专利名称：Pcr反应中的非竞争性内对照系统的制作方法
技术领域：
本发明属于核酸检测技术领域，具体而言，本发明涉及聚合酶链反应体系中内对照分子的定量方法和内对照分子的构建方法、以及基于其得到的量和/或内对照分子的核酸扩增方法和相应检测试剂盒。另外，本发明还涉及二步法PCR扩增方法和内对照分子或试剂盒的应用等。
背景技术：
核酸检测技术日益普及，检测方法多种多样，其中主要的有聚合酶链反应(PCR)及其衍生技术，如反转录PCR(RT-PCR)、实时PCR等。PCR技术目前已经在感染性疾病、肿瘤、遗传病、寄生虫、法医学等检测过程中和动植物、考古研究中得到了广泛的应用，是在医药卫生、生物检测、食品安全等领域中非常重要的核酸检测技术。尤其是，PCR已经广泛用于与疾病相关的核酸的检测实践中，对疾病的临床诊断起了非常重要的作用并还在迅速发展推广之中。
在实际进行核酸检测的过程中运用PCR技术，为了表征假阴性结果的产生，也为了确定PCR的反应效率，需要在PCR反应体系中加入内对照分子，这样才能对PCR检测结果给出合理的解释，如为了排除假阴性结果，中国专利申请CN1203366A采用珠蛋白基因等作为内对照分子，CN1664098A采用beta-肌动蛋白作为内对照分子，CN1687454A采用res-1基因作为内对照分子，CN1940087A采用了RNA内对照分子。因此，每次PCR时，需要通过内对照来保证实际PCR检测质量。然而，相对于PCR检测方法，人们对内对照的研究工作却相对少得多。
内对照分子通过与靶核酸竞争反应底物，从而和样品中可能存在的靶核酸分子在PCR扩增的过程中相互竞争抑制。这种竞争在定量PCR检测过程中是有益的，因为内对照分子和靶核酸分子相互竞争扩增后得到的比值，可用来定量测定靶核酸分子数量。然而，在对灵敏度要求较高的定性测定(即，定性判断靶核酸分子是否存在于样品中)中，这种竞争则会对PCR检测的敏感性产生较大影响，即使内对照分子与靶核酸或靶核酸引物对的序列同一性低，但如果内对照分子加入量大(尤其相对靶核酸的相对量大，特别是PCR扩增的最初几个循环时靶核酸相对量会很低)，由于有较多机会与靶核酸引物对接触，尽管不一定共同退火，但空间上影响靶核酸引物对和靶核酸接触，则仍旧会抑制靶分子的扩增反应，使灵敏度下降；可是，内对照分子加入量小，则显然降低内对照分子被内对照引物对扩增的机会，内对照自身不容易被扩增出，无法起到监控反应(即，表征假阴性结果)的作用。因此，检测人员通常会根据自己长期的经验来确定特定PCR反应体系中内对照分子的加入量(如，绝对量、浓度等)，但是这样经验性的操作会因人而异，非常不利于检测质量的稳定，如不利于与其他检测人员的结果进行共享，也无法对PCR扩增体系和检测方式的改变(包括靶核酸序列、内对照分子序列、引物对序列、扩增方式、检测方式等的改变)做出相应灵活的调节，不利于包括内对照的PCR检测方法及相应检测试剂盒的开发。为了兼顾检测的灵敏度和表征假阴性结果的产生，CN1664098A采用两次测定的方法，即先不添加内对照分子进行第一次(或前几次)PCR检测，对于检测阴性的样品再添加内对照分子进行第二次(或后几次)PCR检测，但是这种方法较一次测定的方法步骤更多而且更复杂，样品用量更多，检测成本更高，而且需要判断第一次(或前几次)PCR检测结果并挑选阴性样品重新测量，这将增加自动化操作设计的难度，非常不利于大规模检测，如大量样品并行的PCR检测，另外第二次(或后几次)PCR检测仍旧需要根据经验来确定内对照分子的加入量。
为了克服现有技术的不足，经过长期艰苦努力和经验摸索，本发明人令人惊讶地对PCR反应体系中为人所不重视的内对照分子方面加以改进，根据不加入靶核酸时的PCR检测结果，运用Poisson分布来确定内对照分子的加入量，由此来兼顾检测的灵敏度和表征假阴性结果的产生，在尽量使内对照分子和靶核酸分子不发生竞争的条件下尽可能提高表征假阴性结果的有效性，同时避免经验化确定加入量给检测质量造成的不稳定性，从而能够为开发的包括内对照的PCR检测方法(尤其是自动化的PCR检测方法)及相应检测试剂盒提供平衡了检测灵敏度和表征假阴性结果的内对照分子的加入量。因此，本发明人还根据上述确定内对照分子的加入量的方法所确定的量开发了PCR检测方法及相应检测试剂盒。
秉承内对照分子方面改进的思路，本发明人还令人惊讶地优化了内对照分子的构建方法，由此构建的内对照分子通过对退火温度的调节可以提高PCR检测的灵敏度，配合上述定量的内对照分子的加入量，可以进一步提高PCR检测质量。因此，本发明还涉及包括相应构建的内对照分子的PCR检测方法及相应检测试剂盒。尽管CN101343659A公开了一种PCR引物设计方法，使内对照的引物对退火温度低于靶核酸的引物对退火温度，但是其为针对引物的设计方法，并非针对内对照分子的构建，其设计的具体方式也完全不同于本发明的。同时，本发明人还令人惊讶地开发了一种新的PCR定性检测方法，其为二步法PCR扩增方法，对内对照引物对在PCR中加入的时机进行了优化，可以提高PCR检测的灵敏度，配合上述定量的内对照分子的加入量，可以进一步提高PCR检测质量。
发明内容
本发明的目的在于提供确定内对照分子的量的方法和PCR检测方法，其通过对PCR定性检测方法中内对照的改进，提高检测灵敏度和/或兼顾检测灵敏度和表征假阴性结果的可靠性，用以得到更高质量的PCR检测结果，而且可以适应PCR扩增体系和检测方式的改变，为设计、实施PCR检测方法及其检测试剂盒带来方便。更具体地，本发明的目的在于通过在PCR定性检测方法中确定内对照分子的量、构建内对照分子和/或改进内对照引物对的在PCR扩增过程中加入的时机，来取得兼顾检测灵敏度和表征假阴性结果，从而使检测结果质量稳定，灵活应对检测方法的变化，和/或提高检测的灵敏度等有益效果。另外，本发明的目的还在于提供相应检测试剂盒以及应用等。
具体而言，在第一方面，本发明的目的在于提供PCR定性检测样品中靶核酸的方法中所用的内对照分子的优化量的确定方法，其包括 (1)以相同的扩增条件，分别进行k个相同的阴性PCR扩增，所述阴性PCR扩增体系中内对照分子的量为No，k≥10；该阴性PCR扩增体系包含靶核酸引物对、内对照分子和内对照引物对，其中不存在靶核酸； (2)分别检测步骤(1)的阴性PCR扩增后是否扩增出内对照分子，未检测到内对照分子扩增的阴性PCR扩增的个数为t；若t＝0或者t＝k，则调整No，重新从步骤(1)开始进行；若t＝0，提高内对照分子的量；若t＝k，降低内对照分子的量； (3)根据公式(I)计算临界量Nc 和 (4)根据Nc确定内对照分子的优化量，内对照分子的优化量介于3.0×Nc至9.2×Nc。
在本文中，本发明的检测样品中靶核酸的方法，所检测的样品是潜在可能含有靶核酸的离体样品，如食品、血液、血液制品、唾液、医疗用品或药品等。在所述样品中，本发明的检测样品中靶核酸的方法所检测的目标(即，靶核酸)可以是任何适合PCR扩增的核酸，如基因或基因片段，包括DNA和RNA。例如，在本发明的具体实施方式
中，可以检测HCV(丙型肝炎病毒，其为RNA病毒)的5’非编码区RNA、HIV(人免疫缺陷病毒，其为RNA病毒)的gag基因RNA和HBV(乙型肝炎病毒，其为DNA病毒)的编码S抗原的基因DNA。因此，靶核酸可以是RNA或DNA，优选是病原体的RNA或DNA，如相应病原体的特异性RNA或DNA，优选是细菌、病毒或致病微生物的RNA或DNA，更优选是病毒RNA或DNA，最优选是HCV RNA、HIV RNA或HBV DNA。在本发明的具体实施方式
中，靶核酸的示例有HCV的5’非编码区(即5’非翻译区，简称5’UTR)RNA、HIV的gag基因RNA和HBV的编码S抗原的基因DNA(即，s区DNA)。这些核酸能够在一定程度上表征相应病原体的存在性。
需要指出的是，本发明的检测方法是用于对离体样品的检测，检测的直接结果是靶核酸的存在性与否。即使对于利用本发明的检测方法检测人或动物的血液样品中病原体(如，病毒)上的靶核酸，也只能直接得出靶核酸的存在与否，还需要有经验的医生或取样人员判断检测出的靶核酸是来自于血液中的病原体还是取样时不慎污染的病原体，而不能直接得到疾病的诊断结果或健康状况；即使靶核酸来自于血液中的病原体，也只能说明相应人或动物是相应病原体的携带者，还需要有经验的医生根据相应人或动物的体质、病史、临床症状等综合情况才能判断出是否会造成疾病或对健康状况有影响。
在本文中，PCR定性检测核酸的方法指的是本领域技术人员所知晓的技术，如未加限定或说明，其包括PCR扩增和检测，其中PCR扩增中使用内对照分子，即，通过PCR反应扩增所述核酸，并通过检测是否有所述核酸的扩增来判断所述核酸是否存在，而且使用内对照分子来监测假阴性结果的产生。其中，PCR扩增是本领域技术人员所熟知的，已经发展出多种PCR扩增方式。本领域技术人员能够容易地根据PCR扩增的对象而选择靶核酸引物对和PCR扩增所需的试剂，如耐高温的DNA聚合酶(如，Taq酶)、核酸单体(如，dATP、dCTP、dGTP、dTTP、ATP、CTP、GTP和UTP)，对于采用反转录PCR(RT-PCR)扩增RNA来说，其中还需要反转录酶，如禽类成髓细胞病毒(AMV)反转录酶、Moloney鼠白血病病毒(MMLV)反转录酶等。而且，引物对的含义是为本领域技术人员所理解的，其由正向引物和反向引物组成，用于扩增所针对的核酸的有义链和其互补链，但在本文中，正向引物和反向引物中的“正向”和“反向”仅为区分正向引物和反向引物，而并非局限于指其与特定链(有义链或其互补链)退火。而且，在本文中，2种引物对的不同指的是1种引物对中的两条引物与另一种引物对中任一条引物都不同。另外，PCR扩增所需的试剂还优选包含pH缓冲剂(如Tris-HCl、PBS等)、离子强度调节剂(如，盐)、抗氧化剂(还原剂)、蛋白(酶)保护剂(如，牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)等)、RNase和/或RNase抑制剂等。这些成分及作用和所需仪器都是本领域技术人员所熟知的，而且已经商品化，可以通过商业渠道购买或委托制造。对于检测，通常在PCR扩增后进行检测，如通过电泳(如，微流芯片电泳、凝胶电泳)、酶联免疫吸附测试(ELISA)等来检测扩增产物，但也可以在PCR扩增时进行检测，如实时PCR(Real-time PCR)通过探针上的荧光剂和淬灭剂在扩增过程中对荧光的影响来检测。上述检测手段对于本领域技术人员来说是熟知的，其中所需试剂、仪器也可以通过行业渠道购买或委托加工。另外，PCR定性检测核酸的方法中可以不使用内对照，但是对于结果分析要求较高的定性检测(如临床诊断、血液筛查过程的一部分中所使用的PCR定性检测)来说，为了检测假阴性结果的产生(即，样品中实际存在靶核酸，但是没有检测到)，会采用内对照，包括内对照分子以及内对照引物对。因此，本发明的PCR定性检测样品中靶核酸的方法包括PCR扩增和检测，其中PCR扩增中使用内对照分子。当然，内对照分子不必在PCR扩增的全过程中都被使用，可以在进行了几个循环的PCR扩增后再加入内对照分子，也可以都加入内对照分子，如本发明第五方面所述的那样进行。
内对照分子是序列不同于靶核酸的核酸分子。内对照分子可以是单链核酸，也可以是双链核酸，在本发明的具体实施方式
中，优选是双链核酸。现有技术中已经有将特定核酸分子用作为内对照分子，本发明第三方面也提供了一种内对照分子的构建方法。PCR扩增时，在理论上的合适条件(如，理论上可以扩增靶核酸的条件)下，内对照分子可以被内对照引物对扩增，因此理论上可以监测假阴性结果。但是，实际上，由可能存在靶核酸的样品、靶核酸引物对、内对照分子、内对照引物对和PCR扩增所需的试剂以及水组成的PCR扩增体系成分非常复杂，靶核酸和内对照分子之间在PCR扩增体系中并不同PCR扩增条件下的竞争对于不同精度的检测方式所得的灵敏度影响，是难以用精确的计算方法推算出理论上的合适条件的。只能得出操作性差的大致结论PCR扩增中严格控制所加入的内对照分子数(为减少竞争应当加入最小量的内对照模板数)，既要使加入之内对照模板能监测反映出此PCR的效率或假阴性而多加，但又要尽可能少加来严格控制可能会抑制靶分子扩增的负面影响。因此，本发明人采用与PCR定性检测样品中靶核酸时的PCR扩增体系相比，仅缺少靶核酸的阴性PCR扩增体系，进行PCR扩增，来实验出对于该PCR扩增体系及其PCR扩增方式和条件进行PCR扩增时的不能扩增出可检测得到内对照分子的概率，并利用该概率通过Poisson分布计算出该PCR扩增体系中内对照分子的临界量，推算出内对照分子的优化量(优化添加量)，从而优化大规模PCR检测中或在PCR检测的不同批次之间的可靠性及重复性。
在本发明的第一方面的方法中，阴性PCR扩增体系指的是PCR扩增体系，其由靶核酸引物对、内对照分子、内对照引物对和PCR扩增所需的试剂以及水组成，其中不存在靶核酸。换句话说，与PCR定性检测样品中靶核酸时所采用的PCR扩增体系相比，阴性PCR扩增体系除了肯定不含靶核酸之外，其他都相同。例如，可以不加入样品，而代之以加入相同体积的样品溶剂(如水、缓冲液等)，并加入靶核酸引物对、内对照分子、内对照引物对和PCR扩增所需的试剂以及水，由此来获得阴性PCR扩增体系。对阴性PCR扩增体系进行的PCR扩增，即为阴性PCR扩增，理论上将获得靶核酸检测阴性的结果(即，检测不到)。优选其中靶核酸引物对和内对照引物对是不同的，即优选所述阴性PCR扩增体系包含靶核酸引物对、内对照分子和内对照引物对，其中靶核酸引物对和内对照引物对是不同的，更优选内对照分子中没有与靶核酸引物对序列同一性高的连续序列，如同一性大于50％、40％、30％、20％、10％或5％的序列。
在本发明的第一方面的方法中，为了准确实验出对于特定PCR扩增体系和特定PCR扩增条件下不能扩增出可检测得到内对照分子的概率，需要进行k个相同的阴性PCR扩增，其中k较大，优选k大于等于10，优选大于等于30，更优选大于等于50，最优选大于等于80。尽管k越大就越接近客观的概率，但是根据本发明人长期经验，30个以上的相同的阴性PCR扩增数量所获得的概率就已经比较准确了，而80个已经非常准确了，再增加试验次数所得的概率与80个的相差很小，出于成本的考虑可以不再增加实验次数。各个阴性PCR扩增应当是相同的，即PCR扩增条件和阴性PCR扩增体系均是相同的，如退火温度、退火时间、延伸时间等扩增条件均相同，而且扩增体系中诸如靶核酸引物对、内对照引物对、内对照分子等的量、序列和加入的时机以及所使用的酶、试剂的量和类型等均相同。其中，各个阴性PCR扩增体系中内对照分子的量均表示为No。在本文中，“量”可以指绝对数量，如分子数、分子摩尔数等，也可以指一定空间中的数量，如浓度。由于PCR扩增体系是特定而预先知晓的，因此本领域技术人员很容易通过总体积或总质量来将相应浓度换算成绝对数量，反之亦然。
进行了k个相同的阴性PCR扩增后，分别进行检测是否扩增出内对照分子，为了避免不同检测方式的精度不同，优选检测的方式与本发明的PCR定性检测核酸的方法中检测是否扩增出内对照分子的方式是相同的，如都使用相同类型的凝胶电泳来检测，其中检测条件(如凝胶浓度、电流大小等)均相同。检测后，未检测到内对照分子扩增的阴性PCR扩增的个数为t，若t＝0，则说明内对照分子的量太少，少得足以无法以相应PCR扩增条件和PCR扩增体系扩增出可检测得到的内对照分子，根本无法起到内对照监测的作用，因此需要提高阴性PCR扩增体系中内对照分子的量(No)，重新从本发明的第一方面的方法的步骤(1)开始依次进行；若t＝k，则说明内对照分子的量可能太多，虽然能够起到内对照监测的作用，但是可能有降低内对照分子的量来避免与靶核酸竞争的余地，因此需要降低阴性PCR扩增体系中内对照分子的量(No)，重新从本发明的第一方面的方法的步骤(1)开始依次进行。如此进行，直到0＜t＜k。此时，可以计算出该PCR扩增体系中n(显然，n与No成正比，计为No＝m×n)个内对照分子都没有被扩增到可检测出的概率为P(0)＝t/k。由于内对照分子数的绝对值很大，而每个内对照分子不被扩增的概率p很小，因此内对照分子都没有被扩增到可检测出的概率符合Poisson分布，例如P(0)＝e-n×p。同时，在该PCR扩增体系中，期望的没有进行扩增的内对照分子数为n和p的乘积，若期望的没有进行扩增的内对照分子数小于1，则有最大的概率使该PCR扩增体系没有1个内对照分子参与竞争，因此参与竞争的临界内对照分子数n’＝1/p，其中n’与临界量Nc成正比，为Nc＝m×n’，可以根据公式(I)可以由No和P(0)计算出临界量Nc。但是此时，只有内对照分子只有以e-1(约37％)的概率被扩增出，无法达到有效监控的目的。因此，当取优化量时，内对照分子以很大的概率(计为1-P(0)’)被扩增到可检测出，而没有被扩增到可检测出的情况是小概率事件(概率计为P(0)’)，实践中很难产生，因此再增加概率只有徒增与靶分子的竞争和成本了，根据Poisson分布，此时优化量为Nc×(-ln P(0)’)。也就是说，对于特定的PCR扩增条件，当特定的PCR扩增体系中内对照分子的量为临界量Nc×(-ln P(0)’)时，检测不到内对照分子的情况被认为不会发生，而此时内对照分子的量又是被认为内对照分子不会被漏检的情况下与靶核酸竞争最小的浓度，兼顾了检测灵敏度和假阴性结果的表征。而一般公认的小概率是5％、1％、0.5％、0.1％、0.01％等。因此，在本发明的第一方面的方法中，优选内对照分子的优化量介于3.0×Nc至9.2×Nc，优选介于4.6×Nc至6.9×Nc，最优选为5.3×Nc。
在第二方面，本发明的目的在于提供本发明第一方面所述方法确定的内对照分子的优化量在PCR定性检测样品中靶核酸的方法中的应用。相应地，本发明提供了PCR定性检测样品中靶核酸的方法，其包括PCR扩增和检测，其中PCR扩增中使用内对照分子，而且所使用的内对照分子的量为本发明第一方面所述方法确定的内对照分子的优化量。由于该内对照分子的优化量针对本发明的第一方面的方法中的PCR扩增体系、PCR扩增条件和检测内对照分子的方式，因此本发明第二方面的PCR定性检测样品中靶核酸的方法的PCR扩增体系、PCR扩增条件和检测内对照分子的方式希望能与本发明的第一方面的方法中的PCR扩增体系、PCR扩增条件和检测内对照分子的方式相同或相近。其中，优选PCR定性检测样品中靶核酸的方法中的扩增条件为本发明第一方面所述方法步骤(1)所述的相同扩增条件；也优选PCR定性检测样品中靶核酸的方法中内对照分子的检测为本发明第一方面所述方法步骤(2)所述的内对照分子的检测；由于样品中靶核酸可能存在也可能不存在，并非是预先确定的，因此也优选PCR定性检测样品中靶核酸的方法中的PCR扩增体系由本发明第一方面所述方法步骤(1)所述的阴性PCR扩增体系和样品中任选存在的靶核酸组成。另外，本发明还提供了用于上述PCR定性检测样品中靶核酸的方法中的检测试剂盒，其中PCR定性检测样品中靶核酸的方法所使用的内对照分子的量为本发明第一方面所述方法确定的内对照分子的优化量。例如，在制备检测试剂产品(如，检测试剂盒)时，确定各种引物、试剂的序列、组成和用量，当PCR扩增体系和扩增条件确定后，采用本发明第一方面所述方法确定内对照分子的优化量，由此确定内对照分子的用量。
在第三方面，本发明的目的在于提供PCR定性检测样品中靶核酸的方法中所用内对照分子的构建方法，其包括选择候选核酸或突变候选核酸成为内对照分子，所述内对照分子中与内对照引物对退火的序列和靶核酸中与靶核酸引物对退火的序列是不同的，而且内对照分子与内对照引物对的退火温度低于靶核酸与靶核酸引物对的退火温度。内对照分子的优化量由上述内对照分子的优化量的确定方法确定。在本发明第三方面的方法中，构建的含义是选择或突变核酸分子并进而得到所选择或突变的核酸实体。引物与其所针对的核酸序列的退火温度可以通过Tm值来确定，这对于本领域技术人员来说是熟知的。由于靶核酸预先确定，因此需要构建出内对照分子，并根据Tm值来设计相应引物。这样，降低内对照引物对与内对照分子的结合温度，可以使靶核酸引物对与靶核酸在较高的温度下退火结合，优先扩增，而内对照分子中与内对照引物对较难结合；然后，扩增几个或十几个(如，5～10个)循环之后，如存在，靶核酸的量将增加，其相对于内对照分子的比例也增加了，受内对照分子的竞争影响也相对减少，因此提高了检测灵敏度；此后再降低退火温度，以使内对照分子扩增，也能兼顾假阴性结果的表征。
在本发明第三方面的方法中，候选核酸可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程方法和/或化学合成方法来突变，或选择其中一段序列，形成内对照分子。为了降低突变的成本，也为了增加从中选择出内对照分子的机会，优选候选核酸与靶核酸的序列同一性小于20％，更优选小于10％。通过与人类及HBV、HCV、HIV等常见病毒和病菌基因组序列的综合比较，本发明人发现了一种与它们序列同一性综合程度低的基因，其为序列如Seq ID No1所示的新霉素抗药性基因(neo)，适于作为候选核酸。因此，在本发明的具体实施方式
中，候选核酸为新霉素抗药性基因，在其基础上选择出或突变出如本发明实施例所列的内对照分子。
对于本发明第三方面的方法，在一些具体实施方式
中，根据靶核酸和构建出的内多照分子的靶核酸引物对和内对照引物对是不相同的。其中，内对照分子中与内对照引物对退火的序列与内对照引物对序列是完全匹配的，优选所述内对照分子中与内对照引物对退火的序列长度介于10-25个核苷酸，更优选介于15-20个核苷酸。
对于本发明第三方面的方法，在另一些具体实施方式
中，根据靶核酸和构建出的内多照分子确定的靶核酸引物对和内对照引物对是相同的。其中，内对照分子中与内对照引物对退火的序列与内对照引物对序列是不完全匹配的，优选所述内对照分子中与内对照引物对退火的序列长度介于25-35个核苷酸，更优选介于27-32个核苷酸。优选其中所述不完全匹配的序列都位于由3-7个连续的A和/或T组成的序列中，更有选位于由5个连续的A和/或T组成的序列中，也优选由3-7个连续的A和/或T组成的序列是由A或T组成的序列，如5’-AAAA-3’或5’-TTTTT-3’。优选所述不完全匹配的序列更靠近但不位于内对照分子中与内对照引物对退火的序列的5’端，如距离所述5’端6-8个碱基，和/或距离所述5’端1-3个碱基，即使距离所述5’端12-16个碱基也可以，只要所述内对照分子中与内对照引物对退火的序列长度足够长使其位置更靠近5’端而非3’端即可。通常，由于很难有机会从候选核酸上直接选择出这样性质的内对照分子中与内对照引物对退火的序列，因此需要对候选核酸上选择出的序列加以突变，在与内对照引物对(即，靶核酸引物对)退火的位置上形成所述内对照分子中与内对照引物对退火的序列。例如，可以先根据靶核酸确定靶核酸引物对，即内对照引物对，然后将与内对照引物对退火的位置突变成内对照引物对的完全匹配的序列，然后再在更靠近但不位于与内对照引物对退火的序列的5’端突变，形成所述不完全匹配的序列，由此完成内对照分子的构建。
在第四方面，本发明的目的在于提供本发明第三方面所述的方法构建的内对照分子在PCR定性检测样品中靶核酸的方法中的应用。相应地，本发明提供了PCR定性检测样品中靶核酸的方法，其包括PCR扩增和检测，其中PCR扩增中使用内对照分子，所使用的内对照分子为本发明第三方面所述的方法构建的内对照分子，而且PCR扩增过程中降低退火温度。另外，优选其中内对照分子的量为本发明第一方面所述的方法确定的内对照分子的优化量。这样，降低内对照引物对与内对照分子的结合温度，可以使靶核酸引物对与靶核酸在较高的温度(优选温度为靶核酸引物对与靶核酸的退火温度)下优先扩增；在扩增几个或十几个(如，5～10个)循环之后，如存在，靶核酸的量将增加，其相对于内对照分子的比例也增加了，受内对照分子的竞争影响也相对减少，因此提高了检测灵敏度；此后再降低退火温度(优选降至内对照分子与内对照引物对的退火温度)，以使内对照分子扩增，也能兼顾假阴性结果的表征。对于本发明第三方面的方法，在一些具体实施方式
中，靶核酸引物对和内对照引物对是不同的。其中，内对照分子中与内对照引物对退火的序列与内对照引物对序列是完全匹配的，优选所述内对照引物对中正向引物和反向引物的序列长度都介于10-25个核苷酸，更优选介于15-20个核苷酸。对于本发明第三方面的方法，在另一些具体实施方式
中，其中靶核酸引物对和内对照引物对是相同的。其中，内对照分子中与内对照引物对退火的序列与内对照引物对序列是不完全匹配的，优选所述内对照引物对中正向引物和反向引物的序列长度都介于25-35个核苷酸，更优选介于27-32个核苷酸。优选其中所述不完全匹配的序列都位于由3-7个连续的A和/或T组成的序列中，更有选位于由5个连续的A和/或T组成的序列中，也优选由3-7个连续的A和/或T组成的序列是由A或T组成的序列，如5’-AAAA-3’或5’-TTTTT-3’。优选所述不完全匹配的序列更靠近但不位于内对照分子中与内对照引物对退火的序列的5’端，如距离所述5’端6-8个碱基，和/或距离所述5’端1-3个碱基，即使距离所述5’端12-16个碱基也可以，只要所述内对照分子中与内对照引物对退火的序列长度足够长使其位置更靠近5’端而非3’端即可。另外，本发明还提供了用于上述PCR定性检测样品中靶核酸的方法中的检测试剂盒，其中PCR定性检测样品中靶核酸的方法所使用的内对照分子为本发明第三方面所述的方法构建的内对照分子。例如，在制备检测试剂产品(如，检测试剂盒)时，为了构成其中的内对照分子，采用本发明第三方面所述的方法来构建内对照分子。
在第五方面，本发明的目的在于提供PCR定性检测样品中靶核酸的方法，其包括(1)对样品进行PCR扩增，其中PCR扩增体系所包含的内对照引物对有且只有正向引物；(2)步骤(1)完成后，加入内对照引物的反向引物，继续对样品进行PCR扩增；和(3)步骤(2)完成后，检测是否有扩增的靶核酸。
本发明第五方面的方法采用了二步PCR扩增，分两步扩增第一步PCR扩增时只加入内对照引物对中的一种引物(即，正向引物)，而不加入另一种引物(即，反向引物)；然后进行第二步PCR扩增，其中加入反向引物。在本发明第五方面的方法的步骤(1)中，所述PCR扩增体系由样品、靶核酸引物对、内对照分子、内对照引物对的正向引物和PCR扩增所需的试剂以及水组成。当然其中，靶核酸引物对和内对照引物对是不相同的，无法利用靶核酸引物对的正向引物或反向引物起到内对照引物对的反向引物的作用。这样，在第一步PCR扩增中只扩增其中内对照分子中的一条核酸链，该核酸链量的增长方式呈线性增长，会大大慢于同时扩增的靶核酸量的增长。例如，第一步PCR扩增20个循环，那么理论上内对照分子只产生20倍于初始量的单链核酸，而如果存在，靶核酸的量将呈几何级数增长，因此第一步PCR扩增后产生的内对照分子由于相对量较少，而没有能力和靶分子竞争反应底物，从而降低了内对照分子对靶核酸的竞争，提高了检测灵敏度。第二步PCR扩增中，再补入内对照引物对的反向引物，来扩增内对照分子，在降低竞争的同时，起到内对照监测的作用。
在本发明第五方面的方法中，步骤(1)的PCR扩增和步骤(2)的PCR扩增可以采用相同的退火温度，也可以采用不同的退火温度。例如其中，步骤(1)的PCR扩增的退火温度比步骤(2)的PCR扩增的退火温度高，此时优选其中内对照分子为本发明第三方面所述方法构建的内对照分子。
在本发明第五方面的方法中，优选使得步骤(1)中内对照引物对的正向引物的量较少，在步骤(2)中加入内对照引物的反向引物时补足正向引物的量。例如，步骤(1)中内对照引物对的正向引物的加入量只为本发明第五方面的方法中内对照引物对的正向引物的加入总量的不超过50％、40％、30％、20％、10％，如为加入总量的10％、5％，在步骤(2)中加入全部内对照引物的反向引物时补足正向引物的量。这样，可以进一步减低第一步PCR扩增中内对照分子的扩增量，进一步降低了内对照分子对靶核酸的竞争。
在本发明第五方面的方法中，优选内对照分子的量为本发明第一方面所述方法确定的内对照分子的优化量。这样可以进一步优化本发明第五方面的方法，使得在尽可能保证检测灵敏性的前提下，兼顾内对照监测扩增的有效性。
在第六方面，本发明的目的在于提供PCR定性检测样品中靶核酸的方法，其包括PCR扩增和检测，其中PCR扩增中使用内对照分子，其特征在于，所述内对照分子为本发明第三方面所述方法构建的内对照分子，和/或所述内对照分子的量为本发明第一方面所述方法确定的内对照分子的优化量。本发明第六方面的方法可以参见本发明第四方面或本发明第二方面中描述的PCR定性检测样品中靶核酸的方法。
在第七方面，本发明的目的在于提供用于本发明第五方面或本发明第六方面所述PCR定性检测样品中靶核酸的方法中的检测试剂盒。优选所述试剂盒包含Seq ID No1所示的核酸作为内对照分子。优选所述PCR定性检测样品中靶核酸的方法中使用的靶核酸引物对、内对照分子、内对照引物对、PCR扩增所需的试剂和/或检测所需的试剂可以分装在相同或不同容器中。在本文中，试剂盒具有本领域技术人员所理解的常规含义，例如，当存在不同步骤中使用的试剂时，则这些不同试剂应当分装于不同容器，避免预先相互混合。优选所述试剂盒还带有标签或说明书，用于指示所述试剂盒中不同成分的使用方法，例如本发明第五方面或本发明第六方面的方法，用以指导所述方法的进行。标签可以贴在上述容器上，或者直接打印到上述容器上，也可以提供独立的说明书。其中，容器可以是瓶、盒、注射器等能容纳上述成分的容器，例如常规用于装PCR、酶或核酸试剂的容器。根据需要，如方便运输、存放的需要，试剂盒还可以进一步包装进更大的包装中，这样的产品也在本发明的范围内。
在第八方面，本发明的目的在于提供本发明第七方面所述的检测试剂盒在制备用于本发明第五方面或本发明第六方面所述PCR定性检测样品中靶核酸的方法的检测试剂产品中的应用。检测试剂产品可以是检测试剂盒本身，也可以是合并装有多个检测试剂盒的更大包装产品。根据前文所述，本领域技术人员很容易理解其中检测试剂盒的成分以及其中制备方法和应用方法的流程。
为了便于理解，以下将通过具体的附图、实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见的。另外，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，它们的全文内容均纳入本文进行参考，就好像它们的全文已经在本文中重复叙述过一样。
图1使用内对照分子一步法PCR检测HBV的S基因的检测结果图，其中IC表示内对照分子检测峰，HBV表示S基因的检测峰。
图2使用内对照分子二步法PCR检测HBV的S基因的检测结果图，其中IC表示内对照分子检测峰，HBV表示S基因的检测峰。
图3PCR检测HBV的S基因的检测结果图，其中IC表示内对照分子检测峰，HBV表示S基因的检测峰。
图4PCR检测HBV的S基因的阴性PCR扩增的检测结果图，其中IC表示内对照分子检测峰，没有出现表示S基因的检测峰。
具体实施例方式 以下本文将通过具体的实施例来描述发明。如未特别指明之处，可根据本领域技术人员所熟悉的《分子可隆实验指南》(第三版)(Cold Spring Harbor laboratory Press)、《细胞实验指南》(科学出版社，北京，中国，2001年)、《RNA实验技术手册》(科学出版社，北京，中国，2004年)、《免疫检测技术》(科学出版社，北京，中国，1991)等实验手册以及本文所引用的参考文献中所列方法来实施。
实施例1内对照分子的构建和定量示例 从序列如Seq ID No.1所示的新霉素抗药性基因(neo)中选择出第936位-1076位的核酸序列，委托大连宝生物公司合成该核酸，构建成为内对照分子。
向PCR试管中加入以下引物和PCR扩增所需的试剂成分并达到以下终浓度10mMTris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀释得到的1拷贝上述内对照分子，内对照引物对(IC1(SEQ ID NO.4)、IC2(SEQ ID NO.5)，各0.2uM)，0.2uM的IC探针(SEQ IDNO.20)，靶核酸引物对(HBV引物1(SEQ ID NO.2)、HBV引物2(SEQ ID NO.3)各0.4uM，其针对HBV上的S基因)，0.2uM的HBV探针(SEQ ID NO.19)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可购自MBI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解扩增产物污染，可购自EPI公司)，使最终体积达到30ul(余量用水补足)。按如下参数进行PCR50℃×2min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循环。共重复进行80个上述阴性PCR扩增。
扩增结束后，将所得的阴性PCR扩增产物通过荧光方法检测内对照分子的扩增，检测结果如表1所示，其中未检出内对照分子的(no ct)共有30个，根据公式(I)，在上述PCR扩增体系中内对照分子的临界浓度Nc＝1/-ln(30/80)＝1.02。由此可得，为了保证内对照分子被检测到几率大于99.5％，上述PCR扩增体系应当加入达到的优化浓度为1.02×5.3＝5.4拷贝。
表1阴性PCR扩增后内对照分子的荧光数据检测结果 实施例2使用内对照分子一步法PCR检测HBV的S基因 以HBV的S基因作为检测所针对的靶核酸。向PCR试管中加入以下以下引物和PCR扩增所需的试剂成分并达到以下终浓度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀释得到的5.4拷贝序列如SEQ ID NO.21所示的内对照分子，内对照引物对(IC1(SEQ ID NO.4)、IC2(SEQ ID NO.5)，各0.2uM)，5uL靶核酸(其由购自卫生部临检中心机构的检测标准品稀释而得，稀释度分别为10、100、1000倍或不含靶核酸)，靶核酸引物对(HBV引物1(SEQID NO.2)、HBV引物2(SEQ ID NO.3)，各0.4uM，其针对HBV上的S基因)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可购自MBI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解扩增产物污染，可购自EPI公司)，使最终体积达到30ul(余量用水补足)。按如下参数进行PCR50℃×2min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循环。
扩增结束后，将所得的PCR扩增产物通过微流芯片方法检测靶核酸(靶核酸探针为5’-(FAM)TGTGT CTGCG GCGTT TTATCA(eclipse)-3’，可以委托大连宝生物公司合成)和内对照分子(内对照分子探针为5’-(Texas Red)tgcgctgacagccggaacac(eclipse)-3’，可以委托大连宝生物公司合成)的扩增，检测结果如图1所示，能够检测出1000稀释度的靶核酸，而且内对照分子能够进行有效监测。
实施例3使用内对照分子二步法PCR检测HBV的S基因 以HBV的S基因作为检测所针对的靶核酸。预先在很低浓度的含靶核酸的前提下，根据以下二步法PCR的全过程，确定序列如SEQ ID NO.21所示的内对照分子的加入量达到100拷贝。
向PCR试管中加入以下引物和PCR扩增所需的试剂成分并达到以下终浓度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀释得到的100拷贝序列如SEQ ID NO.21所示的内对照分子，0.2uM内对照引物IC1(SEQ ID NO.4)，5uL靶核酸(其由购自卫生部临检中心机构的检测标准品稀释而得，稀释度为1000倍或不含靶核酸)，靶核酸引物对(HBV引物1(SEQ IDNO.2)、HBV引物2(SEQ ID NO.3)，各0.4uM，其针对HBV上的S基因)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可购自MBI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解扩增产物污染，可购自EPI公司)，使最终体积达到20ul(余量用水补足)。按如下参数进行PCR50℃×2min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×20循环。由此完成第一步PCR扩增。
向上述PCR试管中加入以下引物和PCR扩增所需的试剂成分并达到以下终浓度10mMTris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，0.2uM内对照引物IC1(SEQ ID NO.4)，0.2uM内对照引物对IC2(SEQ ID NO.5)，0.03U Taq DNA聚合酶(可购自MBI公司)，使最终体积达到30ul(余量用水补足)。按如下参数进行PCR94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×35循环。由此完成第二步PCR扩增。
扩增结束后，将所得的PCR扩增产物通过微流芯片方法检测靶核酸和内对照分子的扩增，检测结果如图2所示，能够检测出1000稀释度的靶核酸，而且内对照分子能够进行有效监测。实施例4内对照分子的构建以及使用其检测HBV的S基因 从序列如Seq ID No.1所示的新霉素抗药性基因(neo)中选择出第936位-1072位的核酸序列，并根据HBV的S基因所确定的靶核酸引物对(HBV引物3(SEQ ID NO.6)、HBV引物4(SEQ ID NO.7))突变退火区域的序列，并且突变出含有不匹配序列的连续aaaaa区域(其序列如SEQ ID NO.16所示)，委托大连宝生物公司合成SEQ ID NO.16所示序列的核酸，构建成为内对照分子。
以HBV的S基因作为检测所针对的靶核酸。向PCR试管中加入以下以下引物和PCR扩增所需的试剂成分并达到以下终浓度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀释得到的4.7拷贝序列如SEQ ID NO.16所示的内对照分子，5uL靶核酸(其由购自卫生部临检中心的检测标准品稀释而得，稀释度分别为10、100、1000倍或不含靶核酸)，靶核酸引物对(HBV引物3(SEQ ID NO.6)、HBV引物4(SEQ ID NO.7)，各0.5uM，其针对HBV上的S基因，相当于内对照引物对)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可购自MBI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解扩增产物污染，可购自EPI公司)，使最终体积达到30ul(余量用水补足)。按如下参数进行PCR50℃×2min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循环。
扩增结束后，将所得的PCR扩增产物通过微流芯片方法检测靶核酸和内对照分子的扩增，检测结果如图3所示，能够检测出1000稀释度的靶核酸，而且内对照分子能够进行有效监测；图4显示阴性对照的检测结果图。
实施例5使用内对照分子一步法PCR检测HCV的RNA 以HCV的非编码区RNA作为检测所针对的靶核酸。预先在不含靶核酸的前提下，根据以下PCR的全过程，确定序列如SEQ ID NO.21所示的内对照分子的加入量。
向PCR试管中加入以下引物和PCR扩增所需的试剂成分并达到以下终浓度10mMTris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀释得到的5.4拷贝如SEQ ID NO.21所示的内对照分子，内对照引物对(IC1(SEQ ID NO.4)、IC2(SEQ ID NO.5)，各0.2uM)，5uL靶核酸(其由购自卫生部临检中心机构的检测标准品稀释而得，稀释度分别为10、100、1000倍或不含靶核酸)，靶核酸引物对(HCV引物1(SEQ ID NO.8)、HCV引物2(SEQ ID NO.9)，各0.4uM，其针对HCV上的5‘非编码区基因)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05UTaq DNA聚合酶(可购自MBI公司)，0.5U的MMLV反转录酶(可购自EPI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解扩增产物污染，可购自EPI公司)，使最终体积达到30ul(余量用水补足)。按如下参数进行RT-PCR42℃×50min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循环。
扩增结束后，将所得的PCR扩增产物通过微流芯片方法检测靶核酸和内对照分子的扩增，能够检测出1000稀释度的靶核酸，而且内对照分子能够进行有效监测，说明本发明的内对照分子构建方法和内对照分子量的确定方法也同样适于对RNA靶核酸的检测。
实施例6使用内对照分子二步法PCR检测HCV的RNA 以HCV的非编码区RNA作为检测所针对的靶核酸。预先在含临界较低浓度的靶核酸的前提下，根据以下二步法PCR的全过程，确定序列如SEQ ID NO.21所示的内对照分子的加入量。
向PCR试管中加入以下引物和PCR扩增所需的试剂成分并达到以下终浓度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀释得到的100拷贝序列如SEQ ID NO.21所示的内对照分子，0.2uM内对照引物IC1(SEQ ID NO.4)，5uL靶核酸(其由购自卫生部临检中心机构的检测标准品稀释而得，稀释度分别为10、100、1000或不含靶核酸)，靶核酸引物对(HCV引物1(SEQ ID NO.8)、HCV引物2(SEQ ID NO.9)，各0.4uM，其针对HCV上的5‘非编码区基因)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U的Taq DNA聚合酶(可购自MBI公司)，0.5U的MMLV反转录酶(可购自EPI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解扩增产物污染，可购自EPI公司)，使最终体积达到20ul(余量用水补足)。按如下参数进行PCR42℃×50min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×20循环。由此完成第一步PCR扩增。
向上述PCR试管中加入以下引物和PCR扩增所需的试剂成分并达到以下终浓度10mMTris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，0.2uM内对照引物IC1(SEQ ID NO.4)，0.2uM内对照引物IC2(SEQ ID NO.5)，0.03U Taq DNA聚合酶(可购自MBI公司)，使最终体积达到30ul(余量用水补足)。按如下参数进行PCR94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×35循环。由此完成第二步PCR扩增。
扩增结束后，将所得的PCR扩增产物通过微流芯片方法检测靶核酸和内对照分子的扩增，检测结果显示能够检测出1000稀释度的靶核酸，而且内对照分子能够进行有效监测。
实施例7内对照分子的构建以及使用其检测HCV的RNA 从序列如Seq ID No.1所示的新霉素抗药性基因(neo)中选择出第936位-1072位的核酸序列，并根据HCV的S基因所确定的靶核酸引物对(HCV引物3(SEQ ID NO.10)、HCV引物4(SEQ ID NO.11))突变退火区域的序列，并且突变出含有不匹配序列的连续aaaaa区域(其序列如SEQ ID NO.17所示)，委托大连宝生物公司合成SEQ ID NO.17所示序列的核酸，构建成为内对照分子。
以HCV的5‘非编码区基因作为检测所针对的靶核酸。向PCR试管中加入以下以下引物和PCR扩增所需的试剂成分并达到以下终浓度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀释得到的6.2拷贝如SEQ ID NO.17所示的内对照分子，5uL靶核酸(其由购自卫生部临检中心的检测标准品稀释而得，稀释度分别为10、100、1000倍或不含靶核酸)，靶核酸引物对(HCV引物3(SEQ ID NO.10)、HCV引物4(SEQ ID NO.11)，各0.6uM，其针对HCV上的5‘非编码区基因，相当于内对照引物对)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可购自MBI公司)，0.5U的MMLV反转录酶(可购自EPI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解扩增产物污染，可购自EPI公司)，使最终体积达到30ul(余量用水补足)。按如下参数进行RT-PCR42℃×50min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循环。
扩增结束后，将所得的PCR扩增产物通过微流芯片方法检测靶核酸和内对照分子的扩增，检测结果显示能够检测出1000稀释度的靶核酸，而且内对照分子能够进行有效监测。
实施例8使用内对照分子一步法PCR检测HIV的RNA 以HIV RNA-1的gag基因作为检测所针对的靶核酸。预先在不含靶核酸的前提下，根据以下PCR的全过程，确定序列如SEQ ID NO.21所示的内对照分子的加入量。
向PCR试管中加入以下引物和PCR扩增所需的试剂成分并达到以下终浓度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀释得到的5.4拷贝序列如SEQ ID NO.21所示的内对照分子，内对照引物对(IC1(SEQ ID NO.4)、IC2(SEQ ID NO.5)，各0.2uM)，5uL靶核酸(其由购自卫生部临检中心的检测标准品稀释而得，稀释度分别为10、100、1000或不含靶核酸)，靶核酸引物对(HIV引物1(SEQ ID NO.12)、HIV引物2(SEQ ID NO.13)，各0.4uM，其针对HIV上的gag基因)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可购自MBI公司)，0.5U的MMLV反转录酶(可购自EPI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解扩增产物污染，可购自EPI公司)，使最终体积达到30ul(余量用水补足)。按如下参数进行RT-PCR42℃×50min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循环。
扩增结束后，将所得的PCR扩增产物通过微流芯片方法检测靶核酸和内对照分子的扩增，能够检测出1000稀释度的靶核酸，而且内对照分子能够进行有效监测，说明本发明的内对照分子构建方法和内对照分子量的确定方法也同样适于对RNA靶核酸的检测。
实施例9使用内对照分子二步法PCR检测HIV的RNA 以HIV RNA-1的gag基因作为检测所针对的靶核酸。预先在很低浓度的含靶核酸的前提下，根据以下二步法PCR的全过程，确定序列如SEQ ID NO.21所示的内对照分子的加入量。
向PCR试管中加入以下引物和PCR扩增所需的试剂成分并达到以下终浓度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀释得到的100拷贝如SEQ ID NO.21所示的内对照分子，0.2uM内对照引物IC1(SEQ ID NO.4)，5uL靶核酸(其由购自卫生部临检中心机构的检测标准品稀释而得，稀释度分别为10、100、1000倍或不含靶核酸)，靶核酸引物对(HIV引物1(SEQ ID NO.12)、HIV引物2(SEQ ID NO.13)，各0.4uM，其针对HIV上的gag基因)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U的Taq DNA聚合酶(可购自MBI公司)，0.5U的MMLV反转录酶(可购自EPI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解扩增产物污染，可购自EPI公司)，使最终体积达到20ul(余量用水补足)。按如下参数进行PCR42℃×50min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×20循环。由此完成第一步PCR扩增。
向上述PCR试管中加入以下引物和PCR扩增所需的试剂成分并达到以下终浓度10mMTris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，0.2uM内对照引物IC1(SEQ ID NO.4)，0.2uM内对照引物IC2(SEQ ID NO.5)，0.03U Taq DNA聚合酶(可购自MBI公司)，使最终体积达到30ul(余量用水补足)。按如下参数进行PCR94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×35循环。由此完成第二步PCR扩增。
扩增结束后，将所得的PCR扩增产物通过微流芯片方法检测靶核酸和内对照分子的扩增，检测结果显示能够检测出1000稀释度的靶核酸，而且内对照分子能够进行有效监测。
实施例10内对照分子的构建以及使用其检测HIV的RNA 从序列如Seq ID No.1所示的新霉素抗药性基因(neo)中选择出第936位-1072位的核酸序列，并根据HIV的gag基因所确定的靶核酸引物对(HIV引物3(SEQ ID NO.14)、HIV引物4(SEQ ID NO.15))突变退火区域的序列，并且突变出含有不匹配序列的连续aaaaa区域(其序列如SEQ ID NO.18所示)，委托大连宝生物公司合成SEQ ID NO.18所示序列的核酸，构建成为内对照分子。
以HIV的gag基因作为检测所针对的靶核酸。向PCR试管中加入以下引物和PCR扩增所需的试剂成分并达到以下终浓度10mM Tris-HCl(pH 8.5)，50mM KCl，2mM MgCl2，稀释得到的5.6拷贝序列如SEQ ID NO.18所示的内对照分子，5uL靶核酸(其由购自卫生部临检中心的检测标准品稀释而得，稀释度分别为10、100、1000或不含靶核酸)，靶核酸引物对(HIV引物3(SEQ ID NO.14)、HIV引物4(SEQ ID NO.15)，各0.6uM，其针对HIV上的gag基因，相当于内对照引物对)，dATP、dCTP、dGTP和dUTP各0.2mM，0.05U Taq DNA聚合酶(可购自MBI公司)，0.5U的MMLV反转录酶(可购自EPI公司)，0.0005U的UNG(脲嘧啶糖基化酶，用于降解扩增产物污染，可购自EPI公司)，使最终体积达到30ul(余量用水补足)。按如下参数进行RT-PCR42℃×50min；94℃×5min；(94℃×20s，50℃×20s，65℃×45s)×40循环。
扩增结束后，将所得的PCR扩增产物通过微流芯片方法检测靶核酸和内对照分子的扩增，检测结果显示能够检测出1000稀释度的靶核酸，而且内对照分子能够进行有效监测。
<110>上海浩源生物科技有限公司
<120>PCR反应中的非竞争性内对照系统
<160>21
<210>1
<211>4380
<212>DNA
<213>新霉素抗药性基因(NEO)
<400>1
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61 ggatccacta gttctagagc ggccgccacc gcggtggagc tcgctgcatg caggtcactg
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301 gagagactgg tgatttttgc gggtcccgct cagaagaact cgtcaagaag gcgatagaag
361 gcgatgcgct gcgaatcggg agcggcgata ccgtaaagca cgaggaagcg gtcagcccat
421 tcgccgccaa gctcttcagc aatatcacgg gtagccaacg ctatgtcctg atagcggtcc
481 gccacaccca gccggccaca gtcgatgaat ccagaaaagc ggccattttc caccatgata
541 ttcggcaagc aggcatcgcc atgggtcacg acgagatcct cgccgtcggg catgcgcgcc
601 ttgagcctgg cgaacagttc ggctggcgcg agcccctgat gctcttcgtc cagatcatcc
661 tgatcgacaa gaccggcttc catccgagta cgtgctcgct cgatgcgatg tttcgcttgg
721 tggtcgaatg ggcaggtagc cggatcaagc gtatgcagcc gccgcattgc atcagccatg
781 atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg
841 cccaatagca gccagtccct tcccgcttca gtgacaacgt cgagcacagc tgcgcaagga
901 acgcccgtcg tggccagcca cgatagccgc gctgcctcgt cctgcagttc attcagggca
961 ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg
1021 gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gcccagtcat agccgaatag cctctccacc
1081 caagcggccg gagaacctgc gtgcaatcca tcttgttcaa tccaagctcc catggtggcc
1141 actcgaggtc ctctccaaat gaaatgaact tccttatata gaggaagggt cttgcgaagg
1201 atagtgggat tgtgcgtcat cccttacgtc agtggagata tcacatcaat ccacttgctt
1261 tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgttc ctcgtgggtg ggggtccatc
1321 tttgggacca ctgtcggtag aggcatcttg aacgatagcc tttcctttat cgcaatgatg
1381 gcatttgtag aagccatctt ccttttctac tgtcctttcg atgaagtgac agatagctgg
1441 gcaatggaat ccgaggaggt ttcccgatat taccctttgt tgaaaagtct caatagccct
1501 ctggtcttct gagactgtat ctttgatatt cttggagtag acgagagtgt cgtgctccac
1561 catgtttgca tgcatgcatg catgcaagct tggtaccaga tcttataatt aaatggcctt
1621 cgctgcccat attattggta actcaacagc atcaatcacg ggatttttct cgaattaatt
1681 gcgtcgaatc tcagcatcga aatattcgcc tttttcgtcc attagactat ctattgtgat
1741 ggtggattta tcacaaatgg gacccgccgc cgacagaggt gtgatgttag gccaggactt
1801 tgaaaatttg cgcaactatc gtatagtggc cgacaaattg acgccgagtt gacagactgc
1861 ctagcatttg agtgaattat gtaaggtaat gggctacact gaattggtag ctcaaactgt
1921 cagtatttat gtatatgagt gtatattttc gcataatctc agaccaatct gaagatgaaa
1981 tgggtatctg ggaatggcga aatcaaggca tcgatcgtga agtttctcat ctaagccccc
2041 atttggacgt gaatgtagac acgtcgaaat aaagatttcc gaattagaat aatttgttta
2101 ttgctttcgc ctataaatac gacggatcgt aatttgtcgt tttatcaaaa tgtactttca
2161 ttttataata acgctgcgga catctacatt tttgaattga aaaaaaattg gtaattactc
2221 tttctttttc tccatattga ccatcatact cattgctgat ccatgtagat ttcccggaca
2281 tgaagccatt tacaattgaa tatatcctgc cgccgctgcc gctttgcacc cggtggagct
2341 tgcatgttgg tttctacgca gaactgagcc ggttaggcag ataatttcca ttgagaactg
2401 agccatgtgc accttccccc caacacggtg agcgacgggg caacggagtg atccacatgg
2461 gacttttaaa catcatccgt cggatggcgt tgcgagagaa gcagtcgatc cgtgagatca
2521 gccgacgcac cgggcaggcg cgcaacacga tcgcaaagta tttgaacgca ggtacaatcg
2581 agccgacgtt cacggtaccg gaacgaccaa gcaagctagc ttagtaaagc cctcgctaga
2641 ttttaatgcg gatgttgcga ttacttcgcc aactattgcg ataacaagaa aaagccagcc
2701 tttcatgata tatctcccaa tttgtgtagg gcttattatg cacgcttaaa aataataaaa
2761 gcagacttga cctgatagtt tggctgtgag caattatgtg cttagtgcat ctaacgcttg
2821 agttaagccg cgccgcgaag cggcgtcggc ttgaacgaat tgttagacat tatttgccga
2881 ctaccttggt gatctcgcct ttcacgtagt ggacaaattc ttccaactga tctgcgcgcg
2941 aggccaagcg atcttcttct tgtccaagat aagcctgtct agcttcaagt atgacgggct
3001 gatactgggc cggcaggcgc tccattgccc agtcggcagc gacatccttc ggcgcgattt
3061 tgccggttac tgcgctgtac caaatgcggg acaacgtaag cactacattt cgctcatcgc
3121 cagcccagtc gggcggcgag ttccatagcg ttaaggtttc atttagcgcc tcaaatagat
3181 cctgttcagg aaccggatca aagagttcct ccgccgctgg acctaccaag gcaacgctat
3241 gttctcttgc ttttgtcagc aagatagcca gatcaatgtc gatcgtggct ggctcgaaga
3301 tacctgcaag aatgtcattg cgctgccatt ctccaaattg cagttcgcgt ttagctggat
3361 aacgccacgg aatgatgtcg tcgtgcacaa caatggtgac ttctacagcg cggagaatct
3421 cgctctctcc aggggaagcc gaagtttcca aaaggtcgtt gatcaaagct cgccgcgttg
3481 tttcatcaag ccttacggtc accgtaacca gcaaatcaat atcactgtgt ggcttcaggc
3541 cgccatccac tgcggagccg tacaaatgta cggccagcaa cgtcggttcg agatggcgct
3601 cgatgacgcc aactacctct gatagttgag tcgatacttc ggcgatcacc gcttccctca
3661 tgatgtttaa ctttgtttta gggcgactgc cctgctgcgt aacatcgttg ctgctccata
3721 acatcaaaca tcgacccacg gcgtaacgcg cttgctgctt ggatgcccga ggcatagact
3781 gtaccccaaa aaaacagtca taacaagcca tgaaaaccgc cactgcgccg ttaccaccgc
3841 tgcgttcggt caaggttctg gaccagttgc gtgagcgcat acgctacttg cattacagct
3901 tacgaaccga acaggcttat gtccactggg ttcgtgcctt catccgtttc cacggtgtgc
3961 gtcacccggc aaccttgggc agcagcgaag tcgaggcatt tctgtcctgg ctggcgaacg
4021 agcgcaaggt ttcggtctcc acgcatcgtc aggcattggc ggccttgctg ttcttctacg
4081 gcaaggtgct gtgcacggat ctgccctggc ttcaggagat cggaagacct cggccgtcgc
4141 ggcgcttgcc ggtggtgctg accccggatg aagtggttcg catcctcggt tttctggaag
4201 gcgagcatcg tttgttcgcc cagcttctgt atggaacggg catgcggatc agtgagggtt
4261 tgcaactgcg ggtcaaggat ctggatttcg atcacggcac gatcatcgtg cgggagggca
4321 agggctccaa ggatcgggcc ttgatgttac ccgagagctt ggcacccagc ctgcgcgagc
<210>2
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
CCT GTC C TG GTT ATC GCT G
<210>3
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<400>3
CCA GAA GAA CCA ACA AGA AGA T
<210>4
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>4
CTC GTC TTG CAG TTC ATT
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<400>5
gag agg cta ttc ggc tat
<210>6
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>6
tct gta ctt tcc tgc tgg TGGCT cca gtt c
<210>7
<211>31
<212>DNA
<213>人工序列
<400>7
aaa att gag aga agt cca cc TCGAG tct aga
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>8
TGC GAA AGG CCT TGT GGT AC
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>9
GCA CGG TCT ACG AGA CCT CC
<210>10
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>10
aac tac tgt ctt cac gca GAAAG cgt cta g
<210>11
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>11
acc aca agg cct ttc gcg ACCCA aca cta c
<210>12
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<400>12
agc cca gaa gta ata ccc atg tt
<210>13
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>13
tcc atc cta ttt gtt cct gaa
<210>14
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>14
agt ggg ggg aca tca agc AGCCA t gca aat
<210>15
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<400>15
tca tcc atc cta ttt gtt CCTGG a ggg tac
<210>16
<211>181
<212>DNA
<213>人工序列
<400>16
cggatcaagc gtatgcagcc gccgcattgc
atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg
cccaatagca gccagtccct
<210>17
<211>180
<212>DNA
<213>人工序列
<400>17
cggatcaagc gtatgcagcc gccgcattgc
atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg
cccaatagca gccagtccct
<210>18
<211>180
<212>DNA
<213>人工序列
<400>18
cggatcaagc gtatgcagcc gccgcattgc
atcagccatg atggatactt tctcggcagg agcaaggtga gatgacagga gatcctgccc cggcacttcg
cccaatagca gccagtccct
<210>19
<211>21
<212>DNA
<213>人工序列
<400>19
TGTGT CTGCG GCGTT TTATC A
<210>20
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<400>20
tgcgctgacagccggaacac
<210>21
<211>107
<212>DNA
<213>人工序列
<400>21
Ctc attcagggca ccggacaggt cggtcttgac aaaaagaacc gggcgcccct gcgctgacag ccggaacacg
gcggcatcag agcagccgat tgtctgttgt gccc
权利要求
1、一种PCR定性检测样品中靶核酸的方法中所用的内对照分子的优化量的确定方法，其包括如下步骤
(1)以相同的扩增条件，分别进行k个相同的阴性PCR扩增，所述阴性PCR扩增体系中内对照分子的加入量为No，k≥10；该阴性PCR扩增体系包含靶核酸引物对、内对照分子和内对照引物对，其中不存在靶核酸；
(2)分别检测步骤(1)的阴性PCR扩增后是否扩增出内对照分子，未检测到内对照分子扩增的阴性PCR扩增的个数为t；若t＝0或者t＝k，则调整No，重新从步骤(1)开始进行；若t＝0，提高内对照分子的量；若t＝k，降低内对照分子的量；
(3)根据公式(I)计算临界量Nc
(I)；和
(4)根据Nc确定内对照分子的优化量，内对照分子的优化量介于3.0×Nc至9.2×Nc。
2、根据权利要求1所述的方法，其中k大于等于30。
3、根据权利要求1-2之任一所述的方法，其中内对照分子的优化量介于4.6×Nc至6.9×Nc。
4、根据权利要求3的方法，其中内对照分子的优化量为5.3×Nc。
5、权利要求1-4之任一所述方法确定的内对照分子的优化量在PCR定性检测样品中靶核酸的方法中的应用。
6、根据权利要求5所述的应用，其中PCR定性检测样品中靶核酸的方法中的PCR扩增条件为权利要求1所述方法步骤(1)所述的相同扩增条件。
7、PCR定性检测样品中靶核酸的方法中所用内对照分子的构建方法，其包括选择候选核酸或突变候选核酸成为内对照分子，候选核酸与靶核酸的序列同一性小于20％；所述内对照分子中与内对照引物对退火的序列和靶核酸中与靶核酸引物对退火的序列是不同的，而且内对照分子与内对照引物对的退火温度低于靶核酸与靶核酸引物对的退火温度；
PCR定性检测样品中靶核酸时，内对照分子的优化量由权利要求1-4之任一所述方法确定。
8、根据权利要求7所述的方法，其中候选核酸与靶核酸的序列同一性小于10％。
9、根据权利要求7-8之任一所述的方法，其中所述的候选核酸是如Seq ID No16、Seq ID No17、Seq ID No18或Seq ID No21所示。
10、根据权利要求7-8之任一所述的方法，其中内对照分子中与内对照引物对退火的序列与内对照引物对序列是完全匹配的。
11、根据权利要求10所述的方法，其中所述内对照分子中与内对照引物对退火的序列长度介于10-25个核苷酸。
12、根据权利要求7-8之任一所述的方法，其中内对照分子中与内对照引物对退火的序列与内对照引物对序列是不完全匹配的。
13、根据权利要求12所述的方法，其中所述内对照分子中与内对照引物对退火的序列长度介于25-35个核苷酸。
14、根据权利要求12所述的方法，其中所述不完全匹配的序列是3-7个连续的A或T。
15、权利要求7-14之任一所述方法构建的内对照分子在PCR定性检测样品中靶核酸的方法中的应用。
16、根据权利要求15所述的应用，其中靶核酸引物对和内对照引物对是不同的。
17、根据权利要求15所述的应用，其中靶核酸引物对和内对照引物对是相同的。
18、PCR定性检测样品中靶核酸的方法，其包括如下步骤
(1)对样品进行PCR扩增，PCR扩增体系包含样品、靶核酸引物对、内对照分子、内对照引物对的正向引物；
(2)步骤(1)完成后，加入内对照引物对的反向引物，继续对样品进行PCR扩增；和
(3)步骤(2)完成后，检测是否有扩增的靶核酸；
其中内对照分子的优化量为权利要求1-4之任一所述方法确定的内对照分子的优化量。
19、根据权利要求18所述的方法，其中内对照分子为权利要求7-14之任一所述方法构建的内对照分子。
20、PCR定性检测样品中靶核酸的方法，其中PCR扩增中使用内对照分子，其特征在于，
所述内对照分子为权利要求7-14之任一所述方法构建的内对照分子；和/或
所述内对照分子的使用量为权利要求1-4之任一所述方法确定的内对照分子的优化量。
21、根据权利要求18-20之任一所述的方法，其中所述的内对照分子如Seq ID No16、SeqID No17、Seq ID No18或Seq ID No21所示。
22、用于权利要求18-20之任一所述PCR定性检测样品中靶核酸的方法中的检测试剂盒；所述试剂盒包含SeqID No16、Seq ID No17、Seq ID No18和Seq ID No21所示核酸分子之一或全部。
全文摘要
本发明涉及聚合酶链反应体系中内对照分子的定量方法和内对照分子的构建方法、以及基于其得到的量和/或内对照分子的核酸扩增方法和相应检测试剂盒。另外，本发明还涉及二步法PCR扩增方法和内对照分子或试剂盒的应用等。上述方法用以提高检测灵敏度和/或兼顾检测灵敏度和表征假阴性结果的可靠性，并可以灵活适应PCR扩增体系和检测方式的改变。
文档编号C12Q1/68GK101492744SQ20091011925
公开日2009年7月29日 申请日期2009年3月10日 优先权日2009年3月10日
发明者李丙亮, 杨国翠, 张文艳, 李振勇, 黄道培 申请人:上海浩源生物科技有限公司