨酸的制备方法。
本发明的目的是这样实现的本发明中所涉及的百分比除另有注明之外为质量比，本发 明的产品采用这样的方法来制备的1. 出发菌株来源
出发菌株购买于中国工业微生物菌种保藏中心，名称及编号为弗吉尼亚链霉菌CICC 11013。
2. 培养基配置
可溶性淀粉(g/L)50， (NH4)2S04(g/L)10，酵母提取物(g/U 7.5， K2HP04(g/L) 0. 8 ， 野(Ug/L) 1. 36， MgS04 7H20(g/L)0. 75， ZnS04 7H20(g/L)0. 06， FeS04 7H20 0 . 045 (固体 斜面添加2%的琼脂)，其余为去离子水。
3. 诱变过程
3. 1单孢子悬液制备
取出发菌株弗吉尼亚链霉菌一环接于斜面培养基上，26'C培养7d待孢子成熟铺满斜面， 用无菌生理盐水洗下，在装有玻璃珠的无菌生理盐水中振荡活化使孢子分散，用滤纸过滤菌 丝得到单孢子悬液，调整孢子浓度为10s个/mL。
3.2硫酸二乙酯(DES)诱变
将孢子悬液与5%浓度的硫酸二乙酯等量混合，在200r/min分别振荡30、 60、 90、 120、 150、 180min，每个振荡处理后立即加25%硫代硫酸钠lml终止反应。取样稀释涂平板，以同 样操作，用未经DES诱变的细胞稀释液涂布平板作对照，置于26C的条件下培养6d，挑出 30株，经初筛、复筛获得了 DES-25，其e -聚赖氨酸产量达5. 45g/L，比原菌株产e -聚赖氨 酸能力提高了 5倍。
3. 3紫外复合氯化锂诱变
取制备好的菌株DES-25的孢子悬液5 ml于①9cm无菌平皿中。紫外灯打开预热20 min 以稳定光波，将盛有孢子悬液的平皿置于磁力搅拌器上，距15w紫外灯距30cm处，打丌皿 盖，搅拌照射一定时间取一定量转于无菌试管，并立即浸入冰水中2h后，在红光下稀释涂 平板，培养基中添加0.5%的氯化锂作为助诱变剂，每样做三皿平行，26。C避光培养，3天后 统计菌落总数并挑取30株，经初筛、复筛获得了 DES-25-12，其e -聚赖氨酸产量达8. 36g/L， 将该菌株命名为弗吉尼亚链霉菌Y12，作为发酵菌株。
4. 发酵罐中试
4. 1 一级种子制备
将弗吉尼亚链霉菌Y12制成孢子悬液，调整孢子浓度为10s个/mL，按5%接种量接种于 若干500ml三角瓶液体培养基中，三角瓶装液量200ml， 26。C摇床培养72小时，摇床转速180 转/分钟。
4. 2 二级种子制备培养基与一级种子相同，按5%接种量种子罐扩大培养72小时，准备发酵。 4. 3 ￡ —聚赖氨酸发酵
发酵培养基与种子培养基相同，按5%接种量接种于5吨发酵罐中，26°C，通风培养108 小时，结束发酵。
4. 4 e -聚赖氨酸的提取
发酵醪液过滤除菌体后，滤液用NaOH调pH至8.5，再过滤除出沉淀，滤液用阳离子 交换树脂吸附，分别用0.2mol/L醋酸和0. 1 mol/L盐酸进行冲洗和洗脱，洗脱液用NaOH 中和至pH 6.5，再进行减压蒸发浓縮，浓缩液用活性碳脱色后，加入乙醇和乙醚(2:1)混合 液，过滤后得到的沉淀物即为e-聚赖氨酸，经检测不含ci—聚赖氨酸。 具体实施例方式
下面结合具体实施例对本发明作更详细的描述
丄.出发菌株来源
出发菌株购买于中国工业微生物菌种保藏中心，名称及编号为弗吉尼亚链霉菌CICC 11013。
2. 培养基配置
可溶性淀粉(g/U50， (NH丄S0,(g/1.)10，酵母提取物(g/L) 7.5， K2HP0,(g/L) 0. 8 ， 肌P0"g/L)1.36， MgSO,, 7H20(g/L)0. 75， ZnSO., 7H20(g/L) 0. 06， FeSO., 71120 0. 045 (固体 斜面添加2%的琼脂)，其余为去离子水。
3. 诱变过程
3. 1单孢子悬液制备
取出发菌株弗吉尼亚链霉菌一环接于斜面培养基上，26。C培养7d待孢子成熟铺满斜面， 用无菌生理盐水洗下，在装有玻璃珠的无菌生理盐水中振荡活化使孢子分散，用滤纸过滤菌 丝得到单孢子悬液，调整孢子浓度为108个/mL。
3.2硫酸二乙酯(DES)诱变
将孢子悬液与5%浓度的硫酸二乙酯等量混合，在200r/min分别振荡30、 60、 90、 120、 150、 180min，每个振荡处理后立即加25%硫代硫酸钠lml终止反应。取样稀释涂平板，以同 样操作，用未经DES诱变的细胞稀释液涂布平板作对照，置于加'C的条件下培养6d，挑出 30株，经初筛、复筛获得了DES-25，其e-聚赖氨酸产量达5. 45g/L，比原菌株产￡-聚赖氨 酸能力提高了 5倍。
3. 3紫外复合氯化锂诱变
取制备好的菌株DES-25的孢了悬液5 ral于①9cm无菌平皿中。紫外灯打开预热20 min以稳定光波，将盛有孢子悬液的平皿置于磁力搅拌器上，距15w紫外灯距30cm处，打开皿 盖，搅拌照射一定时间取一定量转于无菌试管，并立即浸入冰水中2h后，在红光下稀释涂 平板，培养基中添加0. 5%的氯化锂作为助诱变剂，每样做三皿平行，26。C避光培养，3天后 统计菌落总数并挑取30株，经初筛、复筛获得了 DES-25-12，其e -聚赖氨酸产量达8. 36g/L， 将该菌株命名为弗吉尼亚链霉菌Y12，作为发酵菌株。
4.批量生产e -聚赖氨酸
4. 1 一级种子制备
将弗吉尼亚链霉菌Y12制成孢子悬液，调整孢子浓度为108个/mL，按5%接种量接种于 45个500ml三角瓶液体培养基中，三角瓶装液量200ml, 26。C摇床培养72小时，摇床转速180
转/分钟。
4. 2 二级种子制备
培养基与一级种子相同，按5%接种量于250升种子罐中接种于175升培养基中，扩大培 养72小时，准备发酵。
4. 3 e —聚赖氨酸发酵
发酵培养基与种子培养基相同，按5%接种量于5吨发酵罐中接种于3. 5吨培养基中，26 °C，通风培养108小时，结束发酵。 4. 4 e -聚赖氨酸的提取
发酵醪液过滤除菌体后，滤液用NaOH调pH至8.5，再过滤除出沉淀，滤液用阳离子 交换树脂吸附，分别用0.2 fflol/L醋酸和0. 1 mol/L盐酸进行冲洗和洗脱，洗脱液用NaOH 中和至pH 6.5，再进行减压蒸发浓縮，浓縮液用活性碳脱色后，加入乙醇和乙醚(2:1)混合 液，过滤后得到的沉淀物即为e -聚赖氨酸，将沉淀物80'C通风干燥10小时，测水分小于5%， 称其重量为28.5公斤。
权利要求
1.一种ε-聚赖氨酸的制备方法，其特征是本发明提供了一种ε-聚赖氨酸的制备方法。以弗吉尼亚链霉菌为出发菌株，将孢子悬液与5％浓度的硫酸二乙酯等量混合，在200r/min分别振荡不同时间，每个振荡取样涂平板，置于26℃的条件下培养6天，获得了高产菌株DES-25。取菌株DES-25的孢子悬液5ml于9cm平皿中，距15w紫外灯30cm处，打开皿盖，搅拌照射一定时间，取菌液转于无菌试管，并立即浸入冰水中2h后，在红光下涂平板，培养基中添加0.5％的氯化锂作为助诱变剂，26℃避光培养3天后获得弗吉尼亚链霉菌Y12，其ε-聚赖氨酸产量达8.36g/L，将其作为发酵菌株。经一级、二级种子扩大培养，发酵生产ε-聚赖氨酸产品，提取后得率＞8g/L。
2. 根据权利要求1所述的一种s —聚赖氨酸的制备方法，其特征是所述的种子培养基和发酵培养基为可溶性淀粉(g/U50， (NH丄S0,(g/L)10，酵母提取 物 (g/L) 7.5 ，K2HP04(g/L)0. 8 ， KH2P(Ug/L) 1. 36 ，MgS04 7H20(g/L) 0. 75 ， ZnS0《 7H20(g/L)0. 06， FeSQ, 7H20 0. 045 (固体斜面添加2%的琼脂)，其余为去离子水。
3. 根据权利要求l所述的一种e—聚赖氨酸的制备方法，其特征是所述的孢子悬液浓度10s个/mL。
4. 根据权利要求i所述的一种e —聚赖氨酸的制备方法，其特征是所述的一级、二级种子扩大培养，培养温度为26t:， 一级种子摇床转速180转/分钟。
5. 根据权利要求1所述的一种s —聚赖氨酸的制备方法，其特征是所述的e _聚赖氨酸发酵产品水分<5%。
全文摘要
本发明提供了一种ε-聚赖氨酸的制备方法。以弗吉尼亚链霉菌为出发菌株，将孢子悬液与5％浓度的硫酸二乙酯等量混合，在200r/min分别振荡不同时间，每个振荡取样涂平板，置于26℃的条件下培养6天，获得了高产菌株DES-25。取菌株DES-25的孢子悬液5ml于9cm平皿中，距15w紫外灯30cm处，打开皿盖，搅拌照射一定时间，取菌液转于无菌试管，并立即浸入冰水中2h后，在红光下涂平板，培养基中添加0.5％的氯化锂作为助诱变剂，26℃避光培养3天后获得弗吉尼亚链霉菌Y12，其ε-聚赖氨酸产量达8.36g/L，将其作为发酵菌株。经一级、二级种子扩大培养，发酵生产ε-聚赖氨酸，提取后得率＞8g/L。
文档编号C12N15/01GK101525640SQ20091007185
公开日2009年9月9日 申请日期2009年4月22日 优先权日2009年4月22日
发明者镇 冯, 邵美丽, 韩建春 申请人:东北农业大学