专利名称：一种利用细菌发酵生产丙烯酸的方法
技术领域：
本发明设计丙烯酸的工业发酵领域，具体地涉及一种利用埃氏巨球形菌
Mega—"era e/油m7生产丙烯酸的方法。
背景技术：
丙烯酸(CH2=CHCOOH)，高闪点酸性腐蚀可燃液体，有刺激性气味， 是工业生产中重要的不饱和有机酸，也是重要的有机化工原料。它主要用于 制备丙烯酸树脂及其它有机合成，另外也用于粘合剂、涂料、化纤、皮革、 造纸、纺织工业和光敏树脂板等的生产。寻找一条用可再生资源生产丙烯酸 的途径，成为世界各国国民经济健康发展过程中亟待解决的问题。
目前，丙烯酸及其酯的工业化生产方法以丙烯氧化法为主，乙炔羰化法 和丙烯腈水解法并存的生产方法。微生物法报道较少。 (1)化学法合成丙烯酸
丙烯氧化法丙烯氧化法分两种 一步法，丙烯直接与氧反应生成丙烯 酸。而两步法则是先将丙烯先与氧反应生成丙烯醛，丙烯醛再与氧反应生成 丙烯酸。工业上绝大多数用丙烯两步氧化法。第一步反应，反应温度320 330°C， 催化剂在MoBiFe催化剂中添加其他助剂如Co、 Ni、 W、 Tl、 K、 Na等元素，专利报道丙烯醛最高收率达90% ，加上同时生成的丙烯酸，收 率可达96%。丙烯氧化法是目前生产丙烯酸最经济的方法，且适合大规模生 产。此法的生产能力占世界总生产能力的85%以上。
乙炔羰基化路线(Reppe法)乙炔在羰基镍作用下同水或醇反应生成丙 烯酸或丙烯酯，由于乙炔与Ni(CO)4摩尔比是一个定量关系因而称为化学计量 反应。由于化学计量法生成丙烯酸或酯的产率低，并要消耗大量的羰基镍， 因而此法无多大经济价值。
丙烯腈水解法反应温度80 100°C，用过量的85。/。H2S04处理，首先 水解生成丙烯酰胺，进一步水解生成丙烯酸，也能同过量的醇反应生成酯。 60年代实现工业化，最终收率低于丙烯直接氧化法。因此大规模生产难以同 丙烯直接氧化法竞争。但此法工艺简单，条件温和，且有灵活性，可用于生产丙烯酰胺。因而丙烯腈水解法在小规模生产丙烯酸酯仍具有一定的吸引力。 目前许多中小型厂仍采用此法生产丙烯酸酯。 (2)生物合成法
随着生物技术的发展，利用微生物发酵合成精细化工产品己有报道，而 且利用微生物生产丙烯酰胺也已经开始工业化生产。这就为利用可再生资源 来生产石油化工产品奠定了基础。目前，国内外微生物发酵产丙烯酸的报道 较少，但在微生物代谢途径中，不断有游离态丙烯酸出现的报道。
1983年，Akedo用丁炔酸对催化丙烯酰辅酶A转变成丙酰辅酶A的酶进行 阻断，细胞中丙烯酸的浓度略有提高，这说明，在丙烯酸代谢途径中，的确 有分支代谢途径，但还有很多复杂的因素需要进一步研究，另外，阻断剂的 选择也要进一步研究。另一条途径，即3-HP (3-羟基丙酸)途径。近年来， 在生物合成丙烯酸领域，不断有糖无氧代谢转化为3-HP的报道，3-HP是微生 物产丙烯酸的前体，Cargill公司也是基于此开始对3-HP生物合成丙烯酸进行研 究，并由此开发出继聚乳酸后重要的有机中间体3-HP。还有一种途径即丙氨 酸途径，即e-丙烯酰胺辅酶A也可能是微生物产丙烯酸的前体，但没有得到 证实。1980年，Dalal在培养基中增加ct-丙胺酸量，细胞中丙烯酸含量提高到 2mM。比较上述丙烯酸代谢途径，微生物通过3-HP途径可直接从糖发酵合成 丙烯酸，培养基的成分就可以降低且多样化，糖的理论转化率为80%。
微生物法生产丙烯酸的方法报道文献专利极少，国际上有一篇专利US 2859240报道间接生产丙烯酸，先利用微生物产乳酸，再由乳酸化学催化生成 丙烯酸。缺点是要求高温,并且丙烯酸产率也不高。另外，间接生产丙烯酸的 方法只有一篇中国专利200610043894，山东宝莫生物化工股份有限公司曾 于2006年04月公开了由一种微生物法生产丙烯酸的方法，利用丙酸棒杆菌培 养产生腈水合酶；利用腈水合酶作为催化剂，由丙烯腈水合反应生成低浓度 丙烯酸铵溶液；低浓度的丙烯酸铵溶液经过降膜蒸发浓縮后再进行酸化脱铵 反应制备粗丙烯酸。能耗较低、转化率高，但还是存在丙烯腈污染和产量低 等缺点。
在添加电子受体的情况下，丙酸梭菌(C/o^Wwmprap/o"/cwm)发酵丙 烯酸的量得到了较大程度的提高。电子受体的加入可以代替丙烯酸还原。本 项目通过系统分析微生物在葡萄糖培养基上产丙烯酸的代谢途径，通过代谢调控的手段，分析细胞代谢通量，添加甲萘醌等电子受体直接发酵生产丙烯 酸，降低生产成本，提高丙烯酸产量。
发明内容
本发明的目的是提供了一种利用细菌发酵生产丙烯酸的方法， 本发明提供了一种利用细菌发酵生产丙烯酸的方法，它包括如下步骤
(1) 菌株选择原始菌株为埃氏巨球形菌，中科院微生物所发现， 中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC， No 1.2720;
(2) 斜面培养麦芽汁液体培养基麦芽汁体积浓度百分比为7%，
pH自然(约6.4)，灭菌121.3°C, 20分钟。将上述筛选出的菌株，无菌条 件下用接种环接1 2环于麦芽汁液体培养基33 4(TC恒温培养8 24小时；
(3) —级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环 接1 2环于发酵培养基中，33 4(TC条件下，在摇床上振荡培养24 48小时， 制得一级种子；
(4) 扩大培养按体积比10%的接种量，接一级种子于发酵培养基 中，添加四种体积百分浓度为0.015% 0.150°/。的电子受体水溶液之一，33 40 'C条件下，在摇床上振荡培养24 96小时，制得发酵液；四种电子受体水溶 液分别为亚甲基蓝、联苯醌、甲萘醌和蒽醌溶液，
(5) 收集菌体取步骤(4)的发酵液，在80， 000 10， 000转/分条 件下离心15-20分钟，收集沉淀菌体，并用质量百分浓度为0.7%的氯化钠溶 液洗涤2 3次，湿菌体在4"C储存，备用。
(6) 丙烯酸的提取选用氯仿萃取法进行菌体内丙烯酸的提取将
菌体用蒸馏水重悬，超声波破碎后，离心得粗丙烯酸溶液，之后按体积比为1:
l的比例加入三氯甲垸，45。C震荡萃取4小时，静置分层，取下层即为丙烯 酸样品。
其中，步骤(3)中涉及的液体发酵培养基配方是牛肉粉2.4g/L,蛋 白胨10.0 g/L,酵母膏5.0g/L,Na2HPO44.0g/L，葡萄糖1.5 g/L,可溶性淀粉 0.5g/L,L-半胱氨酸-HCbH2O0.5g/L，其他为去离子水。此液体发酵培养基 除L-半胱氨酸-HCl H20夕卜，均121.3°C， pH7.5，灭菌20分钟。L-半胱氨 酸-HC1'H20用0.22um微孔滤膜过滤除菌。
5步骤(4)中涉及的发酵培养基KH2P04 0.5 g/L, NH4C1 0.5 g/L, MgCl2 6H20 0.5 g/L,可溶性淀粉20.0 g/L,葡萄糖13.0g/L,酵母膏4.0g/L， 巯基乙酸。此发酵培养基除巯基乙酸外均121.3°C， pH7.5，灭菌20min 。巯 基乙酸0.22um微孔滤膜过滤除菌。
优选地，步骤(4)中所述的培养温度是37'C，培养时间是96小时。四 种电子受体水溶液添加体积百分浓度均为0.015%。
本发明用微生物发酵法生产丙烯酸是一种全新的尝试，填补国内微生物 产丙烯酸领域空白，完全摆脱对石油产品的依赖。
具体实施例方式
以下实例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。 实例l甲萘醌添加的丙烯酸的生产
(1) 菌株选择埃氏巨球形菌，中科院微生物所发现，中国微生物 菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC, No 1.2720。
(2) 斜面培养麦芽汁液体培养基麦芽汁体积百分浓度为7%， pH 自然(约6.4)，灭菌12L3。C, 20分钟。将上述筛选出的菌株，无菌条件下 用接种环接1~2环于麦芽汁液体培养基37"C恒温培养24小时。
(3) —级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环 接1 2环于150ml的发酵培养基中，37。C条件下，在摇床上振荡培养24小时， 制得一级种子；
(4) 扩大培养按体积比10%的接种量，接一级种子于200 mL的 发酵培养基中，添加体积百分浓度为0.015%的甲萘醌水溶液，37X:条件下， 在摇床上振荡培养96小时，制得发酵液；
(5) 收集菌体取步骤(4)的发酵液，在IO， 000转/分条件下离心 20分钟，收集沉淀菌体，并用质量百分浓度为0.7%的氯化钠溶液洗涤2 3 次，湿菌体在4"C储存，备用；
(6) 丙烯酸的提取选用氯仿萃取法进行菌体内丙烯酸的提取；氯 仿萃取法将菌体用蒸馏水重悬，超声波破碎后，离心得粗丙烯酸溶液，之 后按1: 1比例加入三氯甲垸，45X:震荡萃取4小时，静置分层，取下层即
为丙烯酸样品。
(7) 样品检测采用高效液相色谱(HPLC)法对步骤(6)中所得的样品进行丙烯酸含量测定，检测条件是高效液相色谱仪，日本日立型
L-7420 Pump， Beckman 126型折光示差检测器；测定条件CI8柱(250X 4.6mm， 5um， Diamodsil TM出品)；流动相0.01NH2SO4;流速0.8 ml/min， 柱温55°C。检测样品用0.45um的有机膜过滤，进样量20ul。计算出产量为 8.39mmol/L，是目前微生物产丙烯酸文献报道的4.195倍。 实例2蒽醌添加的丙烯酸的生产
(1) 菌株选择埃氏巨球形菌，中科院微生物所发现，中国微生物
菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC,Nol.2720;
(2) 斜面培养麦芽汁液体培养基麦芽汁体积百分浓度为7%， pH
自然(约6.4)，灭菌121.3。C， 20分钟。将上述筛选出的菌株，无菌条件下 用接种环接1 2环于麦芽汁液体培养基37'C恒温培养24小时。
(3) —级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环 接1~2环于150ml的发酵培养基中，37'C条件下，在摇床上振荡培养24小时， 制得一级种子；
(4) 扩大培养按体积比10%的接种量，接一级种子于200 mL的 发酵培养基中，添加体积百分浓度为0.015%的蒽醌水溶液，37'C条件下，在 摇床上振荡培养96小时，制得二级种子和发酵液；
(5) 收集菌体取步骤(4)的发酵液，在10， 000转/分条件下离心 20分钟，收集沉淀菌体，并用质量比为0.7%的氯化钠溶液洗涤2~3次，湿 菌体在4t:储存，备用；
(6) 丙烯酸的提取选用氯仿萃取法进行菌体内丙烯酸的提取；氯 仿萃取法将菌体用蒸馏水重悬，超声波破碎后，离心得粗丙烯酸溶液，之
后按1: 1比例加入三氯甲烷，45。C震荡萃取4小时，静置分层，取下层即
为丙烯酸样品。
(7) 样品检测采用高效液相色谱(HPLC)法对步骤(6)中所得
的样品进行丙烯酸含量测定，检测条件是高效液相色谱仪，日本日立型
L-7420 Pump， Beckman 126型折光示差检测器；测定条件C18柱(250X 4.6mm， 5um， DiamodsilTM出品)；流动相0.01NH2SO4;流速0.8 ml/min， 柱温55°C。检测样品用0.45um的有机膜过滤，进样量20ul。计算出产量为 6.12mmol/L，是目前微生物产丙烯酸文献报道的3.06倍。实例3联苯醌添加的丙烯酸的生产
(1) 菌株选择埃氏巨球形菌，中科院微生物所发现，中国微生物 菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC, No 1.2720;
(2) 斜面培养麦芽汁液体培养基麦芽汁体积百分浓度为7%， pH
自然(约6.4)，灭菌121.3'C， 20分钟。将上述筛选出的菌株，无菌条件下 用接种环接1 2环于麦芽汁液体培养基37"C恒温培养24小时。
(3) —级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环 接1 2环于150ml的发酵培养基中，37'C条件下，在摇床上振荡培养24小时， 制得一级种子；
(4) 扩大培养按体积比10%的接种量，接一级种子于200mL的 发酵培养基中，添加体积百分浓度为0.015%的联苯醌水溶液，37"C条件下， 在摇床上振荡培养96小时，制得发酵液；
(5) 收集菌体取步骤(4)的发酵液，在10， 000转/分条件下离心 20分钟，收集沉淀菌体，并用生理盐水洗涤3次，湿菌体在4。C储存，备用；
(6) 丙烯酸的提取选用氯仿萃取法进行菌体内丙烯酸的提取；氯 仿萃取法将菌体用蒸馏水重悬，超声波破碎后，离心得粗丙烯酸溶液，之 后按1: 1比例加入三氯甲垸，45r震荡萃取4小时，静置分层，取下层即 为丙烯酸样品。
(7) 样品检测采用高效液相色谱(HPLC)法对步骤(6)中所得 的样品进行丙烯酸含量测定，计算出产量为5.63mmol/L，是目前微生物产丙 烯酸文献报道的2.82倍。
实例4亚甲基蓝添加的丙烯酸的生产
(1) 菌株选择埃氏巨球形菌，中科院微生物所发现，中国微生物
菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC, No 1.2720;
(2) 斜面培养麦芽汁液体培养基麦芽汁体积百分浓度为7%， pH 自然(约6.4)，灭菌121.3'C， 20分钟。将上述筛选出的菌株，无菌条件下 用接种环接1 2环于麦芽汁液体培养基37t:恒温培养24小时。
(3) —级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1~2环于150ml的发酵培养基中，37"C条件下，在摇床上振荡培养24小时， 制得一级种子；
(4) 扩大培养按体积比10%的接种量，接一级种子于200 mL的 发酵培养基中，添加体积百分浓度为0.015%的亚甲基蓝水溶液，37'C条件下， 在摇床上振荡培养96小时，制得发酵液；
(5) 收集菌体取步骤(4)的发酵液，在10， 000转/分条件下离心 20分钟，收集沉淀菌体，并用质量百分浓度为0.7%的氯化钠溶液洗涤2 3 次，湿菌体在4'C储存，备用；
(6) 丙烯酸的提取选用氯仿萃取法进行菌体内丙烯酸的提取；氯仿萃 取法将菌体用蒸馏水重悬，超声波破碎后，离心得粗丙烯酸溶液，之后按1: l比例加入三氯甲垸，45'C震荡萃取4小时，静置分层，取下层即为丙烯酸 样品。
(7) 样品检测采用高效液相色谱(HPLC)法对步骤(6)中所得的样 品进行丙烯酸含量测定，检测条件是高效液相色谱仪，日本日立型L-7420 Pump， Beckman 126型折光示差检测器；测定条件C18柱(250X4.6mm， 5um， DiamodsilTM出品)；流动相0.01NH2SO4;流速0.8 ml/min，柱温55 。C。检测样品用0.45um的有机膜过滤，进样量20ul。计算出产量为5.44mmol/L， 是目前微生物产丙烯酸文献报道的2.72倍。
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权利要求
1、一种利用细菌发酵生产丙烯酸的方法，它包括如下步骤(1)菌株选择埃氏巨球形菌，中国微生物菌种保藏管理委员会保藏，保藏号为CGMCC，No1.2720；(2)斜面培养麦芽汁液体培养基麦芽汁体积百分浓度为7％，pH自然，灭菌121.3℃，20分钟；将上述筛选出的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于麦芽汁液体培养基33～40℃恒温培养8～24小时；(3)一级种子培养将步骤(2)培养的菌株，无菌条件下用接种环接1～2环于发酵培养基中，33～40℃条件下，在摇床上振荡培养24～48小时，制得一级种子；(4)扩大培养按体积比10％的接种量，接一级种子于发酵培养基中，添加四种体积百分浓度为0.015％～0.150％的电子受体水溶液之一，33～40℃条件下，在摇床上振荡培养24～96小时，制得二级发酵液；所添加的四种电子受体分别为亚甲基蓝、联苯醌、甲萘醌和蒽醌，(5)收集菌体取步骤(4)的发酵液，在80，000～10，000转/分条件下离心15-20分钟，收集沉淀菌体，并用质量百分浓度为0.7％的氯化钠溶液洗涤2～3次，湿菌体在4℃储存，备用；(6)丙烯酸的提取选用氯仿萃取法进行菌体内丙烯酸的提取将菌体用蒸馏水重悬，超声波破碎后，离心得粗丙烯酸溶液，之后按体积比为1∶1的比例加入三氯甲烷，45℃震荡萃取4小时，静置分层，取下层即为丙烯酸样品。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(3)中涉及的液体发 酵培养基配方是牛肉粉2.4g/L，蛋白胨10.0 g/L，酵母膏5.0g/L,Na2HPO4 4.0 g/L,葡萄糖1.5 g/L,可溶性淀粉0.5 g/L, L-半胱氨酸-HCl H20 0.5 g/L， 其他为去离子水；此液体发酵培养基除L-半胱氨酸-HCl，H20夕卜，均121.3 °C， pH7.5,灭菌20分钟；L-半胱氨酸41<:1*1120用0.22um微孔滤膜过滤 除菌。
3. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中涉及的发酵培 养基KH2P04 0.5 g/L, NH4C1 0.5 g/L, MgCl2 6H20 0.5 g/L,可溶性淀粉20.0 g/L,葡萄糖13.0g/L，酵母膏4.0g/L，巯基乙酸；此发酵培养基除巯基乙酸外 均121.3。C， pH7.5，灭菌20min ;巯基乙酸0.22um微孔滤膜过滤除菌。
4. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(4)中所述的培养温度 是37°C， 培养时间是96小时；添加浓度为0.015%。
全文摘要
本发明提供了一种利用细菌发酵生产丙烯酸的方法，所用菌种为埃氏巨球形菌Megasphaera elsdenii，依次包括斜面培养，一级种子培养，扩大培养，收集菌体，丙烯酸的提取；与目前的常用方法相比，本发明所述的方法具有系统简单、成本低、工艺简单等优点，具有广泛的工业化发展前景，为化工基础原料丙烯酸找到了一条绿色的应用途径。
文档编号C12R1/01GK101555496SQ20091008491
公开日2009年10月14日 申请日期2009年5月27日 优先权日2009年5月27日
发明者晶 李, 袁其朋 申请人:北京化工大学