专利名称：川芎嗪的制备方法
技术领域：
本发明涉及生物工程领域与食品化学领域，具体涉及一种利用纳豆枯 草芽孢杆菌制备川芎嗪的方法。
背景技术：
川芎，伞形科植物川芎(LigusticumchuanxiongHort.)的干燥根茎。 亦称,考，为多年生草本植物，根状茎，黄褐色；二或三回羽状复叶，小 叶3至5对，边缘成不整齐羽状全裂或深裂；花白色，复伞形花序；双悬果 卵形，有锐棱。根状茎入药，性温、味辛，有活血、行气、调经、祛风、 祛痴、止痛等功能，主治头痛、月经不调、经闭痛经、；e失打肺痛、风湿痹 痛等症，用于治疗冠心病，急、慢性缺血性脑血管病。
川芎为我国传统的中药材，主要化学成分有阿魏酸、川芎嗪、川芎酚、 川芎哚、蒿本内酯、川芎酞内酸，还含有多种有机酸、酯、醇、糖等化学 物质、维生素A和微量元素等。川芎噪(Ligustrazine,Lig;Tetramethylpyra zine,TMP)是从伞科植物川芎的根、茎中提取的一种活性生物碱，学名为 四曱基吡嗪。川芎。秦分子式为C8H12N2，相对分子质量为136.20;外观为 无色针晶，有特殊气味，熔点为80 82。C，沸点为19(TC,吸潮，易升华； 溶于热水、石油醚、氯仿、稀盐酸，微溶于乙醚，难溶于冷水。
近年来人们对川芎。秦的药理和临床应用均做了深入的研究，根据动物 药理实验和临床应用观察，川芍。秦具有明显扩张冠状动脉、增加冠状动脉 血流量、松弛血管平滑肌、降低血小板表面活性等药理作用。在临床上可 用于改善心绞痛和心肌缺血状态，治疗缺血性脑血栓和脑梗塞，拮抗钙离子，降低血液黏度，增强心肌收缩，以纠正心衰，松弛平滑肌，减少腺体 分泌、改善^f效循环，治疗肾炎、糖尿病、肾病、肺间质纤维、小儿哞喘及 支气管炎、面瘫、耳聋、关节炎等疾病。
目前川芍嗪主要是从中药材川芎中提取得到，赵惠萍对川芎的提取工
艺进行了研究(中国医学丛刊，2004年，4巻10期，川芎提取工艺的研究)， 采用四种提取方法得出最佳提取方案，证明在酸性条件下，用醇提取川芎 嗪的工艺是可行的。刘本等人用法多索溶剂、超临界CO2或含有10。/。曱醇 的超临界C02从川芎中提取川芎嗪(中国医药工业杂志，1999年，2巻30 期，法多索溶剂和超临界流体提取川芎中的川芎嗪)，HPLC分析结果表 明，经过2小时的提取，含有10。/。曱醇的超临界CO2提取率最高1.02。/。，法 多索溶剂经过3次1.5小时的才是取，提取率最低0.74%。
川穹溱也可以采用化学合成的方法来制备，中国专利CN1100765C中 公开了一种四曱基吡溱的制备方法，在vin族金属化合物与有机配体形成的 配位催化剂存在下，通过氢气与2，3 - 丁二酮一肟反应而获得四曱基吡嗪， 其中考察了不同反应温度、氢气分压、反应时间、溶剂等对其合成的影响 规律。中国专利CN1238344C公开了一种四曱基吡嗪的生产方法，以氨基 丁酮为原料，在石咸性条件下通入蒸汽，得到的四曱基吡嗪可以为三水合物 形式。上述化学合成法虽然产率较高，但容易产生许多副产物，还会带来 环境污染和安全性问题。
生物转化是利用植物离体细胞或器官、动物细胞、微生物及其细胞器， 以及游离酶对外源性化合物进行结构修饰的生化反应。其中微生物作为一 个完整个体，其体积虽小，但也有一套自身特异性的酶体系，且资源丰富、 种类繁多，对于特异的底物，可供筛选的菌林^f艮多。目前利用多种不同催 化功能的酶系对天然活性成分进行生物转化，产生新的组合性的天然化合 物库，再通过活性筛选，寻找新的高效低毒的天然活性先导化合物，或通 过对活性组分中不同成分结构变化与活性强度消长关系的分析发现新一
5代的先导化合物，已取得了巨大的社会效益和经济效益。
利用生物转化技术开发新药的过程，是以天然产物为先导化合物，通 过化学或生物的手段，对其结构进行修饰，得到根多结构新颖的化合物， 进而发现毒性更低，疗效更好的药物。可见生物转化在指导新药的结构修 饰，获得高效长效的新一代药物中的重要性。
发明内容
本发明提供了一种川芎嗪的制备方法，利用纳豆枯草芽孢杆菌对大豆 进行生物转化制备川穹嗪，该方法操作简单，转化反应易于控制，无污染， 安全性高。
一种川t嗪的制备方法，包括
(1 )将纳豆枯草芽孢杆菌LB斜面种子培养后转接到LB液体培养基， 在30 40。C (优选37。C)培养18 24小时得到种子培养液；
所述的纳豆枯草芽孢杆菌为日本生产纳豆的常用菌种，可采用市售产
口 口口 ，
得到的种子培养液内菌种细胞的密度为lxl07~ lxl09cfti/ml。 (2)将步骤(1 )得到的种子培养液接入大豆培养基，在30 40。C(优 选37。C )培养转化144- 168小时后即得到含有川芎嗪的产物；
所述的大豆培养基是将用流水浸泡的大豆灭菌处理后得到，灭菌处理 过程为常规的高温灭菌，优选在115。C灭菌处理25分钟。
种子培养液与大豆培养基的重量比优选为0.5 ~ 8 : 100，优选为1 :
100。
培养转化过程中可添加适量的乙偶姻，乙偶姻的添加时间可选择在培
养转化进行0 ~ 132小时的时候，优选在培养转化进行96小时的时候；乙 偶姻的添加量为培养液与大豆培养基总重量的0.1%~3%，优选0.5% 。 经研究表明，乙偶姻的加入可以显著提高转化率，对目标产物的纯度也会有良好的改善。
(3)在步骤(2)得到的含有川芎溱的产物中加入有机溶剂进行提取 得到提取液，将提取液与稀盐酸混合均匀后静置分层，水相即为盐酸化的 川芎。秦水溶液。
含有川芍嗪的产物和有机溶剂的用量可优选含有川芎嗪的产物的重 量(g):有机溶剂的体积(mL) = 1 : 5-50，优选1 : 25;以保证充分 提取川芎。秦，并节约有机溶剂。
所述有机溶剂为甲醇、丙酮、乙酸乙酯、lmol/LNaOH水溶液与氯仿
体积比为l : l的混合溶液或氯仿。
所述有机溶剂还可以是乙酸、乙醇和水的混合溶液，其重量百分比組
成为乙酸5%，乙醇65%~80%，余量为水。采用该混合溶液，由于其极 性与目的产物的极性接近，可明显提高提取的收率。
该混合溶液配置时一般可采用预先配置好的乙醇水溶液与适量的乙 酸混合。
利用有机溶剂提取的过程可选择在超声波辅助处理下于20 ~ 60°C回 流提取0.5-4小时，过滤除去残渣，得到提取液；
超声波的功率可选择220~880W，提取温度可为23~57°C,提取时 间为0.5-3小时。
所述稀盐酸浓度为O.l ~ 0.4mol/L,优选0.2 ~ 0,25mol/L。
盐酸化的川芎溱水溶液中含有川考。秦，可直接进行利用或根据需要应 用现有技术手段进行浓缩或提纯。
盐酸化的川芎。秦水溶液经过滤处理后进行反向高效液相色谱法 (RP-HPLC)检测，检测条件为流动相质量浓度为1%的醋酸水溶液 与曱醇的体积比=45 : 55;流速0.8mL/min;;险测波长290nm;柱温 45。C;进样量2pL。
本发明川芎嗪的制备方法利用了納豆枯草芽孢杆菌的特性，操作流程
7简单，微生物细胞培养容易，生物转化易于控制，安全性高，且无环境污 染，适于工业化生产。
具体实施方式
实施例1
将纳豆枯草芽孢杆菌LB斜面种子培养24小时后转接到LB液体培养 基，在37"、 150r/min摇床中培养18小时得到种子培养液。
称取100g用流水浸泡的大豆加入500mL三角瓶中，于115。C灭菌处 理25分钟，得到所需的培养基。
将2g种子培养液无菌接入上述培养基，37C培养转化144小时后即 得到102g含有川莒嗪的产物，加入510mL氯仿，在功率为550W的超声 波辅助处理下，于30。C回流提取1.5小时后过滤除去残渣，得到提取液， 加入与提取液相同体积的0.2mol/L的稀盐酸，混合均匀后静置分层，水相 即为盐酸化的川芎溱水溶液。
将上述盐酸化的川芎溱水溶液进行RP-HPLC检测，检测结果为每 100g大豆可转化制得0.0214 mg川芎。秦。
实施例2
将纳豆枯草芽孢杆菌LB斜面种子培养24小时后转接到LB液体培养 基，在37。C、 150r/min摇床中培养18小时得到种子培养液。
称取100g用流水浸泡的大豆加入500mL三角瓶中，于115。C下灭菌 处理25分钟，得到所需的培养基。
将2g种子培养液无菌接入上述培养基，于37。C进行培养转化，培养 转化96小时时加入0.2g乙偶姻，培养转化144小时后即得到102.2g含有 川芎嗪的产物，加入511mL丙酮，在功率为550W的超声波辅助处理下， 于43。C回流提取1.5小时后过滤除去残渣，得到提取液，加入与提取液相
8同体积的0.2mol/L的稀盐酸，混合均匀后静置分层，水相即为盐酸化的川 芍"秦水溶液。
将上述盐酸化的川芎溱水溶液进行RP-HPLC检测，检测结果为每 100g大豆可转化制得0.698 mg川穹溱。
实施例3
将纳豆枯草芽孢杆菌LB斜面种子培养24小时后转接到LB液体培养 基，在37。C、 150r/min摇床中培养18小时得到种子培养液。
称取100g用流水浸泡的大豆加入500mL三角瓶中，于115。C下灭菌 处理25分钟，得到所需的培养基。
将5g种子培养液无菌接入上述培养基，于37。C下进行培养转化，培 养转化96小时时加入0.2g乙偶姻，培养转化144小时后即得到105.2g含 有川芎嗪的产物，加入5260mL氯仿，在功率为880W的超声波辅助处理 下，于25。C回流提取2.5小时后过滤除去残渣，得到提取液，加入与提取 液相同体积的0.2mol/L的稀盐酸，混合均匀后静置分层，水相即为盐酸化 的川芎唤水溶液。
将上述盐酸化的川芍嗪水溶液进行RP-HPLC检测，检测结果为每 100g大豆可转化制得0.888 mg川芍溱。
实施例4
将纳豆枯草芽孢杆菌LB斜面种子培养24小时后转接到LB液体培养 基，在37。C、 150r/min摇床中培养18小时得到种子培养液。
称取100g用流水浸泡的大豆加入500mL三角瓶中，于115匸下灭菌 处理25分钟，得到所需的培养基。
将lg种子培养液无菌接入上述培养基，于37。C下进行培养转化，培 养转化96小时时加入0.48g乙偶姻，培养转化168小时后即得到101.48g含有川芎嗪的产物，加入乙酸、乙醇和水的混合溶液2537ml进行提取， 混合溶液重量百分比组成为乙酸5%，乙醇70%，余量为水。在功率为880W 的超声波辅助处理下，于25。C回流提取2.5小时后过滤除去残渣，得到提 取液，加入与提取液相同体积的0.25mol/L的稀盐酸，混合均匀后静置分 层，水相即为盐酸化的川芎。秦水溶液。
将上述盐酸化的川弯溱水溶液进行RP-HPLC检测，检测结果为每 100g大豆可转化制得0.92 mg川芎"秦。
权利要求
1、一种川芎嗪的制备方法，包括(1)将纳豆枯草芽孢杆菌LB斜面种子培养后转接到LB液体培养基，在30～40℃培养18～24小时得到种子培养液；(2)将步骤(1)得到的种子培养液接入大豆培养基，在30～40℃培养转化144～168小时后即得到含有川芎嗪的产物；(3)在步骤(2)得到的含有川芎嗪的产物中加入有机溶剂进行提取，得到提取液，将提取液用稀盐酸酸化后分离出水相，得到盐酸化的川芎嗪水溶液。
2、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(l)中，种子 培养液内菌种细胞的密度为lxl07~ lxl09cfU/mL。
3、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中，种子 培养液与大豆培养基的重量比为0.5-8 : 100。
4、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(2)中，在培 养转化过程中添加乙偶姻。
5、 如权利要求4所述的制备方法，其特征在于所述乙偶姻的添加 时间为在培养转化进行0~132小时的时候，添加量为种子培养液与大豆 培养基总重量的0.1% ~3%。
6、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述有 机溶剂为曱醇、丙酮、乙酸乙酯、lmol/L NaOH水溶液与氯仿体积比为1 : 1的混合溶液或氯仿。
7、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于步骤(3)中所述有 机溶剂为乙酸、乙醇和水的混合溶液，其重量百分比组成为乙酸5%,乙 醇65%~80%,余量为水。
8、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述提取过程为在超声波辅助处理下于20 6(TC回流提取0.5~4小时，过滤除去残渣，得 到提取液。
9、 如权利要求1所述的制备方法，其特征在于所述稀盐酸的浓度 为0.1 ~0.4mol/L。
10、 如权利要求9所述的制备方法，其特征在于所述稀盐酸的浓度 为0.2 ~ 0.25mol/L。
全文摘要
本发明公开了一种川芎嗪的制备方法，包括将纳豆枯草芽孢杆菌LB斜面种子培养后转接到LB液体培养基培养得到种子培养液，接入大豆培养基中，在30～40℃培养转化144～168小时后即得到含有川芎嗪的产物，再加入有机溶剂进行提取，提取液与稀盐酸混合均匀后静置分层，水相即为盐酸化的川芎嗪水溶液。该方法操作简单，微生物细胞培养容易，生物转化易于控制，安全性高，且无污染，适于工业化生产。
文档编号C12P17/12GK101503718SQ20091009681
公开日2009年8月12日 申请日期2009年3月16日 优先权日2009年3月16日
发明者何国庆, 傅明亮, 婧 刘, 章海锋, 辉 阮, 陈启和 申请人:浙江大学