Gif1启动子及其应用的制作方法

专利名称：Gif1启动子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明属于植物学和基因工程领域。具体而言，本发明涉及新的植物(优 选作物)组织特异性表达启动子，本发明还涉及所述启动子的用途，尤其在启 动目的基因在植物组织中特异性表达的基因工程中的用途。
背景技术：
当前，对于农作物产量改良的研究主要集中在以下几个方面1.增加作 物的源，即加强作物的光合作用；2.增加作物库的大小；3.提高作物光合产 物由源向库运输的能力。
在很多作物中，籽粒是判断该作物优劣的标准，直接关系到作物的产量和 品质。尽管人们采取了许多方式来提高农作物的产量和对农作物进行改良，然 而，目前还缺乏有效的手段。例如，我国的主要粮食作物水稻，当前的许多水 稻高产栽培品种尤其超级杂交稻和大穗大粒品种存在籽粒灌浆不饱满的情况， 这在很大程度上影响了水稻产量的进一步提高。
植物的根部对其生长、营养吸收、能量传递等均具有重要作用。改善作物 根部的吸收、传输、生长等能力有助于提高作物的总体生长和品质。植物的节 间是物质、能量运输的枢纽，也对植物的支撑起到一定作用。
对于除作物以外的其它植物而言，种子、节间或根本身或整株植物可能存 在其经济价值或实用价值，例如观赏等。因此，组织特异性地改造这些植物， 是提高其品质的有用手段。
组织特异性表达启动子可以驱动靶基因在特定的组织或细胞表达，而不影 响植物其它组织的生理活动。
因此，为了改良植物(尤其是作物)的品质性状或调控作物籽粒次生代谢， 本领域迫切需要开发新的特异性良好的植物组织(尤其是在种子、根部、节间等 部位)特异性表达启动子，从而实现农作物或其它经济植物产量和品质的提高
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的植物(尤其是作物)组织特异性表达启动 子，所述启动子可指导目的基因特异性地在植物籽粒、根部或节间等组织中表达。
本发明的目的还在于提供所述启动子的用途。
在本发明的第一方面提供了一种分离的多核苷酸，其选自下组
(1) 由SEQ ID NO: 3的1-2379位所示的序列构成的核苷酸序列；
(2) 具有SEQ ID NO: 3中1-2379位所示的核苷酸序列且能启动目的基 因在植物中组织特异性表达的核苷酸序列；
(3) SEQ ID NO: 3中1-2379位所示的核苷酸序列的片段，所述片段能 启动目的基因在植物中组织特异性表达；
(4) 在严格条件下能够与(l)、 (2)或(3)限定的核苷酸序列杂交且能启
动目的基因在植物中组织特异性表达的核苷酸序列；
(5) 与(1)、 (2)或(3)限定的核苷酸序列有70%、 80%、 85%、 90%、 95
%以上相同性且能启动目的基因在植物中组织特异性表达的核苷酸序列；或
(6) 与(1)-(5)任一项所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
在一个优选例中，所述多核苷酸的序列如SEQIDN0: 3的l-2379位所示。
在一个优选例中，所述植物是作物，优选禾本科植物，更优选所述的禾本 科作物选自水稻、小麦、大麦、玉米、或高粱。
在一个优选实施方式中，所述目的基因选自编码具有SEQ ID NO: 2氨 基酸序列的作物籽粒灌浆蛋白、以及与作物淀粉转运、积累相关的基因。
在一个优选例中，所述的目的基因是外源基因。
在另一优选例中，所述的目的基因是结构基因。
在另--优选例中，所述的目的基因是与作物籽粒的品质、产量、抗性或代 谢相关的基因。
在一个优选例中，所述目的基因为编码具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的 作物籽粒灌桨蛋白。
在本发明的另一优选实施方式中，特异性表达所述目的基因的组织是种 子、根部和/或节间，即种子、根部、与节间中的一者、两者或三者。
在一个优选例中，特异性表达所述目的基因的组织是种子。在本发明的第二方面，提供了本发明多核苷酸作为启动植物组织特异性地 表达目的基因的启动子的用途。
在一个优选例中，所述植物是作物，优选为禾本科植物，更优选所述的禾 本科植物选自水稻、小麦、大麦、玉米、或高粱。
在一个优选例中，所述目的基因特异性表达的组织是种子、根部和/或节 间，优选种子。
在本发明的第三方面中，提供了一种载体，所述的载体含有本发明前述的 多核苷酸，作为启动子元件。
在一个优选实施方式中，所述的载体还含有与所述的核酸可操作地连接的
H的基因。
在另一个优选实施方式中，所述的目的基因选自编码具有SEQIDNO: 2 氨基酸序列的作物籽粒灌浆蛋白，以及与作物淀粉转运、积累相关的基因。
在…-个优选例中，所述的目的基因位于所述多核苷酸的下游，且与所述启
动子的间隔小于1000bp，优选小于500bp，更优选小于100bp，最优选小于50bp。
在本发明的第四方面中，提供了一种遗传工程化的宿主细胞，所述的细胞 含有本发明前述的载体；或其基因组中整合有外源的本发明前述的多核苷酸。
在本发明的第五方面中，提供了一种制备转基因植物的方法，所述转基因 植物的组织特异性表达目的基因，所述的方法包括
(a) 提供含有作为启动子元件的本发明的多核苷酸以及与所述多核苷酸可 操作地连接的目的基因的构建物；
(b) 将所述构建物导入植物细胞、组织或器官；
(c) 选出导入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞、组 织或器官；和
(d) 使所述植物细胞、组织或器官再生成植株。 在一个优选例中，所述植物为作物。
在一个优选例中，所述目的基因特异性表达的组织是种子、根部和/或节 间，优选种子。在本发明的第六方面中，提供了一种转基因植物。 在一个优选例中，所述转基因植物是用本发明前述方法制得的。 在另一优选例中，所述转基因植物是含有本发明前述的多核苷酸或本发明 前述的载体的植物，优选所述转基因植物为作物，更优选为禾本科植物，更优 选所述的禾本科植物选自水稻、小麦、大麦、玉米、或高粱。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而
易见的。


图l显示了本发明优选实施方式中的GIF1启动子的序列。
图2显示了在本发明启动子作用下GUS基因的组织特异性。其中
根；
伸长的节间； 开花后4天的种子； 开花后IO天的种子； 开花后25天的种子；
节间；
开花后2天的种子； 开花后6天的种子； 开花后15天的种子； 开花后IO天的颖壳；
开花后io天种子的横切面。 图3显示了在本发明启动子作用下G工F1基因在植物不同部位的表达情况。 图3A:突变体和野生型种子中GIF1基因的表达情况。 图3B: GIF1基因在水稻幼苗、叶片、根、节间和穗的表达情况。其中， R:水稻幼苗的根； L:水稻叶片；
YL:水稻幼苗叶片； I:水稻节间；
P:水稻穗子； Ubi-1:泛素基因。
图3C: GIF1基因在开花后不同时间的表达情况(数字指开花后天数)。
具体实施例方式
本发明人经过广泛而深入的研究，首次从植物籽粒灌浆基因(GIF1，其序 列如SEQ ID NO: 3所示)中分离到一个能够指导目的基因在作物中组织特异性 表达的启动子，该启动子来源于GIF1基因(C/尸厶fr3几//7co/ p7e" /^7h'y^ 7)的上游区域，因此本发明人将之命名为GIF1启动子。所述的启动子对于定点地改良植物品质是特别有用的。在此基础上完成了本发明。 术语
如本文所用，所述的"植物"包括但不限于作物、具有经济价值或实用 价值的其它植物等。
如本文所用，所述的"作物"包括但不限于禾本科植物。更优选的，所 述的禾本科植物包括但不限于水稻，小麦、大麦、玉米、高粱等。
如本文所用，"分离的"是指物质从其原始环境中分离出来(如果是天然的 物质，原始环境即是天然环境)。如活体细胞内的天然状态下的多聚核苷酸和多 肽是没有分离纯化的，但同样的多聚核苷酸或多肽如从天然状态中同存在的其 他物质中分开，则为分离纯化的。
如本文所用，所述的"可操作地连接"是指两个或多个核酸区域或核酸序 列的功能性的空间排列。例如启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特 定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被 "可操作地连接"到该核酸序列上。
如本文所用，所述的"启动子"或"启动子区(域)"是指一种核酸序列， 其通常存在于目的基因编码序列的上游(5'端)，能够引导核酸序列转录为 mRNA。 一般地，启动子或启动子区提供RNA聚合酶和正确起始转录所必需的 其它因子的识别位点。在本文中，所述的启动子或启动子区包括启动子的变体， 其通过插入或删除调控区域，进行随机或定点突变等来获得。
如本文所用，术语"特异性表达"是指目的基因在特定的时间和/或特定 的组织表达。"组织特异性启动子"又称"器官特异性启动子"，在这类启动 子调控下，基因往往只在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节 的特性。本发明中，所述的"组织特异性启动子"是指导基因在植物中组织特 异性表达启动子，所述组织选自籽粒、根部或节间。
通常，如果在某组织或器官中mRNA以比在其它组织或器官中高至少1 倍，优选高至少5倍，优选至少高10倍，更优选至少高100倍，最优选至少 高1000倍水平被表达，则该启动子被认为是组织或器官特异性的。
如本文所用，"外源的"或"异源的"是指来自不同来源的两条或多条核 酸或蛋白质序列之间的关系。例如，如果启动子与目的基因序列的组合通常不 是天然存在的，则启动子对于该目的基因来说是外源的。特定序列对于其所插入的细胞或生物体来说是"外源的"。
如本文所用，"顺式调控元件"是指对基因的转录起始和转录效率起调节作用的保守性碱基序列。
如本文所用，"目的基因"是指可由本发明的启动子指导表达的基因。合适的目的基因包括但不限于改良作物籽粒品质、产量、性状或代谢相关的基因(例如编码具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的作物籽粒灌浆蛋白)、以及与作物淀粉转运、积累相关的基因。
植物组织特异性表达启动子
本发明提供一种植物组织特异性表达的多核苷酸(启动子)，所述的核酸具有选自下组的序列
(1) 由SEQ ID NO: 3的1-2379位所示的序列构成的核苷酸序列；
(2) 具有SEQ ID NO: 3中1-2379位所示的核苷酸序列且能启动目的基因在植物中组织特异性表达的核苷酸序列；
(3) SEQ ID NO: 3中1-2379位所示的核苷酸序列的片段，所述片段能启动目的基因在植物中组织特异性表达；
(4) 在严格条件下能够与(l)、 (2)或(3)限定的核苷酸序列杂交且能启动目的基因在植物中组织特异性表达的核苷酸序列；
(5) 与(1)、 (2)或(3)限定的核苷酸序列有70%、 80%、 85%、 90%、 95
%以上相同性且能启动目的基因在植物中组织特异性表达的核苷酸序列；或
(6) 与(1)-(5)任一项所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。在本发明的一个实施方式中，所述多核苷酸的序列如SEQ IDN0:3的1-2379
位所示。
在本发明的另一个实施方式中，所述植物是作物，优选禾本科植物，包括但不限于水稻、玉米、小麦、大麦、或高粱等。
在本发明的另一个实施方式中，特异性表达所述目的基因的组织是种子、根部和/或节间，优选种子。
也可通过基因工程方法在该启动子中加入增强子等顺式作用元件达到进一歩调控基因表达的作用。
多核苷酸的杂交是本领域技术人员熟知的技术，特定的一对核酸的杂交特性指示它们的相似性或同一性。因此，本发明还涉及与前述指定的核苷酸序列杂交且两个序列之间具有至少50%，较佳地至少70%，更佳地至少80% (例如85%、 90%、 95%、 96%、 97%、 98%、或99%)相同性的多核苷酸。
本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。"严格条件"是指(l)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2XSSC， 0. 1%SDS， 60°C;或(2)杂交时加有变性剂，如50。/。(v/v)甲酰胺，0. 1%小牛血清/O. l%Ficoll， 42。C等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在50%，优选60%以上、65%以上、70%以上、75%以上、80%以上、85%以上或90%以上，更优选是95%以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸也具有指导目的基因在植物中组织特异性表达的功能。
本发明还包括与本发明的任一种启动子序列具有50%或以上(优选60%以上，70°/。以上，80%以上，更优选90%以上，最优选95%以上)相同性的核酸，所述核酸也具有指导目的基因在植物中组织特异性表达的功能。"相同性"是指按照位置相同的百分比，两条或多条核酸之间的相似水平(即序列同源性、相似性或同一性)。
在本发明启动子的指导下，可以使P-葡萄糖苷酶(GUS)基因特异地在水稻、小麦、大麦、玉米、高粱等禾本科植物的籽粒、根部或节间中表达。因此可见，本发明的启动子是--种组织或器官特异性的启动子。所述的启动子对于定点地改良植物的品质是特别有用的。
p-葡萄糖苷酶(GUS)能催化裂解一系列的(3-葡萄糖苷，产生具有发色团或荧光的物质，可用分光光度计、荧光计或组织化学等方法对GUS活性进行定量和空间定位分析。在本技术领域中，GUS基因己被广泛地用作转基因植物、细菌和真菌的报告基因，特别是其可被用于研究外源基因表达的具体细胞和组织部位。
本发明的组织特异性启动子在理论研究和作物改良中具有重要的应用价值。这些启动子可以被应用于标记特定组织，引导特定的功能基因在特定的组织中表达，以及应用于特有组织的生长发育研究和针对性改良。本发明的启动子对于改良植物的品质或表型(尤其是作物籽粒(例如水稻籽粒))是特别有用的。
目的基因
本发明的启动子可以被可操作地连接到目的基因上，该目的基因相对于启动子而言可以是外源(异源)的。对所述目的基因的核酸序列没有特别的限制(如一种结构性核酸序列)，所述的目的基因优选编码具有特定功能的蛋白，例如某些在农业或植物改良上具有重要特性或功能的蛋白。
合适的目的基因包括但不限于改良作物品质、性状或代谢相关的基因。例如，所述的目的基因选自与作物籽粒的品质、产量、抗性或代谢相关的基因(例如作物灌浆蛋白基因(GIF1基因))，以及与作物淀粉转运、积累相关的基因。
本发明的启动子还可以被可操作地连接到被改进的目的基因序列上，该目的基因相对于启动子是外源(异源)的。所述的目的基因可以被改进来产生各种期望的特性。例如，目的基因可以被改进来增加必需氨基酸的含量，提高氨基酸序列的翻译，改变翻译后的修饰(如磷酸化位点)，将翻译产物转运到细胞外，改善蛋白的稳定性，插入或删除细胞信号等。
此外，启动子和目的基因可以设计成下调特定基因。这一般是通过将启动子连接到目的基因序列上来实现，该序列以反义反向被引导。本领域的普通技
术人员熟悉这种反义技术。任何核酸序列可以以这种方式被调节。载体和宿主细胞
本发明的任何一种前述的启动子和/或目的基因序列可被包含在重组载体中。
作为一种方式，所述的重组载体包括本发明的启动子，在所述启动子的下游包含多克隆位点或至少一个酶切位点。当需要表达目的基因时，将目的基因连接入适合的多克隆位点或酶切位点内，从而将目的基因与启动子可操作地连接。
作为另一种方式，所述的重组载体包括(从5'到3'方向)引导目的基因转
录的启动子，和目的基因。如果需要，所述的重组载体还可以包括3，转录终止/-， 3'多聚核苷酸化信号，其它非翻译核酸序列，转运和靶向核酸序列、抗性选择标记、增强子或操作子。
用于制备重组载体的方法是本领域熟知的。术语"重组表达载体"指本领域熟知的细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒或其他载体。总之，只要其能够在宿主体内复制和稳定，任何质粒和载体都是可以被釆用的。
本领域的技术人员熟知的方法能用于构建含有本发明所述的启动子和/或
目的基因序列的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。
此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状，如二氢叶酸还原酶、新霉素抗性、潮霉素抗性以及绿色荧光蛋白(GFP)等。
重组载体中除了含有本发明的启动子，还可含有一种或多种其它启动子。所述的其它启动子例如是组织特异性的、组成型的或诱导型的。例如甘露氨酸合成酶的花椰菜花叶病毒19S和35S(CaMV19S CaMV35S)、增强的CaMV、烟草RB7等。
包含上述适当的启动子和目的基因的载体，可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如植物细胞。代表性例子有大肠杆菌，链霉菌属、农杆菌；真菌细胞如酵母；植物细胞等。本领域一般技术人员都清楚如何选择适当的载体和宿主细胞。
用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl2法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCb。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔、脂质体包装等。转化植物也可使用农杆菌转化或基因枪转化等方法，例如叶盘法、幼胚转化法、花芽浸泡法等。对于转化的植物细胞、组织或器官可以用常规方法再生成植株，从而获得转基因的植物。
例如，可通过叶圆片转化-再生程序(如Horsch等人(1985) Science 227:1229所述)将融合基因导入植物内。也可采用其它转化方法，如PEG法、基因枪法、电激法(Horsch等人，1984， Scienc 223:496， Barton等人，1983， Cell 32:1033， Liu等人，Acta Phytophysiol Sin, 21:195-205)，这也在本发明范围内。但是这些方法有操作复杂、外源基因插入的多拷贝性和不完整性 及较高比例的不育植株等缺点(Potrykus 1990， Bio/Technol， 8:535-542; Finnegan和McElroy, 1994，Bio/Technol. 12:883-888)。
作为一种方式，制备转基因植物的方法是将携带启动子和目的基因(两者可操作地连接)的双元载体转入农杆菌，农杆菌再将含启动子和目的基因的载体片段整合到植物的染色体上。涉及的转基因受体植物例如是水稻、小麦等。
在本发明的一个实施方式中，本发明人构建GIF1基因的启动子连P-葡糖醛酸酶基因(GUS)的克隆，并转化水稻ZHll，观察GIF1启动子启动GUS报告基因和GIF1基因的组织特异性表达。
本发明的主要优点
揭示一种可指导目的基因在植物中组织特异性表达的启动子，所述的启动子对于定点地改良植物品质特别有用。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，如分子克隆实验手册(Molecular cloning: Alaboratory manual， 3rd ed. ， Sambrook等，Cold Spring Harbor Laboratory，2001)和植物分子生物学实验手册(Plant Molecular Biology-A LaboratoryMannual， Clark等，Springer-Verlag， 1997)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例l. GIFl基因的获得
本发明人从水稻中花ll(ZHll)诱变突变体库中，发现了一个水稻突变体，该突变体的种子的灌浆受到较为严重的影响，营养生长和野生型相比没有变化，但籽粒灌浆受到严重影响，种子千粒重减少15-30%，并且米质变差，本发明人将之命名为gifl (grain incomplete filling 1)， i兑明GIF1基因是一个重要的通过灌浆控制产量和米质的基因。
本发明人通过gifl突变体和珍汕97杂交得到基因定位群体。利用BSA(Bulked Segregant Analysis)分析法，以均匀分布在水稻12条染色体上的130对SSR引物对GIF1位点进行扫描，将GIF1位点初步定位在4号染色体长臂SRD5附近，最终将GIF1基因定位在caps-4和caps-8之间的32Kb中，经预测这段区域共包含三个基因，本发明人通过对突变体和野生型的DNA的测序，发现在突变体gif 1中有一个碱基的缺失(GIF1基因组DNA序列第4588位)。
通过对GIF1的精细定位，通过测序和功能验证，得到野生型GIF1的基因组(DNA)序列见SEQ ID NO: 3(包括启动子)；GIF1编码区的序列(cDNA序歹ij)见SEQ ID NO: 1; GIFl蛋白的序列见SEQ ID NO: 2。
当发生前述的突变(GIF1基因组DNA序列第4588位缺失)后，突变型不表达GIFl蛋白。
实施例2， GIFl启动子序列的获得
本发明人根据已经克隆的 GIFl 基因，在 NCBI(http:〃www. ncbi.nlm. nih. gov/)数据库搜索该基因的基因组区域，经过生物软件预测(http:〃www. cbs. dtu. dk/services/Promoter/)启动子，最终选择了2379 bp作为启动子序列。
实施例3.载体构建和农杆菌转化
本发明人构建GIFl基因的启动子连P-葡糖醛酸酶基因(GUS)的克隆，并转化水稻ZHll，观察GIFl启动子启动GUS报告基因和GIFl基因的组织特异性表达。
具体的构建方法如下
采用以下引物
正向弓l物tataagcttgatcggccatactcc (SEQ ID NO: 4)禾口反向弓l物taggatccctttgct,ctcaca.cttg (SEQ ID NO: 5)，以GIFl的基因组DNA为模板，PCR得到GIFl基因的启动子(其序列如图1所示)，并克隆载体pBI101(购自Clonet.ech公司，带有GUS)，再用EcoR I、Hind III酶切，回收片断，将该片断连入用相同酶切的pCAMBIA1300便得到了pCAMBIA1300+启动子+GUS的相应克隆(组织显色方法见Jeferenson, RA (1987)Plant Mol Biol Rep)。
结果见图2A-K，可知GUS基因在植株的根部、节间、种子的背腹部的微管束有特异性表达。
此外，采用RT-PCR的方法，从所述的野生型或突变型植株中抽提mRNA，通过RT-PCR分别扩增GIF1，将获得的扩增产物进行琼脂糖电泳检测。
在该实验中，用来扩增GIF1的引物为
Gif-F: cccgccggcgacgagcaccacat (SEQIDNO:6)禾口Gif-R: ccgccggcctgaacaccctgaaga (SEQ ID NO:7)
用来扩增ubi-l的引物为
ubi-l-F: gacggacgcaccctggctgactac (SEQ ID NO: 8)禾口ubi-l-R: tgctgccaattaccatataccacgac (SEQ ID NO: 9)。
结果见图3A-C，其中，图3A是突变体gifl和野生型的m脂A的RT-PCR检测结果；图3B是水稻不同组织中GIF1 mRNA的RT-PCR检测结果；图3C是不同时期(DAF)水稻穗部组织中GIF1 mRNA的RT-PCR检测结果。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。序列表
<110〉中国科学院上海生命科学研究院
<20〉 GIF1启动子及其应用
<130〉 092295
<160〉 9
<170〉 Patentln version 3.3
<210> 1
<211〉 1797
<212〉 DNA
<213〉 稻属(Oryza sativa L.)
<400> 1
atgggagttcUggtagtagggtcgcttgggcatggctggtccagctgctgctgctccag60
cagctcgccggagcgtcgcacgtcgtctacgacgacctcgagctgcaggcggctgctacc120
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<210> 2〈211〉 598<212> PRT
<213〉 稻属(&yza sa"ra )<■> 2
Met Gly Val Leu Gly Ser Arg Val Ala Trp Ala Trp Leu Val Gin Leu15 10 15
Leu Leu Leu Gin Gin Leu Ala Gly Ala Ser His Val Val Tyr Asp Asp20 25 30
Leu Glu Leu Gin Ala Ala Ala Thr Thr Ala Asp Gly Val Pro Pro Ser35 40 45
lie Val Asp Ser Glu Leu Arg Thr Gly Tyr His Phe Gin Pro Pro Lys50 55 60
Asn Trp lie Asn Asp Pro Asn Ala Pro Met Tyr Tyr Lys Gly Trp Tyr65 70 75 80
His Leu Phe Tyr Gin Tyr Asn Pro Lys Gly Ala Val 丁rp Gly Asn lie85 90 95
Val Trp Ala His Ser Val Ser Arg Asp Leu lie Asn Trp Val Ala Leu100 105 110
Pro Ala lie Glu Pro Ser lie Arg Ala Asp Lys Tyr Gly Cys Trp115 120 125
Ser Gly Ser Ala Thr Met Met Ala Asp Gly Thr Pro Val lie Met Tyr130 135 140
Thr Gly Val Asn Arg Pro Asp Val Asn Tyr Gin Val Gin Asn Val Ala145 150 155 160
Leu Pro Arg Asn Gly Ser Asp Pro Leu Leu Arg Glu Trp Val Lys Pro165 170 175
Gly His Asn Pro Val lie Val Pro Glu Gly Gly lie Asn Ala Thr Gin180 185 190
Phe Arg Asp Pro Thr Thr Ala Trp Arg Gly Ala Asp Gly His Trp Arg195 200 205
Leu Leu Val Gly Ser Leu Ala Gly Gin Ser Arg G〗y Val Ala Tyr Val210 215 220
Tyr Arg Ser Arg Asp Phe Arg Arg Trp Thr Arg Ala Ala Gin Pro Leu225 230 235 240
His Ser Ala Pro Thr Gly Met Trp Glu Cys Pro Asp Phe Tyr Pro Val245 250 255Thr Ala Asp Gly Arg Arg Glu Gly Val Asp Thr Ser Ser Ala Val Val 260 265 270
Asp Ala Ala Ala Ser Ala Arg Val Lys Tyr Val Leu Lys Asn Ser Leu 275 280 285
Asp Leu Arg Arg Tyr Asp Tyr Tyr Thr Val Gly Thr Tyr Asp Arg Lys 290 295 300
Ala Glu Arg Tyr Val Pro Asp Asp Pro Ala Gly Asp Glu His His lie 305 310 315 320
Arg Tyr Asp Tyr Gly Asn Phe Tyr Ala Ser Lys Thr Phe Tyr Asp Pro 325 330 335
Al;i Lys Arg Arg Arg lie Leu Trp Gly Trp Ala Asn Glu Ser Asp Thr 340 345 350
Ala Ala Asp Asp Val Ala Lys Gly Trp Ala Gly lie Gin Ala lie Pro 355 360 365
Arg Lys Val Trp l.eu Asp Pro Ser Gly Lys Gin Leu Leu Gin Trp Pro 370 375 380
lie Glu Glu Val Glu Arg Leu Arg Gly Lys Trp Pro Val lie Leu Lys 385 390 395 400
Asp Arg Val Val Lys Pro Gly Glu His Val Glu Val Thr Gly Leu Gin 405 410 415
Thr A]a Gin Ala Asp Val Glu Val Ser Phe Glu Val Gly Ser Leu Glu 420 425 430
Ala Ala Glu Arg Leu Asp Pro Ala Met Ala Tyr Asp A]a Gin Arg Leu 435 44.0 445
Cys Ser Ala Arg Gly Ala Asp Ala Arg Gly Gly Val Gly Pro Phe Gly 450 455 460
Leu Trp Val Leu Ala Ser Ala Gly Leu Glu Glu Lys Thr Ala Val Phe 465 470 475 480
Phe Arg Val Phe Arg Pro Ala Ala Arg Gly Gly Gly Ala Gly Lys Pro 485 490 495
Val Val Leu Met Cys Thr Asp Pro Thr Lys Ser Ser Arg Asn Pro Asn 500 505 510
Met Tyr Gin Pro Thr Phe Ala Gly Phe Val Asp Thr Asp lie Thr Asn 515 520 525Gly Lys lie Ser Leu Arg Ser Leu lie Asp Arg Ser Val Val Glu Ser 530 535 540
Phe Gly Ala Gly Gly Lys Ala Cys lie Leu Ser Arg Val Tyr Pro Ser 545 550 555 560
Uu Ala lie Gly Lys Asn Ala Arg Leu 丁yr Val Phe Asn Asn Gly Lys 565 570 575
Ala Glu lie Lys Val Ser Gin Leu Thr Ala Trp Glu Met Lys Lys Pro 580 585 590
Val Met Met Asn Gly Ala 595
<210> 3 <211〉 6840 <212> DNA
<213> 稻属(Oryza sativa L.)
〈400> 3
gcttgatcggccatactccgaagcctcctctgggtgagcctcctagtgtacgataggaca60
tatgaacactcaacccctgatct"t"Laac.at120
gatactctctccgtctcatactataaccggatatgatatattctagtacg180
atgaatcttg肌aaatgtatgtccagat,tcgtagtactaggatgtgtcacatctggtatt240
atgUggttttttataggacggaggtagtatataggtcccttaatttttt300
gaggtacactatagacaaMctatctattatattattaaaaaggagcctc360
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ttcatatagaaatacaatttagaaaaagctgaatttcggaat t aaaaaaatgaatattag480
a卿gg聊cteigagtccatatagaaatacaatttagaaatagttga^ittcggaattaa540
atattagaagagtccatata600
ctgatattcataaaga^tattagaagtagagtatagagtc660
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caatctttgaaatctc犯cgcttaggggaagtcttttccataatgcatct2280
cttcaccttcgcagtataaataggaccccctctcctctgctcctgctcatcctcctctcc2340
tcttctcgctctcacttcttgtgcccaagtgtgeLgagcaatgggagUcttggtagtagg2400
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gtcgtctacgacgacctcgagctgcaggcggctgctaccacagcggacggcgtgccgccg2520
tccatcgtcgactctgagctccggactgggtatcacttcc3gccacccaagaactggatc2580
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tgagtaatttatagtcagagttgaaaatatgtcatatcaaatgtttggca2880
3tt3Cgg3C3gC3tC3gtttttatgtccattttgtcgggt2940
cagctagtagagtcaacgttagcacccacgcggtcacgctgaaagaagtagcttcagaag3000
catctcacagtaaactactgagagtttgccatctctttttcatgaagctcacacttagtc3060
ccttcgaactgtactaccttgttctacttttcttgctaatgattcttgtg3120
gtcctaaccggcaattttcttgtgc肌ttatttggtgggggtgtgctctg3180
ctctacactgtgattgctgctgcgtcatcacccgcagatccgaacggtac3240
gtcgUUcccaccctttatgtcacgaatctctgtc tactagtagtagta3300
gtsgtagtactagaacttttatgccttgcaacttgcaatttcgttgtacggg卿ggact3360
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ctaccacggctgatgaccaca犯tcttaacttcctctcagaaagggaatt3540
tcaccttttt.ctcgtacgaaatgaagcatctatagttctataattaatcg3600
tgagcagtgtagagaaaaatgcaatgtacacgcgcgattaaactgaaatggtaattgatt3660
tcaatgtactact肌gactgaagatcatttcttgatttggtgaaactgaacgggtgcatg3720
cagcgccgatgtactacaaggggtggtaccatctgttctaccagtacaacccc犯gggcg3780
ccgtgtgggggaacatcgtgtgggcgcactcagtgtcacgtgacctcatcaactgggtgg3840
cgctc犯gccggccatcgagcccagcatcagggccgsc犯gtscggctgctggtcggggt3900
cggcgacgatgatggccgacgggacgccggtgatcatgtacaccggcgtcaaccgccccg3960
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gcgagtgggtgaagcccggccacaacccggtgatcgtgcccgagggcggcatcaacgcga4080
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tcggcagcctcgcggggcagtcccgcggcgtggcgtacgtgtaccggagcagggacttcc4200
ggcggtggacgcgcgcggcgcagccgctgcactcggcgcccacggggatgtgggagtgcc4260
cggacttctacccggtcaccgcggacggccgccgcgagggcgtcgacacctcgtccgccg4320
tcgtcgacgccgccgcctcggcgcgcgtcaagtacgtgctctcgacctgc4380
gccggtacgactactacaccgtcgg咖gtacgaccgg犯ggccgagcggtacgtgccgg4440
acgaccccgccggcgacgaggctacgactacggcaacttctacgcctcca4500
agacgttctacgacccggcgaagcgccgccgcatcctctggggatgggccaacgagtccg4560
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cctgactgcatacgtgcatgccatttacgtgtccaccatgcatgctgccatcttcagata4680
gtc犯tatcaccatatactccctccgttctaaaatgtttaacaccattgactttttagca4740
catgtttgaccgttcgtctttatgaaatatataaaactatatgtatacat4800aaaagtstatttaacaatgaatcaaatgat3tgaaaag￡L￡L c3aat犯tt3 cttaa^tttt4860
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gcagtggccaatcgaggaggtcgagaggctg,ggg卿tggccggtcattctcaagga5100
c兆ggtggtc犯gcc鄉ggaacacgtcgaggtgaccgggctac朋actgcacaggtatt5160
cctttttgcatctgtaattcttttttttaccccaaaagggca^ttcgaata5220
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gtttgUttgctgtgtcctggaccgatctttatcttatctggcacgcctgaagttgtgtc5340
cagtgtgcagtgcccactgactacgtgtgccgtgtcgctttcttctcgtc5400
cccttttaccatctcctgcacactttgctcgtacttaactgatctcactgattctctcgt5460
catccgcgcatgtcacgtacaacttccaggttgcagcgtgattagtgcacatatcactaa5520
gacactaaacg卿gatagtt肌ggagctcctttgttggt5580
gacgtacgtgagtaggagctgtgatctctgatagcaagtttaatagta_t3gctaactact5640
ggctctaaattatctatagtcaatctaataataaat tcatcctat犯aca5700
tatactaaataat taat ac atggttccacatgtcatacacatatgcatcttaaagtccgt5760
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catgcattctgtttggtggggtgcaggctgacgtggaggtgagcttcgaggtggggagcc5940
tggaggcggcggagcggctggacccggcgatggcgtacgacgcgcagcggctgtgcagcg6000
cgcggggcgccgacgcgaggggcggcgtggggccgttcggcctgtgggtgctcgcgtccg6060
cggggctggaggaga卿ccgccgtgttcttcagggtgttcaggccggcggcgcgcggcg6120
gcggcgccggcaagcccgtcgtgctcatgtgcaccgaccccaccaagtacgtgcggcttt6180
tgcactttatcggtgattgatcgcactticac肌taaacaaaatattgccttgactccgtt6240
tactgattttUggtatggtgcgtatgcgtgcaggtcatcgcgcaacccg犯catgtEicc:6300
agccgacgtttgcagggttcgttgacacggac3tcacc犯cgggaagatatctctgagga6360
gcctggtacgtaataggaccaaattatcggga犯a^ggfia￡iatgttgca_tgacggtatc6420
ccgttcggataaaat t atacctctta肌tattgtccgatacctaataaatattaattggc6480
tttg组gggatgatatctttgaggtatcgtctgatacctatctgatagg6540
tacctcataggtatcacctcgtccgaacgggttactgttttataacattcatctgga犯a6600
ggttcataaattgtagaatatgttttgatatcttgtgtctctcttgtgcag已tcgacagg6660
tcggttgttgagagcttcggggctggagga犯ggcgtgcatcctgtcgagggtgtacccg6720
tcgctggccatcggcaagaacgcgcgcctttacgttttcaataacgggaaggcgg卿tc6780
卿gtgtcgcagctcaccgcgtggg卿tgaagaagccggtcatgatgaatggagcctaa6840
〈210〉 4
<211〉 24
<212> DNA
<213〉 人T.序列
<220〉
<221〉 misc—feature
〈223〉 引物
<400〉 4
tataagcttg atcggccata ctcc 24
<210> 5
<211> 25
〈212〉 聽<213>人工序列 <220〉
<221> misc—feature
<223〉 引物
〈400> 5
taggatccct ttgctctcac acttg
<210〉 6
<211〉 23
<212> 腿
<213〉 人丁.序列
<220>
<221〉 misc—feature <223〉 引物
<400〉 6
cccgccggcg acgagcacca cat
<210> 7
<211〉 24
<212〉 DNA
〈213〉 人丁.序列
<220〉
<221> raise—feature <223〉 引物
〈400〉 7
ccgccggcct gaacaccctg aaga
<210〉 8
〈211〉 24
<212〉 謹
<213〉 人丁序列
〈220〉
<221〉 misc—feature 〈223〉 引物
〈400〉 8
gacggacgca ccctggctga ctac
〈210〉 9
〈211〉 26
<212〉 DNA
<213〉 人丁序歹lj
<220〉<221〉 raise—feature <223> 引物
<400〉 9
tgctgccaat taccatatac cacgac
权利要求
1.一种分离的多核苷酸，其选自下组(1)由SEQ ID NO3的1-2379位所示的序列构成的核苷酸序列；(2)具有SEQID NO3中1-2379位所示的核苷酸序列且能启动目的基因在植物中组织特异性表达的核苷酸序列；(3)SEQ ID NO3中1-2379位所示的核苷酸序列的片段，所述片段能启动目的基因在植物中组织特异性表达；(4)在严格条件下能够与(1)、(2)或(3)限定的核苷酸序列杂交且能启动目的基因在植物中组织特异性表达的核苷酸序列；(5)与(1)、(2)或(3)限定的核苷酸序列有70％、80％、85％、90％、95％以上相同性且能启动目的基因在植物中组织特异性表达的核苷酸序列；或(6)与(1)(5)任一项所限定的核苷酸序列互补的核苷酸序列。
2. 如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述目的基因选自编 码具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的作物籽粒灌浆蛋白、以及与作物淀粉转运、 积累相关的基因。
3. 如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，特异性表达所述目的基 因的组织是种子、根部和/或节间。
4. 权利要求1所述的多核苷酸作为启动植物组织特异性地表达目的基因 的启动子的用途。
5. —种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求1-3中任一项所述 的多核苷酸，作为启动子元件。
6. 如权利要求5所述的载体，其特征在于，所述的载体还含有与所述的核酸可操作地连接的目的基因。
7. 如权利要求6所述的载体，其特征在于，所述的目的基因选自编码 具有SEQ ID NO: 2氨基酸序列的作物籽粒灌浆蛋白，以及与作物淀粉转运、 积累相关的基因。
8. —种遗传工程化的宿主细胞，其特征在于，所述的细胞 含有权利要求5-7中任一项所述的载体；或其基因组中整合有外源的权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸。
9. 一种制备转基因植物的方法，其特征在于，所述的方法包括(a) 提供含有作为启动子元件的权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸以 及与所述多核苷酸可操作地连接的目的基因的构建物；(b) 将所述构建物导入植物细胞、组织或器官；(c) 选出导入了所述构建物或染色体中整合有所述构建物的植物细胞、组 织或器官；和(d) 使所述植物细胞、组织或器官再生成植株。
10. 用权利要求9所述的方法制得的转基因植物。
11. 含有权利要求1-3中任一项所述的多核苷酸或权利要求5-7中任一项 所述的载体的植物。
12. 如权利要求11所述的植物，其特征在于，所述植物为作物，优选为 禾本科植物，更优选所述的禾本科植物选自水稻、小麦、大麦、玉米、或高粱。
全文摘要
本发明公开了一种新的植物组织特异性表达启动子——GIF1启动子及其应用，所述的启动子分离自作物籽粒灌浆基因GIF1。本发明还公开了含有所述启动子序列的载体以及宿主细胞。本发明还公开了所述启动子的用途，所述启动子对于指导目的基因在植物中组织特异性表达，尤其是在植物的种子、节间和/或根部特异性表达，从而对改良植物(尤其是作物)品质特别有用。
文档编号C12N5/10GK101565702SQ200910138508
公开日2009年10月28日 申请日期2009年4月24日 优先权日2008年4月25日
发明者何祖华, 群 李, 王二涛 申请人:中国科学院上海生命科学研究院