专利名称：一种抗昆虫血细胞免疫的蛋白及基因序列的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，涉及一种具有抗昆虫血细胞免疫功能的来自格式线虫(Steinernema glaseri)的表皮蛋白Enol。本发明还涉及该蛋白的氨基酸序列及编码此蛋 白的核苷酸序列。
背景技术：
昆虫病原线虫是一类自然存在于土壤中的昆虫天敌，以感染期线虫通过昆虫的气 孔、口腔和肛门等自然孔口或通过昆虫表皮节间膜进入血腔，将肠道内携带的共生细菌释 放到昆虫血腔，共同抵抗寄主的免疫系统，快速杀死寄主。线虫-共生菌虽然具有抵抗昆虫 免疫系统的能力，但寄主血细胞的快速包被和免疫反应仍然能够杀死线虫和共生菌，特别 是在线虫释放其共生菌之前。因此线虫能否抑制昆虫血细胞免疫并在昆虫体腔中存活，是 决定线虫成功致死昆虫的关键。目前，国内外关于格式线虫表皮蛋白抑制昆虫血细胞免疫 的研究很少，只有Wang and Gaugler发现来源于格式线虫表皮的蛋白能显著提高线虫抗昆 虫血细胞的免疫力，但该研究小组没有获得纯化蛋白及其编码基因。分离纯化昆虫病原线 虫表皮蛋白、克隆编码基因的研究将有助于阐明线虫抵抗昆虫血细胞免疫的作用机制，为 开拓抗昆虫免疫蛋白在害虫生物防治上的应用奠定基础。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗昆虫血细胞免疫的线虫表皮蛋白及其编码基因，从而 拓展其在农业害虫防治上的应用。本发明的主要技术方案是提取纯化格式线虫(Steinernema glaseri)的表皮蛋 白，测定其肽段序列，再根据肽段序列克隆表皮蛋白的编码基因。本发明的线虫表皮蛋白具有抗昆虫血细胞免疫的作用。具体技术方案如下(1)收集人工培养的格式线虫，先后用0. 5%次氯酸钠和35%乙醇处理线虫，提取 获得线虫表皮蛋白粗品；用8%制备型Native-PAGE和Mini Whole Gel Eluter (Bio-Rad) 获得纯化的表皮蛋白。(2)通过大蜡螟血细胞ROS水平检测等方法确定表皮蛋白的生物活性。(3)采用液谱-电喷雾-质谱(LC-ESI-MS/MS)获得表皮蛋白的肽段序列。(4)根据肽段序列设计简并引物，PCR扩增获得DNA片段，通过5’和3’ -RACE获 得表皮蛋白全长基因enol。(5)原核表达enol，确定表达蛋白抗昆虫血细胞免疫的功能。
具体实施例方式下面通过具体实例进一步说明本发明特点。实施例1线虫的培养与收集
采用人工培养基(主要含豆粉、面粉、鸡蛋、动物肝脏等)培养格氏线虫NC品系 [Steinernema glaseri (NC strain)]，培养时在500ml锥形瓶盛入80g以海绵做载体的人 工培养基，在25°C恒温培养室中培养21天。在自来水中反复通气清洗线虫lh，收集的线虫 用终浓度0. 5%次氯酸钠处理15min，自来水反复清洗去除次氯酸钠后用蒸馏水通气处理 48h，最后用细纱布过滤收集线虫。实施例2线虫表皮蛋白的提取与纯化将线虫在预冷的35%乙醇中浸提30min，细纱布过滤收集的滤液为蛋白粗提液。 将蛋白粗提液冷冻干燥成干粉。取干粉溶于Mi 11 iQ水至蛋白终浓度2mg/ml，用8 %制备型 Native-PAGE 分离(80V 20min, 180V lh30min)，随后在 Mini Whole Gel Eluter (Bio-Rad) 上进行电洗脱(100mA25min)，分别收集洗脱组分，用12 % SDS-PAGE分析各组分纯度，并用 BCA assay kit (Pierce)测定各组分浓度，将各组分的蛋白浓度用MilliQ水调整为20μ g/ml。实施例3大蜡螟血细胞活性氧(ROS)水平检测表皮蛋白活性用75%的酒精对大蜡螟五龄幼虫进行表面消毒，剪断幼虫前足，用移液器从断口 处吸取10 μ 1血淋巴(约含100，000个血细胞)，迅速加入到含0. 1 %的DCFH-DA的格氏昆 虫培养基(Grace insect culture medium, Sigma G-9771)中，室温孵育 30min。用格氏昆 虫培养基洗涤孵育后的血细胞3次，以除去细胞外的DCFH-DA，随后在含有10 μ g/ml LPS和 20 μ g/ml表皮蛋白组分的格氏昆虫培养基中37°C孵育30min，并以含有10 μ g/ml LPS和 20 μ g/ml BSA(Merck-Calbiochem)的格氏昆虫培养基为对照。用移液枪轻柔洗打吹散细胞 团，取样观察。细胞的荧光定性观察在01ympUsBX51荧光显微镜(Olympus)下进行，定量检 测则在FACS Vantage流式细胞仪(Beeton Dickinson)中进行。荧光图像和数据采集使用 的激发波长是488nm，发射波长是535nm。结果表明，表观分子量为47kD的表皮蛋白组分其 活性氧水平比BSA的明显低，说明该组分具有抗昆虫血细胞免疫活性。实施例4大蜡螟体内血细胞吞噬分析检测表皮蛋白活性首先将表皮蛋白与荧光微球交联，将纯化的表皮蛋白和BSA分别溶于MES缓冲液 (50mM,pH6. 0)中，调整蛋白终浓度为0. lmg/ml。取2 μ 1羧基修饰的微球珠(3. 6 X IO7/μ 1， F — 8821，Invitrogen)加入20 μ 1的蛋白溶液中，混勻后室温孵育15min。随后加入20 μ 1 1-乙基-3-(3-二甲基-氨丙基)-碳化二亚胺(EDAC)，室温孵育2h。向混合物中加入甘 氨酸至终浓度IOOmM,室温孵育30min以终止反应。将微球在4000g离心30min，尽除上清， 然后用PBS清洗3次(每次5min)，最后重悬于PBS中并调至荧光微球浓度为2. OX IO5个 /μ 1。进行体内血细胞吞噬分析时，向5龄大蜡螟幼虫体内注入5μ 1交联了蛋白的微球珠 (每只幼虫含1 X IO6个微球珠)。注射12h后取幼虫血淋巴5 μ 1与50 μ 1的格氏昆虫培养 基混合，滴加到凹面载玻片上，37°C静置5min。用500 μ 1含2 μ g/ml DAPI (6-联脒-2-苯 基吲哚)的甲醇清洗载玻片一次，再加入100 μ 1的2μ g/mlDAPI，37°C孵育15min，弃去染 色液，甲醇清洗一次，滴加10(^1 83保存。荧光观察在017111 115^(51荧光显微镜(Olympus) 下进行，激发波长350nm。观察结果表明，表观分子量为47kD的表皮蛋白组分被大蜡螟血细 胞吞噬吸附明显少于BSA，说明该组分具有抗吞噬作用。 实施例5液谱-电喷雾质谱(LC-ESI-MS/MS)分析获得表皮蛋白的肽段序列
将电洗脱所得的47kD表皮蛋白进行蛋白双向电泳，挖取蛋白斑点，经胰蛋白酶、 凝乳蛋白酶、V8酶分别酶解后，采用液谱-电喷雾质谱(LC-ESI-MS/MS)获得该蛋白的2段肽段序列，其序列为 YGLDATAVGDEGGFAPNIQDNK 和 AAVPSGASTGIHEALELR。实施例6表皮蛋白基因克隆用生物信息学方法分析，发现以上2个肽段与多个物种的烯醇化酶高度同源，包括秀丽隐杆线虫、单一异尖线虫、旋毛线虫、拟南芥、番茄和油菜等，根据以上 物种相应蛋白保守区域的保守序列设计引物5，-GAYTCMCGYGGMAAYCCAACYGTTGA-3， 禾口 5，-GTSACKGAWCCRATTTGRTT-3，，PCR(94 "C 3min ；94 "C 60s, 50 "C 30s, 72 "C 70s, 35cycles ；72 V IOmin ；4 °C ^ )获得1071bp的阳性片段；然后再使用TaKaRa公司 的试剂盒进行RACE实验以获得包括完整ORF 的DNA片段，3，RACE设计的引物为 5，-TACCGGACTGGTGTCCATCGGCAT-3，和 5，-AGTCGTTCATCAAGGACTATCCCGT-3，，5，RACE 设计的 引物为 OUTER :5，-ACGACGGGATAGTCCTTGATG-3，和 INNER :5，-AGCTTGATAGCGGTGTTGAGG-3，。 将上述实验得到的核苷酸片段进行拼接后获得一个大小为1311bp的完整阅读框的核苷酸 序列，将其命名为enol基因(SEQ ID NO 1)，其推测的氨基酸序列(SEQ ID NO 1)中包含实 施例5中获得的2个肽段，确认获得的enol基因正确。通过GenBank比对，获知此种蛋白 与多个物种的烯醇化酶具有较高的同源性，其中和秀丽线虫(Caenorhabditis elegans)烯 醇化酶的相似性为86%。提取格式线虫的RNA，根据enol基因序列设计引物进行RT-PCR，克隆到全长的格 式线虫enol基因。实施例7格式线虫enol基因的表达、蛋白纯化及功能验证通过PCR反应在enol基因两端分别引入EcoR I和Xho I两个酶切位点，双酶切 后与同样双酶切的载体PGEX-6P-1连接；筛选阳性克隆，并将质粒转入大肠杆菌表达菌株 BL21，IPTG诱导表达；收集细胞，超声破碎，离心取上清液在AKTA EXPL0ER 10上进行纯化， 依次使用GSTrap FF、HiTrap Desalting和Mono Q三种层析柱纯化，再经PreScission酶 切得到高纯度表达蛋白Enol，其表观分子量为47kD。将60头生长均一的5龄大蜡螟幼虫分为三组，分别从腹腔注入10μ 1 PBS、 BSAdOOy g/ml)和表达蛋白(100 μ g/ml)，室温孵育20小时；用75%酒精表面消毒后剪前 足取血淋巴，每只幼虫取20 μ 1血淋巴并加入到180 μ 1 PBS中混勻，用血细胞计数器计数 血细胞数目。结果表明，enol基因的表达产物具有裂解血细胞活性，能降低大蜡螟幼虫血 细胞数量达60%。序列表<110>中国农业科学院植物保护研究所<120> 一种抗昆虫血细胞免疫的蛋白及基因序列<130>05-01<160>1<170>PatentIn version 3. 1<210>1<211>1311<212>DNA<213> 格式线虫(Steinemema glaseri)<400>1
ATGCCTATCA CTCGCATCCA CGCTCGTCAG ATCTACGACT CCCGTGGCM CCCCACCGTC 60GMGTCGACC TCCACACCGA GMGGGTGTG TTCCGTGCTG CTGTCCCCAG CGGAGCCTCC 120ACTGGCATCC ATGAGGCTCT GGMCTCCGC GACCAGGACA AGGCTGTCCA CCACGGAMG 180GGAGTCGAGA AGGCCGTCGC CMCGTCATC GAGMGATCG CGCCGGCCCT CATCGCCMG 240MCTTCGATG TGACCGACCA AGTCGCCATC GACMGTTCA TGATCGAGCT TGACGGMCC 300GAGMCMGT CGAGCCTCGG AGCCMCGCC ATCCTCGGCG TGTCGCTCGC CGTCGCCMG 360GCTGGTGCCG TGCACMGGG AGTGCCCCTC TACMGCACT TGGCCGATCT CGCCGGAGTG 420AGCMGGTTG TCCTCCCCGT TCCTGCCTTC MCGTCATCA ACGGAGGCTC GCACGCCGGA 480MCMGCTCG CCATGCAGGA GTTCATGATC CTCCCCGTCG GAGCCMGAG CTTCMGGAG 540GCCATGCGCA TGGGATCCGA GATCTACCAC CACCTCMGG CCGAGATCM GMGCGCTAC 600GGACTCGACG CCACCGCCGT CGGAGATGAG GGAGGATTCG CCCCCMCAT CCAGGACMC 660MGGAGGGTC TTGACCTCCT CMCACCGCT ATCMGCTTG CCGGATATAC CGGACTGGTG 720TCCATCGGCA TGGACGTCGC CGCCTCCGAG TTCTACMGG AGMCGAGM GMGTACGAC 780TTGGACTTCA AGMCCCCM CTCCGACCCC AGCMGTGGA TCMCGGAGA CGAGCTCGCC 840GCGCTCTACC AGTCGTTCAT CMGGACTAT CCCGTCGTCT CCATCGAGGA CGCCTTCGAC 900CAGGACGACT GGGCGMCTG GAGCMGCTG ATGGGCMCA CCTCCATCCA GCTCGTCGGA 960GATGATCTCA CCGTCACCM CCCCMGCGC ATCCAGATGG CCGTCGACCA GMGGCGTGC 1020MCTGCCTTC TCCTCAAGGT CMCCAGATC GGATCCATCA CCGAGTCCAT CGAGGCCGCC 1080MGCTGTCCC GCGCCAACGG ATGGGGCGTC ATGGTTTCCC ACCGTTCTGG AGAAACCGAA 1140GACTGCTTCA TCGCTGATCT TGTTGTTGGC CTCGCTACTG GACAGATCM GACCGGAGCC 1200CCTTGCCGAT CTGAGCGTCT CGCCMGTAC MCCAGCTTC TTCGCATCGA GGAGGAGCTC 1260GGAGCCGATG CCGTGTACGC CGGAGAGMC TTCCGCMCC CCCAGATCTA A1311Met Pro lie Thr Arg lie His Ala Arg Gln lie Tyr Asp Ser Arg Gly151015Asn Pro Thr Val Glu Val Asp Leu His Thr Glu Lys Gly Val Phe Arg202530Ala Ala Val Pro Ser Gly Ala Ser Thr Gly lie His Glu Ala Leu Glu354045Leu Arg Asp Gln Asp Lys Ala Val His His Gly Lys Gly Val Glu Lys505560Ala Val Ala Asn Val lie Glu Lys lie Ala Pro Ala Leu lie Ala Lys65707580Asn Phe Asp Val Thr Asp Gln Val Ala lie Asp Lys Phe Met lie Glu859095Leu Asp Gly Thr Glu Asn Lys Ser Ser Leu Gly Ala Asn Ala lie Leu10005110Gly Val Ser Leu Ala Val Ala Lys Ala Gly Ala Val His Lys Gly Val11512025
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130135140Leu Pro Val Pro Ala Phe Asn Val lie Asn Gly Gly Ser His Ala Gly145150155160Asn Lys Leu Ala Met Gln Glu Phe Met lie Leu Pro Val Gly Ala Lys165170175Ser Phe Lys Glu Ala Met Arg Met Gly Ser Glu lie Tyr His His Leu180185190Lys Ala Glu lie Lys Lys Arg Tyr Gly Leu Asp Ala Thr Ala Val Gly195200205Asp Glu Gly Gly Phe Ala Pro Asn lie Gln Asp Asn Lys Glu Gly Leu210215220Asp Leu Leu Asn Thr Ala lie Lys Leu Ala Gly Tyr Thr Gly Leu Val225230235240Ser lie Gly Met Asp Val Ala Ala Ser Glu Phe Tyr Lys Glu Asn Glu245250255Lys Lys Tyr Asp Leu Asp Phe Lys Asn Pro Asn Ser Asp Pro Ser Lys260265270Trp lie Asn Gly Asp Glu Leu Ala Ala Leu Tyr Gln Ser Phe lie Lys275280285Asp Tyr Pro Val Val Ser lie Glu Asp Ala Phe Asp Gln Asp Asp Trp290295300Ala Asn Trp Ser Lys Leu Met Gly Asn Thr Ser lie Gln Leu Val Gly305310315320Asp Asp Leu Thr Val Thr Asn Pro Lys Arg lie Gln Met Ala Val Asp325330335Gln Lys Ala Cys Asn Cys Leu Leu Leu Lys Val Asn Gln lie Gly Ser340345350lie Thr Glu Ser lie Glu Ala Ala Lys Leu Ser Arg Ala Asn Gly Trp355360365Gly Val Met Val Ser His Arg Ser Gly Glu Thr Glu Asp Cys Phe lie370375380Ala Asp Leu Val Val Gly Leu Ala Thr Gly Gln lie Lys Thr Gly Ala385390395400Pro Cys Arg Ser Glu Arg Leu Ala Lys Tyr Asn Gln Leu Leu Arg lie405410415Glu Glu Glu Leu Gly Ala Asp Ala Val Tyr Ala Gly Glu Asn Phe Arg420425430Asn Pro Gln lie43权利要求
一种编码线虫表皮蛋白的基因enol，其特征在于它是由格式线虫(Steinernema glaseri)产生的，其核苷酸序列为 1 ATGCCTATCA CTCGCATCCA CGCTCGTCAG ATCTACGACT CCCGTGGCAA CCCCACCGTC 61 GAAGTCGACC TCCACACCGA GAAGGGTGTG TTCCGTGCTG CTGTCCCCAG CGGAGCCTCC 121 ACTGGCATCC ATGAGGCTCT GGAACTCCGC GACCAGGACA AGGCTGTCCA CCACGGAAAG 181 GGAGTCGAGA AGGCCGTCGC CAACGTCATC GAGAAGATCG CGCCGGCCCT CATCGCCAAG 241 AACTTCGATG TGACCGACCA AGTCGCCATC GACAAGTTCA TGATCGAGCT TGACGGAACC 301 GAGAACAAGT CGAGCCTCGG AGCCAACGCC ATCCTCGGCG TGTCGCTCGC CGTCGCCAAG 361 GCTGGTGCCG TGCACAAGGG AGTGCCCCTC TACAAGCACT TGGCCGATCT CGCCGGAGTG 421 AGCAAGGTTG TCCTCCCCGT TCCTGCCTTC AACGTCATCA ACGGAGGCTC GCACGCCGGA 481 AACAAGCTCG CCATGCAGGA GTTCATGATC CTCCCCGTCG GAGCCAAGAG CTTCAAGGAG 541 GCCATGCGCA TGGGATCCGA GATCTACCAC CACCTCAAGG CCGAGATCAA GAAGCGCTAC 601 GGACTCGACG CCACCGCCGT CGGAGATGAG GGAGGATTCG CCCCCAACAT CCAGGACAAC 661 AAGGAGGGTC TTGACCTCCT CAACACCGCT ATCAAGCTTG CCGGATATAC CGGACTGGTG 721 TCCATCGGCA TGGACGTCGC CGCCTCCGAG TTCTACAAGG AGAACGAGAA GAAGTACGAC 781 TTGGACTTCA AGAACCCCAA CTCCGACCCC AGCAAGTGGA TCAACGGAGA CGAGCTCGCC 841 GCGCTCTACC AGTCGTTCAT CAAGGACTAT CCCGTCGTCT CCATCGAGGA CGCCTTCGAC 901 CAGGACGACT GGGCGAACTG GAGCAAGCTG ATGGGCAACA CCTCCATCCA GCTCGTCGGA 961 GATGATCTCA CCGTCACCAA CCCCAAGCGC ATCCAGATGG CCGTCGACCA GAAGGCGTGC1021 AACTGCCTTC TCCTCAAGGT CAACCAGATC GGATCCATCA CCGAGTCCAT CGAGGCCGCC1081 AAGCTGTCCC GCGCCAACGG ATGGGGCGTC ATGGTTTCCC ACCGTTCTGG AGAAACCGAA1141 GACTGCTTCA TCGCTGATCT TGTTGTTGGC CTCGCTACTG GACAGATCAA GACCGGAGCC1201 CCTTGCCGAT CTGAGCGTCT CGCCAAGTAC AACCAGCTTC TTCGCATCGA GGAGGAGCTC1261 GGAGCCGATG CCGTGTACGC CGGAGAGAAC TTCCGCAACC CCCAGATCTA A。
2.根据权利要求1所述的基因enol编码的线虫表皮蛋白Enol，其氨基酸序列为 1 MPITRIHARQ IYDSRGNPTV EVDLHTEKGV FRAAVPSGAS TGIHEALELR DQDKAVHHGK61 GVEKAVANVI EKIAPALIAK NFDVTDQVAI DKFMIELDGT ENKSSLGANA ILGVSLAVAK 121 ENKSSLGANA ILGVSLAVAK SKVVLPVPAF NVINGGSHAG NKLAMQEFMI LPVGAKSFKE 181 AMRMGSEIYH HLKAEIKKRY GLDATAViiDE GGFAPNIQDN KEGLDLLNTA IKLAGYTGLV 241 SIGMDVAASE FYKENEKKYD LDFKNPNSDP SKffINGDELA ALYQSFIKDY PVVSIEDAFD 301 QDDffANWSKL MGNTSIQLVG DDLTVTNPKR IQMAVDQKAC NCLLLKVNQI GSITESIEAA 361 KLSRANGffGV MVSHRSGETE DCFIADLVVG LATGQIKTGA PCRSERLAKY NQLLRIEEEL 421 GADAVYAGEN FRNPQI。
3.根据权利要求1所述的基因enol和权力要求2所述的蛋白Enol，抑制昆虫血细胞 免疫的功能。
4.根据权利要求1所述的基因enol和权力要求2所述的蛋白Enol，用于抑制昆虫血 细胞免疫的用途。
全文摘要
本发明涉及一种蛋白，其特点是根据格式线虫(Steinernema glaseri)表皮蛋白Enol的肽段序列克隆到表皮蛋白基因enol，该蛋白具有抗昆虫血细胞免疫的功能。本发明还涉及该蛋白及其多核苷酸的制备方法和用途。一种抗昆虫血细胞免疫的蛋白及基因序列。
文档编号C12N15/12GK101818153SQ20091011990
公开日2010年9月1日 申请日期2009年2月26日 优先权日2009年2月26日
发明者刘华, 姚庆, 张雨良, 曾洪梅, 杨怀文, 杨秀芬, 袁京京, 邱德文 申请人:中国农业科学院植物保护研究所