专利名称：超高温瞬时处理的酸性乳饮料中抗生素的检测方法
技术领域：
本发明涉及一种超高温瞬时处理(UHT)的酸性乳饮料中抗生素的检测 方法，且该酸性乳饮料是由于添加酸性食品添加剂造成其酸性口味。特别涉 及用微生物检测UHT酸性乳饮料中抗生素的方法。
背景技术：
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抗生素的发现在帮助人类战胜重大疾病方面有巨大的贡献，但药物都是 双刃剑，抗生素也不例外，它的大范围滥用所导致的副作用己成为一个严峻 的社会问题，是人类健康的一大隐患。抗生素的滥用已显现出三大恶果其 一，产生大量的耐药菌，抗生素的效果变差或安全无效；原本抗生素可以轻 松对付的疾病，面对"抗药性"却显得无奈，于是只得应用更强大的药物来治疗， 如肺炎链球菌，过去对青霉素、红霉素、磺胺等药品都很敏感，现在几乎"刀 枪不入"。其二，产生严重的不良反应。其三，导致人体免疫力下降和产生医 源性感染。
因此，乳制品中抗生素残留一直是令人关注的焦点。抗生素可以利用微 生物来检测，其原理是抗生素抑制微生物孢子和微生物孢子在生长时产酸并 引起培养基中pH指示剂变色，从而判断样品中抗生素的有无。然而，当被检 测的样品中含有柠檬酸钠等这种酸性物质且达到一定量时，无论样品中有没 有抗生素残留，微生物孢子有无生长，培养基中pH指示剂都可以变色，产生 假阴性结果。所以该方法一直用于成品白奶检测。
早期的乳制品企业生产的产品主要是灭过菌的白奶类产品，pH值是接近 于中性的， 一般在6.4-6.7之间，针对这类产品出现了用微生物培养法检测产 品中的抗生素，同时也出现了一些快速检测试剂盒，例如西班牙的ECLIPSE50 试剂盒。当样品中无抗生素时，微孔中微生物会生长，并产酸，微孔中的蓝 色pH指示剂在酸性条件下变为黄色，判断样品为阴性，当样品中有抗生素且 达到检测限时，微孔中微生物生长受到抗生素抑制，停止生长，不产酸，微 孔中的蓝色pH指示剂保持蓝色不变，判断样品为阳性。随着人们对乳制品的口味要求越来越多样化，出现了酸酸乳，真果粒等 UHT酸性乳饮料，这些酸性乳饮料由于其本身pH值低，是酸性产品，其灭
菌后的pH值能够达到4左右，会导致检测抗生素的微生物培养法，不管样品 中有无抗生素，由于样品本身的酸性，蓝色pH指示剂在酸性条件下变为黄色， 会产生假阴性的结果，起不到检测抗生素的目的。然而若是使用液相法或液 质法进行检测，成本是它的几十倍，检测时间差不多，都是两个多小时，但 是微生物培养法只需要把样品加入微孔中，等待两个多小时，观察结果就可 以，检测人员可以用这两个多小时进行其它检测工作；而液相法或液质法在 检测的两个多小时时间内，需要不停地进行前处理，检测人员只能进行这一 项工作。目前，还有 -种可以快速检测抗生素的方法，叫做胶体金试纸条法， 但是该方法也只限于原料乳和成品白奶，无法进行UHT酸性乳饮料检测。
目前，国内没有关于微生物检测UHT酸性乳饮料中抗生素的方法，更没 有相关国家标准检测方法。因此，迫切需要找到一种简单，方便，成本低的 检测UHT酸性乳饮料中抗生素的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速准确的超高温瞬时处理(UHT)的酸性乳 饮料中抗生素的检测方法，其简便易行并且适用于规模化初筛UHT酸性乳饮 料。
本发明提供了一种超高温瞬时处理的酸性乳饮料中抗生素的检测方法， 包括以下步骤
1) 制备碱性试剂；
2) 取待检UHT酸性乳饮料样品，加入所述碱性试剂，混合均匀，使pH 值达到6.4-6.7，得到待测溶液；
3) 用己有的微生物快速检测抗生素的试剂盒检测待测溶液中是否存在微 生物，若存在微生物，则所述酸性乳饮料中不含抗生素，若不存在微生物， 则所述酸性乳饮料中含有抗生素。
优选的，所述的碱性试剂以去离子水为溶剂，溶解氢氧化钠或氢氧化钾 制备而成，更优选的，碱性试剂的浓度为1M。加入碱性试剂，可以中和UHT 酸性乳饮料中的酸性物质，使其pH值达到6.4-6.7之间，该pH值不回对微生 物培养法检测抗生素的pH指示剂产生干扰，避免产生假阴性结果。优选的，所述的试剂盒为西班牙的ECLIPSE50试剂盒。 为了确定上述试剂盒的培养时间，在所述步骤3)前进行阴性对照实验， 包括取50uL不含抗生素及抗生素拮抗剂的乳，加入到所述的试剂盒的微孔 中，置于65"C孵育器或水浴箱孵育变为黄色后再延长15分钟，记录自孵育开 始起所需时间之和为最佳培养时间。通常最佳培养时间为2小时15分钟到2 小时45分钟。
用ECLIPSE50试剂盒检测微生物存在的步骤如下
取50uL步骤2)所得到的待测溶液，加入到微生物快速检测抗生素的试 剂盒ECLIPSE50的微孔中，置于65'C孵育器或水浴箱孵育2小时15分钟到2 小时45分钟，读取结果。绿-黄色或者黄色表示抗生素不存在(阴性)，蓝-紫色表示抗生素存在(阳性)，绿-蓝色表示抗生素浓度接近试剂盒的检测限， 此时要重做检测。
优选的，在步骤3)检测时进行阳性对照实验检测ECLIPSE50试剂盒是 否可以使用，阳性对照实验包括如下步骤
a) 以去离子水为溶剂，配制抗生素标准溶液；
b) 将所配制抗生素标准溶液加入不含抗生素及抗生素拮抗剂的乳中，制 成阳性对照乳；
c) 将所述阳性对照乳与所述待测溶液使用相同的所述试剂盒进行检测， 读取阳性对照乳检测结果，其检测结果若为不含抗生素，则所用试剂盒失效， 需更换试剂盒重新检测样品，若其检测结果为含有抗生素，则所用试剂盒可 以用于检测。
本发明的方法是在检测成品白奶的微生物培养法基础上，增加前处理方 法，使酸度改变后的UHT酸性乳饮料符合微生物培养法检测要求。同时，不 影响UHT酸性乳饮料中抗生素的成分，最终完成检测。本发明的检测方法， 可以有效的解决微生物培养法检测UHT酸性乳饮料中抗生素残留时产生假阴 性的问题，正确的检测UHT酸性乳饮料中抗生素残留。本发明的方法具有快 速、简便、准确的优点，便于企业规模化应用。
具体实施例方式
下面将结合具体实施方案对本发明的方法做更详细的说明。本领域技术 人员应当理解，下述实施例均用于对本发明所要求保护的范围进行实例性的描述，以此概括本发明的各参数的相对范围，因而不能将之理解为对本发明 的一种具体限制。
实施例l检测UHT酸性乳饮料中的抗生素
UHT酸性乳饮料，其酸性是由柠檬酸钠等酸性食品添加剂造成。该UHT 酸性乳饮料pH值在4.0-5.0之间，lml的UHT酸性乳饮料加入30-35uL的1M NaOH，可将其pH值调至6.4-6.7。取待测UHT酸性乳饮料，按照如下步骤检
测其中是否含有抗生素
1 、配制lMNaOH水溶液称取4克NaOH，用去离子水溶解，定容到 腦ml。
2 、取两份，每份lml待测UHT酸性乳饮料样品，分别加入30、 35ul 的lMNaOH水溶液，涡旋混匀，用pH精密试纸进行检测，使样品pH值调 至6.4-6.7，制备成两份平行待测溶液。
3 、取l克不含抗生素及抗生素拮抗剂的乳粉溶解于9ml蒸馏水(温度 45-60。C)制成无抗复原乳，涡旋混匀制成阴性对照乳，温度降至室温后使用。 取lml无抗复原乳，也可以使用lml不含抗生素和抗生素拮抗剂的原料乳， 加入10ullPPm青霉素钠水溶液，使青霉素钠的最终浓度为10ppb ，制备成 阳性对照乳。
4 、将上述准备好的阴性对照乳，取50uL加入到西班牙ECLIPSE50试 剂盒的微孔中，置于65t:孵育器或水浴箱孵育，从试剂盒的微孔中观察，变 为黄色后再延长15分钟，所需要的时间之和记录为最佳培养时间。同一批次 的试剂盒只需进行一次阴性对照实验，以确定最佳培养时间，该时间在2小 时15分钟到2小时45分钟之间。
5、将上述准备好的待测溶液和阳性对照乳，分别取50uL加入到西班牙 ECLIPSE50试剂盒的微孔中，置于65。C孵育器或水浴箱孵育上述最佳培养时 间。
5、从西班牙ECLIPSE50试剂盒的微孔侧面观察结果，绿-黄色或者黄色 表示抗生素不存在(阴性)，蓝-紫色表示抗生素存在(阳性)，绿-蓝色表示抗 生素浓度接近试剂盒的检测限，此时要重做检测。本实施例的待测溶液检测 结果均为绿-黄色，不含抗生素。实施例2检测UHT果粒酸性乳饮料中的抗生素
UHT果粒酸性乳饮料，其酸性是由柠檬酸钠等酸性食品添加剂造成。UHT 果粒酸性乳饮料pH值在4.0-5.0之间，lml的UHT果粒酸性乳饮料加入30-35uL的IMKOH,可将其pH值调至6.4-6.7，用ECLIPSE50试剂盒进行抗生 素检测。
取待测UHT果粒酸性乳饮料，按照如下步骤检测其中是否含有抗生素
1 、配制1M KOH水溶液称取4克KOH，用去离子水溶解，定容到100ml。
2 、取两份、每份lml待测UHT果粒酸性乳饮料样品，用纱布过滤掉果粒。
3 、在两份去除果粒的样品中分别加入32、 34ul的IMKOH水溶液，涡 旋混匀，用pH精密试纸进行检测，使样品pH值调至6.4-6.7，制备成两份平 行待测溶液。
4 、取l克不含抗生素及抗生素拮抗剂的乳粉溶解于9ml蒸馏水(温度 45-60 °C )制成无抗复原乳，涡旋混匀，温度降至室温后使用。取lml无抗 复原乳，也可以使用lml不含抗生素和抗生素拮抗剂的原料乳，加入10ul IPPm 青霉素钠水溶液，使青霉素钠的最终浓度为10ppb ，制备成阳性对照乳。
5、 将上述准备好的待测溶液和阳性对照乳，分别取50uL加入到 ECLIPSE50试剂盒的微孔中，置于65'C孵育器或水浴箱孵育2小时45分钟。
6、 从西班牙ECLIPSE50试剂盒的微孔侧面观察结果，从微孔侧面观察 结果，绿-黄色或者黄色表示抗生素不存在(阴性)，蓝-紫色表示抗生素存在
(阳性)，绿-蓝色表示抗生素浓度接近试剂盒的检测限，此时要重做检测。本 实施例的待测溶液检测结果为黄色，不含抗生素。
以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式
，并非用以限定本发明的范 围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作的 等同变化、修改与结合，均应属于本发明保护的范围。
权利要求
1、一种超高温瞬时处理的酸性乳饮料中抗生素的检测方法，包括以下步骤1)制备碱性试剂；2)取待检UHT酸性乳饮料样品，加入所述碱性试剂，混合均匀，使pH值达到6.4-6.7，得到待测溶液；3)用已有的微生物快速检测抗生素的试剂盒检测待测溶液中是否存在抗生素，若微生物快速检测抗生素的试剂盒中微生物生长，则所述酸性乳饮料中不含抗生素，若微生物快速检测抗生素的试剂盒中微生物不生长，则所述酸性乳饮料中含有抗生素。
2、 如权利要求l所述的方法，其特征在于，所述的碱性试剂以去离子水 为溶剂，溶解氢氧化钠或氢氧化钾制备而成。
3、 如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述的碱性试剂浓度为1M。
4、 如权利要求3所述的方法，其特征在于，所述的试剂盒为西班牙的 ECLIPSE50试剂盒。
5、 如权利要求4的方法，其特征在于，在所述步骤3)前进行阴性对照 实验，包括如下步骤取50uL不含抗生素及抗生素拮抗剂的乳，加入到所述 的试剂盒的微孔中，置于65'C孵育器或水浴箱孵育变为黄色后再延长15分钟， 记录自孵育开始起所需时间之和为最佳培养时间。
6、 如权利要求5所述的方法，其特征在于，所述用ECLIPSE50试剂盒 检测微生物存在的步骤如下取50uL步骤2)所得到的待测溶液，加入到所述的试剂盒的微孔中，置 于65"C孵育器或水浴箱孵育最佳培养时间，读取结果。
7、 如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述最佳培养时间为2小时 15分钟到2小时45分钟。
8、 如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述用ECLIPSE50试剂盒 检测微生物存在的步骤如下取50uL步骤2)所得到的待测溶液，加入到所述的试剂盒的微孔中，置 于65匸孵育器或水浴箱孵育2小时15分钟到2小时45分钟。，读取结果。
9、 如权利要求6-8任意一项所述的方法，其特征在于，所述步骤3)检测时进行阳性对照实验，包括如下步骤a) 以去离子水为溶剂，配制抗生素标准溶液；b) 将所配制抗生素标准溶液加入不含抗生素及抗生素拮抗剂的乳中，制 成阳性对照乳；c) 将所述阳性对照乳与所述待测溶液使用相同的所述试剂盒进行检测，读取阳性对照乳检测结果，其检测结果若为不含抗生素，则所用试剂盒失效， 需更换试剂盒重新检测样品，若其检测结果为含有抗生素，则所用试剂盒可 以用于检测。
全文摘要
本发明涉及一种检测超高温瞬时处理(UHT)的酸性乳饮料中抗生素的方法。包括如下步骤UHT酸性乳饮料加入碱性试剂，将UHT酸性乳饮料pH值调至6.4-6.7之间，用微生物培养法检测抗生素残留试剂盒检测UHT酸性乳饮料中抗生素的残留情况。本发明还可以进一步的取不含抗生素和拮抗剂的原料乳，加入抗生素，制成阳性对照乳，与上述将pH值调至6.4-6.7的UHT酸性乳饮料在相同条件下检测抗生素含量。
文档编号C12Q1/18GK101629205SQ20091009075
公开日2010年1月20日 申请日期2009年8月10日 优先权日2009年8月10日
发明者刘卫星, 刘志楠, 刘晓川, 喻东威, 梅 李, 薛志清, 源 赵 申请人:内蒙古蒙牛乳业(集团)股份有限公司