专利名称：：利用液氮预冻提高乳酸菌冷冻干燥后存活率的方法
技术领域：
：本发明涉及一种冷冻干燥的预冻方法，具体为一种提高乳酸菌冷冻干燥后存活率的预冻方法。
背景技术：
：随着人们对生活质量要求的提高，冻干产品越来越受欢迎。但因目前国内真空冷冻干燥微生物的技术还不够完善，冻干产品的活菌数还不够高，冷冻干燥技术还处于发展阶段。直投式冻干发酵剂，活菌含量高，保藏和运输方便，机械化程度高，便于工业化批量生产，是今后高效浓缩型发酵剂的主要发展方向。而制备直投式冻干发酵剂的主要方法是冷冻干燥，其基本原理是菌体与保护介质混溶，在共溶点以下预冻，然后，在低于三相点压力的高度真空状态下，使菌品中的水晶升华，除去菌品中的多余水分，获得一定含水量的干燥发酵剂。这一过程中影响冻干发酵剂细胞存活率的因素很多，但其中的预冻过程是冻干发酵剂制备中十分重要的工艺环节。然而，微生物在冷冻过程中，不可避免地会造成部分细胞的死亡或损伤，尤其是乳酸菌，生理条件要求苛刻，细胞死亡率明显升高。那么，怎样降低预冻过程乳酸菌的死亡率是目前研究的重要环节在真空冷冻干燥保藏菌种的过程中，冻结速度是影响微生物存活率的重要因素，不同微生物最佳冷冻速度不同，其主要原因是冻结速度必须与微生物细胞对水分的渗透率相平衡，而细胞对水分的渗透率取决于细胞表面积与体积的比率以及细胞膜的渗透率。当冷冻速度过慢时，细胞严重脱水，细胞体积严重收缩，超过一定程度时细胞将失去活性。同时冷冻速度过慢，还会引起细胞外溶液部分结冰，从而使细胞外未结冰的溶液中溶质浓度过高，产生溶质损害；当冷冻速度过快时，细胞内的水分来不及外渗，会形成较大冰晶，使细胞膜及细胞器遭到破坏，造成细胞内水晶机械损伤。另也有研究报道，冷冻速度在5°C/min~180°C/min之间时，冷冻过程中胞内水分会完全渗出细胞，胞内不会出现结晶，细胞存活率较高；当冷冻速度大于5000'C/min时，胞内水分迅速形成结晶，不发生外渗，细胞存活率也比较高；^f旦是如果冷冻速度在180。C/min5000。C/min之间时，细胞内水分容易在外渗过程中形成结晶对细胞造成机械损伤。
发明内容本发明提供一种利用液氮进行预冻从而提高乳酸菌冷冻干燥后的存活率的方法。该方法包括如下步骤(1)把培养好的乳酸菌进行菌泥的收集，并加入保护剂；菌泥的收集中离心机械作用力以及时间和温度对冻干后存活率都有一定影响，本发明采用速度为4000-6000rpm，时间为10-20min,温度为4。C的条件离心，使离心损失率最小。(2)将菌泥滴入液氮中进行预冻；增大菌泥与液氮接触的表面积(比如采用不同规格的移液枪将菌泥滴入液氮)，可以增加冷冻干燥后乳酸菌的存活率；(3)将预冻后的菌泥放入冷冻干燥仪内冷冻干燥，省去仪器原有的预冻阶段；(4)收集产品，进行真空保存。不同的乳酸菌可以选择添加不同的保护剂，本发明按照常规操作选择保护剂即可，菌泥与保护剂的质量比为0.5-2:1。但是,各类保护剂各有优缺点，单一保护剂不能满足菌体抵抗外界恶劣条件的要求，例如大分子保护剂的物理化学特性目前还不清楚，但它主要是保护细胞的表面免受伤害，冻干过程中对细胞有一定的保护作用，但大分子保护剂单独使用时，在保存期间对细胞的保护效果却不明显。如果合适的大分子和小分子保护剂配合使用，将会加速干燥且能在干燥和保存期间维持较高的细胞存活率。以一定比例复配的保护剂效果较好，其中以脱脂乳、海藻糖、维生素C和谷氨酸钠复配后的保护效果最好。这四者具有互补作用，脱脂乳主要在细胞表面起保护层作用；维生素C和谷氨酸钠能渗透到细胞内部；在干燥过程中海藻糖糖形成一种玻璃态，在玻璃态下黏度极高，因而分子扩散系数很低，使大分子物质的链锻运动受阻，细胞壁的通透性降低.从而起到保护作用。选定嗜酸乳杆菌为实验对象，通过对脱脂乳、海藻糖、维生素c和谷氨酸钠进行正交实验，确定最好的复配比例。<table>tableseeoriginaldocumentpage5</column></row><table>注(l)Kl为水平l的结果之和的平均数，K2为水平2的结果之和的平均数,K3为水平3的结果之和的平均数(2)R为极差通过优化冻干保护剂的正交试验结果，最佳冻干保护剂配方为脱脂乳海藻糖维生素C:谷氨酸钠(质量比)=15:4:1:1.5，此保护剂对于选定的嗜酸乳杆菌的冻干存活率达到89.10%。步骤(2)中液氮预冻的时间为l-2h。用液氮预冻的乳酸菌存活率高于普通预冻的菌种存活率，液氮的预冻温度为-120。C，其预冻速度可以控制在5°C/min~180°C/min,可以使细胞内部的水渗出到细胞外，而水在细胞内部凝结正是细胞死亡的致命原因。本发明方法的优点是1、本发明所用的液氮预冻方法简单，操作快捷，利于提高乳酸菌冷冻干燥后的存活率。2、本发明所冻结的乳酸菌，冻干后物料的形态可以保持与干燥前基本相同，可防止抽真空干燥时物料起泡、浓缩、收缩和溶质移动等不可逆变化发生。3、本发明工艺合理，具有较强的工业化实施性。具体实施方式实施例l将1000ml嗜酸乳杆菌菌液在速度为6000r/min，温度为4。C的条件下离心20min，弃去上清液，用生理盐水洗涤后收集菌泥。在离心所得的菌泥中加入菌泥两倍体积的复配保护剂，保护剂中脱脂乳海藻糖维生素C:谷氨酸钠(质量比)=15:4:1:1.5，并混匀。取一个500ml烧杯，装入15ml菌泥，放入真空冷冻干燥仪内预冻，预冻温度为-8(TC,时间为2h。取4个500ml的烧杯，装入液氮，迅速用5ml、lml、200|al、100pl枪头的移液枪分别往4个烧杯中滴入15ml菌泥，在液氮环境中放置2h后，放入冷冻干燥仪中冻千。测冻千后菌粉中的活菌数，在菌粉中加入10ml生理盐水，逐级稀释，再涂平板，计活菌数。普通冷冻干燥后嗜酸乳杆菌冻干粉活菌数为1.457xloHcfb/ml，液氮预冻再冷冻干燥后用5ml、lml、200|il、100pl枪头的移液枪滴定的活菌数分别为1.592xl0"cfb/ml、1.699xlO"cfWml、1.789xl0"cfli/ml、1.792xl0"cfii/ml。由此可以看出，采用本发明方法的活菌数大于传统预冻方法，并且，枪头规格逐渐减小后增大了菌液与液氮的接触面积，同时也增加了活菌数。实施例2将1OOOml保加利亚乳杆菌菌液以速度为4000r/min，时间为20min条件离心，弃去上清液，用生理盐水洗涤后收集菌泥。在离心所得的菌泥中加入菌泥同体积的实施例l的复配保护剂，并混匀。取一个500ml烧杯，装入15ml混合菌泥，放入真空冷冻干燥仪内预冻，预冻温度为-80"C，时间为2h。取500ml的烧杯，装入液氮，迅速用200pl枪头的移液枪往烧杯中滴入15ml菌液，在液氮环境中放置lh后，放入冷冻干燥仪中冻干。测冻干后菌粉的活菌数，在菌粉中加入10ml生理盐水，逐级稀释，再6涂平板，计活菌数。普通冷冻干燥后嗜酸乳杆菌冻干粉活菌数为5.9xl012cfb/g，液氮预冻再冷冻干燥后其活菌数为6.6xl012cfii/g。实施例3将1000ml嗜热链球菌菌液以速度为6000r/min,时间为20min条件离心，弃去上清液，用生理盐水洗涤后收集菌泥。在离心所得的菌泥中加入菌泥同体积的实施例l的复配保护剂，并混匀。取一个500ml烧杯，装入15ml混合菌泥，放入真空冷冻干燥仪内预冻，预冻温度为-8(TC,时间为2h。取500ml的烧杯，装入液氮，迅速用100nl枪头的移液枪往烧杯中滴入15ml菌液，在液氮环境中放置lh后，放入冷冻干燥仪中冻干。测冻干后菌粉的活菌数，在菌粉中加入10ml生理盐水，逐级稀释，再涂平板，计活菌数。普通冷冻干燥后嗜酸乳杆菌冻干粉活菌数为2xl012cfu/g，液氮预冻再冷冻干燥后其活菌数为2.4xl012cfU/g。权利要求1、一种利用液氮预冻提高乳酸菌冷冻干燥后存活率的方法，包括如下步骤(1)收集培养好的乳酸菌的菌泥，并加入保护剂充分均匀混合；(2)将混合有保护剂的菌泥滴入液氮中预冻；(3)将预冻好的菌泥冷冻干燥；(4)收集冷冻干燥后的菌粉，进行真空保存。2、如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中菌泥的收集的离心条件为4000-6000rpm，时间为10-20min,温度为4°C。3、如权利要求1所述的方法，其特征在于步骤(1)中菌泥与保护剂的质量比为0.5-2:1。4、如权利要求1或3所述的方法，其特征在于所述的保护剂为脱脂乳、海藻糖、维生素C和谷氨酸钠的混合物，5、如权利要求4所述的方法，其特征在于所述脱脂乳、海藻糖、维生素C和谷氨酸钠的质量比为脱脂乳海藻糖维生素C:谷氨酸钠=15:4:1:1.5。6、如权利要求l所述的方法，其特征在于步骤(2)中液氮预冻的时间为l誦2h。全文摘要本发明公开了一种利用液氮预冻提高乳酸菌冷冻干燥后存活率的方法，包括如下步骤(1)收集培养好的乳酸菌的菌泥，并加入一定配比的保护剂；(2)将菌泥滴入液氮中预冻；(3)预冻好的菌泥冷冻干燥；(4)收集产品，进行真空保存。本发明方法将传统的预冻方法改为液氮预冻，同时配以特定的复配保护剂，有效的增加了冻干后的活菌数，并且涉及的物料简单，操作方便，具有较强的工业化实施性。文档编号C12R1/23GK101503668SQ20091009653公开日2009年8月12日申请日期2009年3月6日优先权日2009年3月6日发明者何国庆,朱东升,李青青申请人:浙江大学